Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(3): 155-160 (2018) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2018.33.3.155 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 Research Paper 제주산애기수영추출물의항염증효과 양은진 1, 현광희 2, 최해리 3, 김승영 3 *, 현창구 1 * Anti-inflammatory Activity of Rumex acetosella Extracts from Jeju Island Eun-Jin Yang 1, Kwang Hee Hyun 2, HaeRi Choi 3, Seung-Young Kim 3 *, and Chang-Gu Hyun 1 * Received: 5 July 2018 / Revised: 10 August 2018 / Accepted: 16 August 2018 2018 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The anti-inflammatory activity and ignorable toxicity of Rumex acetosella extract (J9) were investigated and confirmed by measuring the expression level of NO, PGE 2, and pro-inflammatory cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) in lipopolysaccharide (LPS)- and J9-treated in RAW264.7 macrophages. Relative to a LPS-only-treated group, the inhibition effect of J9 on the production of NO, PGE 2, pro-inflammatory cytokines was increasing across J9-treated samples but the cell viabilities stayed constant. We also exhibited that the inos expression level in the J9-treated samples was dose-dependently decreased relative to its untreated control and the elevated expression level of COX-2 seemed to be equal across samples treated with LPS alone or in combination with J9. Keywords: Rumex acetosella, anti-inflammatory, lipopolysaccharide, inos, COX-2 1 제주대학교화학 코스메틱스학과 1 Department of Chemistry and Cosmetics, Jeju National University, Jeju 63243 Korea Tel: +82-64-754-3542, Fax: +82-64-756-3561 e-mail: cghyun@jejunu.ac.kr 2 ( 주 ) 헬리오스 2 Helios Co., Ltd., Sanchundan Dong-gil 16, Jeju 63243 Korea 3 선문대학교제약생명공학과 3 Department of Pharmaceutical Engineering & Biotechnology, Sunmoon University, Chungnam 31460, Korea Tel: +82-41-530-2390, Fax: +82-41-530-2939 e-mail: sykim01@sunmoon.ac.kr 1. INTRODUCTION 피부의질환은유전적요인과환경적인요인, 피부장벽의이상, 면역학적이상, 식생활의변화등의영향으로급증하고있으며면역학적인이상에의한알레르기성염증반응은피부장벽을파괴시키고면역, 염증반응을항진시킨다 [1,2]. 이에따라알레르기를유발하는물질인히스타민분비억제나염증성 cytokine 들의발현을억제하는등기전의차단을통해서질환을예방할수있는천연물소재의개발이필요한실정이다 [3]. 염증반응은침입으로인한조직의손상에대해구조나기능을회복시킬수있는유익한체내방어기전이다. 그러나반복되는염증은조직손상의원인이되었고이에따라염증을일으키는물질을찾아제거하고자하는많은노력이있었다 [4]. 염증과정은다량의 nitric oxide (NO) 및 prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 등염증인자가 Nitric Oxide Synthase (NOS) 및 cyclooxygenase (COX) 에의해형성된다. NO 는혈압조절및응고, 면역기능등의역할을하며 NOS 에의해형성되는데 NOS 는 constitutive form (cnos) 과 inducible form (inos) 로나뉜다 [5,6]. cnos 는정상적인체내생리기능을담당하는반면 inos 는다양한조직에서염증유발물질인 lipopolysaccharide (LPS), 염증성 cytokine 인 tumor necrosis factor-α (TNFα), interleukin-1 (IL-1), interferon-γ (IFN-γ) 등에유도돼많은양의 NO 를생성하고세포독성이나조직손상과같은인체에유해한작용을나타낸다고보고되었다 [7]. 뿐만아니라 NO 가염증반응의원인이되거나 COX 의활성을촉진시켜서 prostaglandin 의합성을촉진하고염증반응을심화시킨다고알려져있다 [8]. PGE 2 는염증반응의매개체로서역할을하며대식세포에서 TNF-α, IL-1β, IL-8, IL-12 등의염증성 cytokine 생성을억제하는면역반응의조절자역할을한다는것
156 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(3): 155-160 (2018) 이많은연구를통해입증되었다 [9]. PGE 2 의합성은 phospholipid A2 의효소작용을통해 arachidonic acid 가생성되고이 arachidonic acid 는효소에의해서 prostaglandin G 2, 그리고다시 prostaglandin H 2 가되는데 COX 에의해촉진되는과정이다. COX 의 isoenzyme 중에서 COX-1 은혈소판응집, 위점막보호등생리적기능을담당하며 COX-2 는염증등자극에의해서발현되고 COX-2 로인해만들어진 prostaglandin 이염증반응에관여한다고보고되어진다 [10]. Cytokine 은 T 세포, β 세포, 대식세포등면역세포로부터분비되는단백질로서세포간신호전달, 행동조절, 면역반응조절에관여하며 [11], 이면역세포들은분비된 cytokine 의종류에따라증가나감소를인식하며면역기능을수행한다 [12]. 또한표적이되는세포로신호를전달하며면역반응을활성화하는데중요한역할을알려져있다 [13]. T 림프구로부터분비되는 cytokine 중 TNF-α, IL-1β, IL-6 등의전염증성 cytokine 은과다하게분비되면항염증성 cytokine 들과의불균형이초래되고이로인해숙주의면역기능이떨어지게된다고보고된바있다 [14]. 애기수영 (Rumex acetosella) 은유럽이원산인마디풀과에속하는자웅이주식물이며, 종자로번식할뿐만아니라지하뿌리로도번식한다. 한방에서는애기수영의뿌리를소산모라고하며, 청열양혈작용과항암, 폐결핵, 객혈등에사용했으며, 현재는암치료를위한대체약품인 ESSIAC 의한성분으로사용되고있다 [15]. 애기수영은주로언덕이많은초원이나계곡에서자라며다양한플라보노이드, 페놀화합물및테르페노이드가포함되어전통적으로간, 소화기능, 장기능및신장질환을치료하는데사용되었다 [16]. 그러나이러한효능에도불구하고아직까지애기수영의항염증효능에대해서는알려진바가없다. 따라서본연구에서는애기수영추출물을이용하여 RAW 264.7 cell 에서발생되는염증반응에대한억제효과및기능성소재로써의가능성을검토하고자하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. Rumex acetosella 추출물제조애기수영은제주도에서 2016 년에채집하였으며, 애기수영의잎과가지를 70% EtOH 에서 24 시간동안실온추출하여사용되었다. 애기수영추출액 (9) 은필터로여과한뒤에 evaporator 를사용해서농축하였고, 농축한추출물은 -20 o C 에서동결건조하여 PBS (phosphate buffer saline) 에용해하였으며이를이용해실험을진행하였다. 2.2. 세포배양 Murine macrophage cell line 인 RAW 264.7 세포는 ATCC (American Type Culture Collection) 에서분양받아 100 units/ml penicillin-streptomycin 과 10% fetal bovine serum (FBS) 이함유된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를사용해서 37 o C, 5% CO 2 incubator 에서 3 일주기로계대배양하여사용하였다. 2.3. 세포독성측정 MTT assay 는염증세포인 RAW 264.7 cell 을 10% FBS 가첨가된 DMEM 배지를사용하여 3.0 10 5 cell/ml 로 well plate 에분주하고 24 시간, 37 o C, 5% CO 2 incubator 에서전배양하였다. 이후시료와 LPS (1 μg/ml) 를동시에처리하고 24 시간배양하였다. 다음으로 MTT 용액을첨가하고 37 o C 에서 4 시간동안반응시킨다음 MTT 용액을제거하였다. 여기에 DMSO 를첨가하여살아있는세포와의반응으로생긴침전물을용해시킨다음, 이를 96 well plate 로옮겨 ELISA reader 를사용해 570 nm 에서흡광도를측정하였다. 시료군에대한평균흡광도값을구하였으며, 대조군의흡광도값과비교하여세포독성을평가하였다. 2.4. Nitric oxide (NO) 생성억제활성측정 RAW 264.7 cell을 10% FBS가첨가된 DMEM 배지를이용하여 3.0 10 5 cell/ml로 24시간전배양하였다. 이후시료와 LPS (1 μg/ml) 를동시처리하여 24시간배양하고, 세포배양상등액 100 ul와 Griess 시약 100 ul를혼합하여 10 분간실온암소에서반응시킨후 540 nm에서 ELISA reader를이용하여흡광도를측정하였다. 생성된 NO의양은 Griess 시약 [1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) - phosphoric acid] 을이용하여세포배양액중에존재하는 NO 2 의형태로측정하였다. standard 곡선은 sodium nitrite (NaNO 2 ) 를 serial dilution하여얻었다. 2.5. Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 생성억제활성측정 RAW 264.7 cell (3.0 10 5 cell/ml) 에시료와 LPS (1 μg/ml) 를동시처리하여 24 시간동안배양하였다. 이후배양배지를 12,000 rpm 에서 3 분간원심분리하여얻어진상층액의 PGE 2 함량을측정하였다. 모든시료는정량하기전까지냉동보관하였다 (-20 o C). PGE 2 는 mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 를사용하여정량하였고 standard 에대한표준곡선의 r 2 값은 0.99 이상이었다. 2.6. 전염증성 cytokines (TNF-α, IL-6, IL-1β) 생성억제활성측정 RAW264.7 cells 은 3.0 10 5 cell/ml 로조절한후전배양하고시료와 LPS (1 μg/ml) 를동시에처리하여 24 시간배양하였다. 이후배양배지를 12,000 rpm 에서 3 분간원심분리하여얻어진상층액의전염증성 cytokine 생성함량을측정하였다. 모든시료는정량전까지냉동보관하였다 (-20 o C). 전염증성 cytokine 은 mouse enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 를사용하여정량하였다.
제주산애기수영추출물의항염증효과 157 2.7. Western blot analysis RAW 264.7 cell (1.0 10 6 cell/ml) 을 18시간전배양후시료와 LPS (1 μg/ml) 를동시처리하여 24시간배양하였다. 이후 PBS를사용하여 cell을 2회 washing하고 lysis buffer [1 RIPA (Upstate Cell Signaling Solution, Lake Placid, NY, USA), 1 mm pheylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), 1 mm Na 3 VO 4, 1 mm NaF, 1 μg/ml aprotinin, 1 μg/ml pepstain, and 1 μg/ml leupeptin] 를이용하여 1시간동안 lysis시킨다음원심분리하여 (15,000 rpm, 15 min) 단백질상등액을분리하였다. 단백질의농도는 BSA kit (Bio-Rad, USA) 를사용하여정량하였다. 정량한단백질을 8-12% 의 polyacrylamaide gel에전기영동하고 Poly-vinylidene difluoride (PVDF) membrane (Milipore, USA) 에 200mA, 2시간동안전이시켰다. 단백질전이가된 membrane을 5% 탈지분유를포함한 0.05% Tween 20/Trisbuffered saline (0.05% T/TBS) 에첨가하고상온에서 blocking 시킨후, 1차항체와반응시켰다. 1차항체반응은 inos antibody (1:5000, Calbiochem, USA), COX-2 antibody (1:1000, BD Biosciences Pharmingen, USA), β-actin antibody (1:10,000, Sigma, USA) 를이용하여 4 o C에서 24시간반응시켰다. 이후 T/ TBS 용액을사용해 4회세척한다음 2차항체 (Jackson ImmunoResearch, USA) 를 1:5,000 또는 1:10,000으로희석하여상온 1시간반응후 T/TBS 용액으로 3회세척하였다. 단백질은 ECL kit (Bio-Rad, USA) 를사용하여 imaging densitometer (model GS-700, Bio-rad, USA) 를통해측정하였다. 2.8. 통계처리결과는 mean ± S.D. 으로나타냈으며 student's t-test 로통계학적유의성을검증하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 애기수영 (J9) 추출물의세포독성측정 RAW 264.7 cell 에 LPS (1 ug/ml) 를단독또는 J9 추출물 ( 각각 50, 100, 200 μg/ml) 과동시처리하여 24 시간배양한후 MTT assay 를이용하여세포독성을확인하였다 (Fig. 1). 그결과 J9 추출물은모든농도에서무처리군과비교시유의적인차이를보이지않아세포의생존율에영향을주지않음을확인하였다. 따라서이결과를바탕으로동일한농도범위에서다음실험을진행하였다. 3.2. Rumex acetosella 추출물의 Nitric oxide (NO) 생성억제활성 Lipopolysaccharide (LPS) 는면역세포에작용하여 L-arginine 으로부터 inos 의작용에의하여 NO 생성을증가시킨다. NO 의생성이과도하게많아지면만성염증에관여하기때문에만성염증을조절하기위한 NO 생합성억제제의개발에관심이높아지고있다 [17]. 염증을유발하는데원인이되는활성산소 Nitric oxide (NO) 의생성에 J9 추출물이어떠한영향을 Fig. 1. Effect of J9 on nitric oxide production in LPS-stimulated RAW264.7 cells. The cells were stimulated with 1 ug/ml of LPS only or with LPS plus various concentrations (50, 100, 200 ug/ml) of J9 for 24 h. Nitric oxide production was determined by the Griess reagent method. Cell viability was determined from the 24h culture of cells stimulated with LPS (1 ug/ml) in the presence of J9. The **p<0.001 versus LPS alone. IC 50 =84.7 ug/ml. 미치는지에대해서조사하였다 (Fig. 1). RAW 264.7 cell 에 J9 추출물 (50, 100, 200 μg/ml) 과 LPS (1 μg/ml) 를동시처리하여 24 시간배양하였고, NO 의생성된양은 Griess 시약을이용하여세포배양액에존재하는 NO 2 - 의형태를측정하였다. 측정결과, LPS 를단독으로처리한군은 NO 생성을유도하였고, J9 추출물은 LPS 단독처리군과비교했을시농도의존적으로 NO 의생성량이감소하는것으로나타났다. 특히 200 μg/ml 의농도에서는 80% 이상으로 NO 의생성량을억제하는것으로확인되었다. 따라서 J9 추출물은대식세포의 NO 의생성을감소시킴으로써염증발생에의한질환유발을제어할수있는것으로생각된다. 3.3. Prostaglandin E 2 (PGE 2 ) 생성억제활성 COX-2 유래 PGE 2 는면역관련세포의활성을유도해서염증반응을일으키며 Th2 세포의활성을유도해염증성 cytokine 을과도하게생성하는원인이된다 [18]. J9 추출물를다양한농도로처리하여 RAW264.7 세포의 PGE 2 생성억제활성을측정한결과, LPS 를처리하여염증을유발한군과비교했을때 J9 추출물각각의처리농도 (50, 100, 200 ug/ml) 에서농도의존적으로 PGE 2 의생성억제효과가있는것을확인할수있었다 (Fig. 2). 특히 200 μg/ml 농도로처리시 J9 추출물의활성이 95% 로 PGE 2 생성을억제하는것으로나타났다. 따라서 J9 추출물은 LPS 로인해증가된 PGE 2 생성을감소시킴으로써항염증효과를나타내는것으로확인하였다. 3.4. 전염증성 cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α) 생성억제활성 Cytokine 은면역세포가분비하는단백질로서면역세포의활성, 증식및분화를조절하여염증반응을매개하는인자로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 는염증반응을조절하는대표적 pro-
158 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 33(3): 155-160 (2018) Fig. 2. Effect of J9 on PGE 2 production in LPS-stimulated RAW for 24 hr. PGE 2 production was determined by ELISA method. The **p<0.001 versus LPS alone. IC 50 =58 ug/ml. Fig. 4. Effect of J9 on IL-6 production in LPS-stimulated RAW for 24 hr. IL-6 production was determined by ELISA method. The **p<0.001 versus LPS alone. IC 50 =16.3 ug/ml. Fig. 3. Effect of J9 on IL-1β production in LPS-stimulated RAW for 24 hr. IL-1β production was determined by ELISA method. The **p<0.001 versus LPS alone. IC 50 =43.7 ug/ml. Fig. 5. Effect of J9 on TNF-α production in LPS-stimulated RAW for 24 hr. TNF-α production was determined by ELISA method. The **p<0.001 versus LPS alone. inflammatory cytokine 으로알려져있다 [19]. 따라서본실험에서는 LPS 로자극한 RAW 264.7 세포에 J9 추출물을처리한후 IL-1β, IL-6, TNF-α 의생성량을측정함으로써 J9 추출물에의한염증매개성 cytokaine 의생성억제효과를검토하였다 (Figs. 3, 4, 5). RAW264.7 세포는 LPS 에의해 IL-1β, IL-6, TNF-α 의생성량이유의적으로증가하였지만, J9 추출물 (50, 100, 200 μg/ml) 처리군에서는농도의존적으로억제되는것을확인하였다. 특히, J9 추출물처리군의 200 μg/ml 농도에서는 IL-1β 와 IL-6 분비량이각각 98% 로상당히억제됨을확인하였다 (Figs. 3, 4). J9 추출물에대한 TNF-α 의분비량또한농도의존적으로억제되는것을확인하였으며 200 μg/ml 에서약 54% 이상의억제효과를나타내었다 (Fig. 5). 따라서 J9 추출물은염증성 cytokine 의분비억제를통해항염증효과를나타내는것임을시사했다. 3.5. Western blot 을통한 inos 및 COX-2 단백질발현억제효과측정 NF-kB 는 LPS 에의해자극을받게되면핵내로이동하여 COX-2 및 inos 와같은여러염증효소의전사를활성화한다. 또한 inos 에서유래한 NO 와 COX-2 에의해합성된 PGE 2 는급성및만성염증의발변기전에중추적인역할을한다 [20]. 따라서본실험에서는 J9 추출물에의한염증의억제가어떠한경로에의한것인지확인하기위해 RAW264.7 세포를 LPS 로자극한후 J9 추출물을농도별로처리하여각신호전달물질의발현정도를관찰하였다. 실험결과, 무첨가군과비교하여 LPS (1 ug/ml) 에의해증가된 inos 단백질발현양이 J9 추출물을처리했을때농도의존적으로감소한것을확인하였다 (Fig. 6). 또한 LPS 에의해증가된 COX-2 의발현양은 J9 추출물을처리했을때농도의존적으로감소시켰다 (Fig. 7). 이로써 J9 추출물에의한염증억제가 NF-kB 의신호전달과정을통해이루어지고있음을확인하였으며, 이러한결과는
제주산애기수영추출물의항염증효과 159 학협력선도대학 (LINC+) 육성사업의지원을받아수행된연구입니다. Fig. 6. Effect of J9 on the protein level of inos in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (6.0 10 5 cell/ml) stimulated with LPS (1 µg/ml) in the presence of J9 (50, 100, 200 ug/ml) for 24 hr. Whole-cell lysates (30 µg) were prepared and the protein level was subjected to 10% SDS-PAGE, and expression of inos and β-actin were determined by western blotting. The β-actin as a loading control. Fig. 7. Effect of J9 on the protein level of COX-2 in LPS-stimulated RAW 264.7 cells. RAW 264.7 cells (6.0 10 5 cell/ml) stimulated with LPS (1 µg/ml) in the presence of J9 (50, 100, 200 ug/ml) for 24 hr. Whole-cell lysates (30 µg) were prepared and the protein level was subjected to 10% SDS-PAGE, and expression of COX-2 and β-actin were determined by western blotting. The β-actin as a loading control. 염증성 cytokine, NO, COX-2, inos 의발현을효과적으로감소시켜항염증효과를나타내는것임을시사하였다. 4. CONCLUSION 본연구에서는 J9 추출물의항염효과를확인하기위해 Nitric oxide (NO) 저해활성, Prostaglandin E 2 생성저해활성과전염증성 cytokines 생성억제, inos 및 COX-2 단백질발현억제효과를측정하였다. J9 추출물은 RAW264.7 세포에대하여세포독성을나타내지않았고, LPS 자극에의한 NO 생성을농도의존적으로억제했다. 또한, PGE 2 생성억제활성측정결과 LPS 자극으로분비된 PGE 2 생성을억제하였으며전염증성 cytokine 인 IL-1β, IL-6, TNF-α 의분비량을농도의존적으로억제하였다. 대표적인염증관련신호전달경로인 NF-kB 관련유전자의발현을검토한결과 J9 추출물에의해 inos 및 COX-2 의발현이유의적으로억제되었다. 따라서 J9 추출물은천연항염증제후보물질로서의가능성을제시하는결과로사료된다. Acknowledgements 이논문은 2017 년교육부와한국연구재단의사회맞춤형산 REFERENCES 1. Lee, E. J., E. Y. Whang, K. Whang, I. S. Lee, and S. A. Yang (2009) Anti-allergic effect of Zizania latifolia Turcz extracts. Korean J. Food Sci. Tecnol. 41: 717-721. 2. An, S. G. (2003) Atopic dermatitis and moisturizer. Update in Dermatology for Dermatologists 1: 21-25. 3. Park, J. A. and M. O. Choi (2011) Antimicrobial activity and antiinflammation effect to the human skin pathogens by the Rumex crispus L. root extracts. Journal of Investigative Cosmetology 9: 1-16. 4. Ji, J. D., Y. H. Lee, and G. G. Song (2004) Prostaglandin E 2 (PGE 2 ): Roles in immune responses and inflammation. Journal of Rheumatic Diseases 11: 307-316. 5. Garthwaite, J. (2010) New insight into the functioning of nitric oxide receptive guanylyl cyclase: Physiological and pharmacological implications. Mol. Cell Biochem. 334: 221-232. 6. Crane, B. R., A. S. Arvai, D. K. Ghosh, C. Wu, E. D. Getzoff, D. J. Stuehr, and J. A. Tainer (1998) Structure of nitric oxide synthase oxygenase dimer with pterin and substrate. Science 279: 2121-2126. 7. Forstermann. U. and W. C. Sessa (2012) Nitric oxide synthases: Regulation and function. Eur. Heart J. 33: 829-837. 8. Lee, H. J. (2014) Inhibitory effect of galangin from alpinia officinarum on lipopolysaccharide induced nitric oxide synthesis in RAW 264.7 macrophages. Korean J. Food Sci. Technol. 46: 511-515. 9. Harris, S. G., J. Padilla, L. Koumas, D. Ray, and R. P. Phipps (2002) Prostaglandins as modulators of immunity. Trends Immunol. 23: 144-150. 10. Turini, M. E. and R. N. DuBois (2002) Cyclooxygenase-2: A therapeutic target. Annu Rev Med. 53: 35-57. 11. Lee, S. B. (2014) Effects of middle-high intensity aerobic exercise on insulin resistance, immune function & inflammatory cytokine. Journal of Leisure & Wellness 9: 231-242. 12. Dissing-Olesen, L., R. Ladeby, H. H. Nielsen, H. Toft-Hansen, I. Dalmau, and B. (2007) Finsen axonal lesion-induced microglial proliferation and microglial cluster formation in the mouse. Neuroscience 149: 112-122. 13. Seo, M. J., B. W. Kang, J. U. Park, M. J. Kim, H. H. Lee, E. J. Ryu, W. H. Joo, K. H. Kim, and Y. K. Jeong (2013) Effect of black garlic extract on cytokine generation of mouse spleen cells. Journal of Life Science 23: 63-68. 14. Park, H. G. and W. L. Lee (2013) Effects of aerobic exercise training and quercetin supplementation with low fat diet on inflammation and Th1, Th2 cytokine production in splenocytes in obese mice. The Korea Journal of Sports Science 22: 1223-1233. 15. Choe, S. G., B. Y. Hwang, M. S. Kim, G. J. Oh, K. S. Lee, and J. S. Ro (1998) Chemical components of Rumex acetosella L. Korean Journal of Pharmacognosy 29: 209-216. 16. Baig, H., D. Ahmed, S. Zara, M. I. Aujla, and M. N. Asghar (2011) In vitro evaluation of antioxidant properties of different solvent ext-
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