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Polymer(Korea), Vol. 41, No. 6, pp. 962-966 (2017) https://doi.org/10.7317/pk.2017.41.6.962 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) 콘드로이틴설페이트가함유된젤란검하이드로젤에서의연골재생연구 최일남 김창현 송정은 백종선 전성현 전하얀 이순영 강길선 전북대학교, BIN 융합공학과, 고분자나노공학과, 고분자융합소재연구소 (2017 년 4 월 4 일접수, 2017 년 5 월 13 일수정, 2017 년 7 월 11 일채택 ) A Comprehensive Study on Cartilage Regeneration Using Gellan-gum/Chondroitin Sulfate Hybrid Hydrogels Ilnam Choi, Changhyun Kim, Jeong Eun Song, Jongseon Baek, Sung Hyun Jeon, HaYan Jeon, Soon Young Lee, and Gilson Khang Department of BIN Convergence Tech & Dept. of PolymerNanoSci Tech, Chonbuk National University, 567 Baekje-daero, Jeonju 54898, Korea (Received April 4, 2017; Revised May 13, 2017; Accepted July 11, 2017) 초록 : 젤란검 (Gellan gum, GG) 은람노오스, 글루콘산및포도당으로구성된헤테로다당류로서에로디속의수초로부터추출하며, 무색의무미, 무취한분말로서생체적합성이좋아현대조직공학에주로이용되는생체재료이다. 콘드로이틴설페이트 (CS) 는골관절염 (OA) 의임상증상을천천히완화를유도시키고, 이런효과들은치료후에도장기간지속시킨다고알려져있다. 실질적으로, 동물실험과임상시험에서관절염증을회복, 지연혹은안정화할수있어서장기치료에서증상완화를제공하는구조개선관절염약으로 CS 의효능이입증되고있다. 따라서본연구에서는연골재생에있어, CS 를함유한 GG 하이드로젤의효과를확인하고자 in vitro 환경에서실험을진행하였다. CS 의함량은젤란검중량의 10, 20, 30 wt% 로설정하여하이드로젤형태로제조하였고, 지지체의특성분석을위해압축강도, SEM 을평가하였다. 세포부착과증식률은 MTT, 유전자발현은 RT-PCR 을통해확인하였다. 그결과, 20% 의 CS/ GG 가세포부착및증식률, 유전자발현이다른군에비해가장높았다. 그에따라 20% CS/GG 는연골재생을위한하이드로젤로응용가능성이기대된다. Abstract: Gellan gum is a heterosaccharide composed of rhamnoose, glucuronic acid and glucose. It is a colorless tasteless odorless powder extracted from aquatic plants in Erodium. It is a biomaterial mainly used in modern tissue engineering. The chondroitin sulfate (CS) has been found to induce slow, sustained relief for osteoarthritis (OA) patients worldwide. It has been also proven a structurally improved arthritis drug that can relieve, delay or stabilize joint inflammation in many animal experiments and clinical trials, thus providing symptom relief in long-term. In this study, we investigated the effect of gellan gum scaffolds containing chondroitin for treating osteoarthritis in vitro. The content of chondroitin hybride in the scaffolds was set to 10, 20 and 30%, and scaffolds was prepared by hydrogel type. SEM was performed to characterize the scaffolds. The cell adhesion and proliferation rate were confirmed by MTT assay and gene expression by RT-PCR. In addition, the compressive strength test were perfomed to confirm mechanical strength. Overall results showed that 20% CS/GG scaffolds was best suitable for adhesion, proliferation rate and gene expression and can be potentially applied for cartilage regeneration. Keywords: chondroitin sulfate, gellan gum, hydrogel, scaffold. 서 조직공학은장기결함및조직재생과같은문제들을해결하기위해새로운방법을제시해왔으며, 오늘날조직의여 론 To whom correspondence should be addressed. E-mail: gskhang@chonbuk.ac.kr 2017 The Polymer Society of Korea. All rights reserved. 러문제들을해결하기위한도구로연구되어왔다. 연골은조직공학분야에서가장많이연구된조직중하나로서퇴행하거나외상을입으면정상적인일상생활에많은제약이따르고, 자가치유의제한된수복능력때문에매우중요한연구주제로부상되고있다. 연골은손상시약물복용, 관절내주사, 물리치료, 수술등으로치료를하지만, 큰결함이발생될경우, 치료가쉽지않아새로운방법을연구하는추세이다. 그중효과적인방 962

콘드로이틴설페이트가함유된젤란검하이드로젤에서의연골재생연구 963 법으로대두되고있는방법중하나로, 체외에서연골세포를배양한후지지체에세포부착을유도시켜, 증식환경을만들어주고, 이를체내로주입하는방법이있다. 1,2 연골재생재료로가장많이사용되는천연고분자로서는콜라겐, 히알루론산, 알지네이트, 젤라틴, 그리고젤란검등이있다. 3-6 본실험에사용된고분자재료는젤란검 (gellan gum, GG) 으로, 글루콘산, 람노오스, 그리고포도당 (1:1:2) 이규칙적으로배열된복합다당류로, 무취, 무색, 내열성, 그리고내효소성 7,8 등이우수하다. 또한이온첨가및 ph 조절등을통해하이드로젤의기계적물성을조절할수있으며, 세포독성또한없어연골분야에서생체재료로다양하게연구되고있다. 9 콘드로이틴설페이트 (Chondroitin sulfate, CS) 는 D- glucuronic acid, N-acetyl-D-galactosamine 과황산으로결합된점질성다당류 ( 뮤코다당, mucopolysaccharide) 이다. CS 는동물결합조직의기질, 장기, 체액등에분포하며, 10 성인병의억제및예방, 항산화효과, 혈액응고작용, 동맥경화억제및예방, 관절조직보호, 그리고세균감염억제작용등 11 다양한효과가있다고알려져있다. 따라서본실험은연골재생적측면에서좋은효과를가진 CS 와 GG 를비율별로혼합하여, 하이드로젤로제조한후연골세포를부착시켜시간이지남에따른연골세포의양상을알아보고자하였다. 실 시약및재료. 젤란검 (Gelzan TM CM(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, 평균분자량 1000000 g/mole, G1910)), 콘드로이틴설페이트 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 를사용하였다. 그외이번실험에사용된모든화학약품및유기용매들은 HPLC 등급을사용하였다. 젤란검하이드로젤제조. 열교반기를이용해 3 차증류수 40 ml 에젤란검분말을 2wt% 농도로넣어준후 90 o C 이상의온도로가열하여, 분말이완전히용해될때까지교반하였다. 그후 CS 는젤란검양의각각 0, 10, 20, 및 30% 의농도로넣어준후교반시키고, 가교제로 0.03% 의 CaCl 2 를첨가하였다. 가열된 CS/GG 수용액은패트리디쉬에분주하여굳히고, 바이옵시펀치 (biopsy punch) 를이용하여, 직경 8 mm, 높 험 Figure 1. Fabricated CS/GG hydrogels. 이 4mm 의하이드로젤형태의젤란검을제조하였다 (Figure 1). 그리고젤란검의다공및표면거침도분석을위해제조된하이드로젤은냉장 4 시간, 냉동 4 시간후에 80 o C 에서 24 시간동안급랭시킨후동결건조기를이용하여 2 일동안진공상태에서동결건조하여스펀지형태로제조하였다. 압축강도측정. 각각의 CS 함량에따른 CS/GG 하이드로젤의압축강도를측정하기위해만능물성측정기 (TMS-Pro, Food Technology Corporation, Sterling, USA) 를사용하였다. 만능물성측정기의설정값으로측정거리는 2mm, 측정속도는 20 mm/sec, 측정힘은 1 N 으로하였다. SEM 관찰. CS/GG 하이드로젤의다공및지지체의표면거침도를확인하기위해 SEM 관찰을실시하였다. 지지체를아르곤가스가충전된플라즈마스퍼터 (Emscope, Model SC500K, UK) 를이용하여백금으로코팅하였고, 주사전자현미경 (Hitachi Co, Model S-2250N, Japan) 을이용하여지지체표면을관찰하였다. 12-15 연골세포분리및배양. 연골세포는 4 주된암컷뉴질랜드화이트토끼 (Hanil laboratory animal center, Wanju, Korea) 의무릎관절에서분리하여추출하였다. 토끼를희생시킨후뒷다리털을제거하고, 멸균된수술용칼로무릎관절을절개해연골부위만취한다음바로인산완충용액 (PBS, ph 7.4, Gibco, NY, USA) 으로 3 번이상세척하였다. 그리고 0.25 wt% 의콜라게네이즈 A 형 (Roche, Applied Science, Germany) 용액으로 24 시간동안인큐베이터 (37 o C, 5% CO 2 ) 에서조직을용해시켰다. 용해가완료된조직을 70 µm 의나일론매쉬로거른다음원심분리하여 Dulbecco s modified eagle medium(dmem, Gibco) 과 F-12 영양배지혼합액 (Ham s F- 12, Gibco), 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco) 및 1% 항생제 (100 units/ml 페니실린과 100 µg/ml 스트랩토마이신 ) 와 200 mm L- 글루타민 (Gibco), 50 µg/ml 아스코르빈산 (Sigma), 15 mm HEPES buffer 1 M(Gibco) 로혼합된배양액을사용하여세포배양플라스크에분주하고 37 o C, 5% CO 2 조건하에배양하였다. 배양액은 3 일에 1 번교체해주었다. 세포증식률측정. 연골세포가파종된 CS/GG 에서의증식능력을측정하기위해 MTT(3-[4,5- 디메틸치아졸 -2- 일 ]-2,5- 디페닐테트라졸리움브로마이드 ) 분석을각각 1, 4, 7, 14, 21 일째시행하였다. 각지지체에, 1.9 10 5 세포 / 하이드로젤의농도로연골세포를파종하고, 상기에사용된동일한배양액으로정적배양하였다 (n=3). 그후 MTT 용액 (5 mg/ml stock in PBS, Sigma) 을 100 µl 씩넣고 4 시간동안인큐베이터에서 37 o C 조건으로배양을한후보라색결정이형성되면하이드로젤을 24-well plate 에옮겨디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma) 용액을 1mL 씩넣어결정이완전히녹을때까지용해한후 96-well plate 에용해된용액을각각 100 µl 씩분주하여 Microplate Reader(Thermolex, Molecular Device Co. USA) 570 nm 의흡광도로세포증식을측정하였다. Polymer(Korea), Vol. 41, No. 6, 2017

964 최일남 김창현 송정은 백종선 전성현 전하얀 이순영 강길선 mrna 발현도확인. 비율별로제작한 CS/GG 하이드로젤에파종된연골세포의특정 mrna 발현여부를확인하기위해연골세포를 1, 2 및 3주배양시킨후역전사효소를사용함으로써 RNA를증폭시켜 RT-PCR 분석을실행하였다. 연골세포파종후 7, 14, 21일째에 CS/GG 하이드로젤에 1mL 의 Trizol(Invitrogen TM Life Technologies Co., Groningen, Netherlands) 을첨가시켜 5분동안인큐베이션시킨후 1.5 ml EP 튜브에넣고, 0.2 ml의클로로포름 (Sigma) 을첨가시킨다음원심분리 (4 o C, 12,000 rpm, 15분 ) 를하여 mrna를분리하였다. 분리된 mrna는 bio spectrometer(eppendorf, Hamburg, Germany) 를이용하여정확한 mrna 값을정량한후, Xenotech Oligo(dT)22-25 프라이머 (Xenotech, Deajeon, Korea) reverse type, forward type을각각 1 µl씩넣어주고, free water(invitrogen TM Life Technologies Co., Groningen, Netherlands) 로처리하여 authorized thermal cycler(tp600, Takara Bio Inc., Japan) 를통해 cdna로역전사하였다. 역전사시킨 cdna를 GAPDH, aggrecan, collagen Type II 및 collagen Type I PCR을수행하였다. PCR로써증폭된 DNA 를 1%(w/v) 아가로스겔에전기영동을한후, 상대적발현을 EtBr(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 을넣어시각화하였고, 300 nm 자외선조사기를사용하여 aggrecan, GAPDH, collagen Type II 및 collagen Type I cdna밴드의발현정도를확인하였다. 통계학적분석. 모든실험에적용된통계학적분석은 student s t-test를시행하였으며, p값이 0.05 미만일경우만통계적으로유의한것으로하였다 (*p<0.05, **p<0.01, ***p <0.001). 또한모든실험에정확성을높이기위해 3번이상에걸쳐진행하였다 (n=3). 결과및토론 압축강도분석. 각각 0, 10, 20, 30% 함량별로제조한 CS/ GG 하이드로젤의기계적물성을관찰하기위해압축강도를실시하였다. Figure 2 는 CS/GG 에압력을가했을때나타나는그래프이다. 20 mm/min 의속도로 1N 의압력을가하여압축시켰을때, 하이드로젤의균열파괴시의하중을지지체의단면적으로나누었다. 그결과 CS 를첨가하지않은하이드로젤에서 5N/mm 2 이상의압축강도가나타났고, 첨가한그룹에서는압축강도가감소하는경향성을나타냈다. 이는젤란검 - 젤란검결합사이에 CS 가결합되어, 기존젤란검 - 젤란검결합력이가지는기계적강도에영향을미치는것으로사료된다. 16 압축강도기기분석은총 5 번반복실험하여데이터값의재현성을높였다. SEM 관찰. Figure 3 은 CS/GG 단면을 SEM 으로관찰한것이다. 관찰결과 4 개의지지체각각서로다른다공의크기와거침도를확인할수있었다. 다공크기는 Image J 를통해 Figure 2. Compressive strength of CS/GG hydrogels (**p<0.01, ***p<0.001). Figure 3. SEM microphotographs of 0, 10, 20 and 30% CS/GG hydrogels (magnification with 100, scale bar=500 μm). 서측정하였으며, 0, 10, 20 및 30% CS/GG 의다공크기는 84.66±23.10, 64.53±17.23, 39.33±20.52, 33.12±22.21 µm 로 CS 의함량이올라가면, 점차적으로다공의크기가작아지는대신다공이증가하고뿐만아니라거침도또한증가함을볼수가있었다. 다공의크기와거침도는세포초기부착력과세포증식에어떤영향을주는지, 후에 MTT 평가를통해초기부착력을확인하였다. 12-15 세포증식률. Figure 4 는 CS/GG 에연골세포를파종하여세포증식률을측정하기위해 in vitro 조건에서 MTT 분석을시행하였다. 각각함량이다른지지체에세포를 1.9 10 5 개씩파종하여 1, 4, 7, 14, 및 21 일후에측정하였다. 각각의지지체에서세포증식률을확인한결과, 모든군에서시간이지남에따라세포증식률이증가함을확인할수있었다. 그러 폴리머, 제 41 권제 6 호, 2017 년

콘드로이틴설페이트가함유된젤란검하이드로젤에서의연골재생연구 965 Figure 4. Cell viability of chondrocytes in 0, 10, 20 and 30% CS/ GG scaffolds was analyzed by MTT assay after 1, 4, 7, 14 and 21 days post-seeding in vitro. 나 20% CS/GG 지지체는 0, 10, 및 30% CS/GG 지지체에비해세포증식률이모든타임포인트에서높게나타난것을확인할수있다. 이는 SEM 이미지관찰결과, 20% CS/GG 지지체가 0, 10, 그리고 30% CS/GG 지지체들에비해보다연골세포증식의적합한다공의크기를갖기때문으로사료된다. 17 또한천연연골에서추출한콘드로이틴설페이트의함량이 17.94% 를보인다는연구가보고된바있다. 따라서 20% CS/GG 지지체가천연연골재생과유사한조성을갖기때문에다른군보다연골세포증식률이증가된것으로사료된다. 18 PCR 분석. 0, 10, 20, 및 30% CS/GG 지지체에서의연골세포유전자발현관찰을위해 3 주동안지지체에배양시킨연골세포를분리한후 mrna 를채취하였다. 그후역전사효소를사용하여 cdna 로증폭시킨후연골기질의주요성분인어그리칸 (aggrecan), 연골조직의세포간질속에서볼수있고교원섬유 (collagen fibers) 를구성하는제 1 형콜라겐 (collagen Type I), 연골세포의표지분자인제 2 형콜라겐 (collagen Type II) 프라이머들을사용하여전기영동 (electrophoresis) 한후각각의나타난발현도를, house keeping gene 인 GAPDH 를사용하여표준화하였다 (Figure 5). 19-24 그결과어그리칸, 제 1, 2 형콜라겐의발현도가 20% CS/GG 지지체에파종한군에서모두가장높게나왔다. 이는연골세포증식의하이드로젤지지체로서 20% 의 CS 를첨가한젤란검지지체가다른지지체들보다이상적인연골세포지지체임을증명해준다. Figure 5(a), (b), (c) 에서 0, 10, 및 30% CS 를첨가한그룹들은대조군그룹보다발현도가모두높거나비슷하게관찰되었으나, CS 를 20% 첨가한그룹은대조군과비교해봤을때모든군에서발현도가높게나왔다. 이로써 CS 는연골세포증식에긍정적인역할을한다는사실을알수있지 Figure 5. RT-PCR of aggrecan, collagen Type I, II of the 0, 10, 20 and 30% CS/GG scaffolds was analyzed for 7, 14 and 21 days postseeding in vitro. Gene expression profiles of (a) aggrecan; (b) collagen Type I; (c) collagen Type II (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). 만, 첨가한양이일정량이상을초과하게되면연골세포증식이최적일때보다저해되는것을확인하였다. 이는 MTT 분석실험결과와유사함을보인다. 25-28 Polymer(Korea), Vol. 41, No. 6, 2017

966 최일남 김창현 송정은 백종선 전성현 전하얀 이순영 강길선 결 본연구에서는 0, 10, 20, 30% CS/GG 하이드로젤을제작하여, 물리적특성평가와연골세포를각하이드로젤에파종하여, 추후연골재생을위한지지체로서의가능성을확인하기위한연구를진행하였다. SEM 분석을통해각각의지지체의다공크기를비교하였고, MTT 를통하여연골세포의초기부착률과증식률을확인하였으며, RT-PCR 을통하여유전자발현도를확인하였다. 이모든 in vitro 결과에서 20% CS/ GG 지지체가가장우수한결과를나타내었다. 이는 20% CS/ GG 지지체가천연연골재생과유사한조성을갖기때문이라사료된다. 28 즉 20% CS/GG 지지체는연골세포의증식을위한우수한환경을제공하고, 연골세포의증식과세포외기질분비가우수한것이관찰됨으로연골조직재생을위한지지체로써다양한응용가능성을확인할수있었다. 감사의글 : 이논문은보건복지부의재원으로한국보건산업진흥원의보건의료기술연구개발사업지원 (HI15C2996) 을받아수행된연구입니다. 론 참고문헌 1. I. G. Kim, J. Ko, H. R. Lee, S. H. Do, and K. Park, Biomaterials, 85, 18 (2016). 2. Y. C. Kuo and C. C. Wang, Biointerfaces, 93, 235 (2012). 3. Z. Cheng and S. H. Teoh, Biomaterials, 25, 1991 (2004). 4. W. F. Daamen, J. H. Veerkamp, J. C. M. van Hest, and T. H. van Kuppevelt, Biomaterials, 28, 4378 (2007). 5. A. D. Augst, H. J. Kong, and D. J. Mooney, Macromol. Biosci., 6, 623 (2006). 6. T. Segura, B. C. Anderson, P. H. Chung, R. E. Webber, K. R. Shull, amd L. D. Shea, Biomaterials, 26, 359 (2005). 7. G. Khang, S. K. Lee, H. N. Kim, J. Silva-Correia, M. E. Gomes, C. A. Viegas, I. R. Dias, J. M. Oliveira, and R. L. Reis, J. Tissue Eng. Regen. Med., 9, 265 (2015). 8. H. Park, H. Y. Kim, S. Y. Kwon, G. Khang, and Y. S. Kim, Polym. Korea, 39, 144 (2015). 9. J. T. Oliveira, L. Martins, R. Picciochi, I. B. Malafaya, R. A. Sousa, N. M. Neves, J. F. Mano, and R. L. Reis, J. Biomed. Mater. Res. Part A, 93A, 852 (2010). 10. S. Nadanaka and K. Sugahara, Glycobiology, 7, 253 (1997). 11. Y. Ohtsuka, H. Nakae, H. Ade, and T. Obinata, Zool. Sci., 11, 409 (1994). 12. S. R. Caliari, M. A. Ramirez, and B. A. C. Harely, Biomaterials, 32, 8990 (2011). 13. T. Song, J. Ma, L. Guo, and P. Yang, Cell Physiol., 10, 1002 (2017). 14. J. E. Song, R. Kim, J. H. Lee, H. M. Kim, C. M. Kim, D. Lee, and G. Khang, Inter. J. Tissue Regen., 4, 17 (2013). 15. J. Brinckmann, Top. Curr. Chem., 247, 1 (2005). 16. H. K. Hong, S. K. Lee, Y. S. Song, D. S. Kim, S. Eom, H. E. Kim, and G. S. Khang, Polym. Korea, 10, 1 (2010). 17. K. S. Han, H. Ko, N. Jang, J. Song, and G. Khang, Macromol. Res., 22, 1253 (2014). 18. J. Einbinder and M. Schubert, J. Biol. Chem., 85, 725 (1950). 19. D. Sakloetsakun, Drug Dev. Ind. Pharm., 14, 10 (2016). 20. B. B. Mandal and S. C. Kundu, Biomaterials, 30, 2956 (2009). 21. B. K. Gu, M. S. Kim, S. J. Park, and C. H. Kim, Inter. J. Tissue Regen., 2, 83 (2011). 22. S. Sahoo, S. L. Toh, and J. C. Goh, Biomaterials, 31, 2990 (2010). 23. M. Rutgers, D. B. Saris, L. A. Vonk, M. H. Van Rijen, and V. Akrum, Tissue Eng. Part A, 19, 59 (2013). 24. V. Perugini, A. L. Guildford, and J. Silva-Correia, J. Tissue Eng. Regen. Med., 10, 1002 (2016). 25. M. H. Mahdi and B. R. Conway, Int J. Pharm., 30, 515 (2016). 26. S. Mobini, B. Hoyer, M. Solati-Hashjin, A. Lode, N. Nosoudi, A. Samadikuchaksaraei, and M. Gelinsky, J. Biomed. Mater. Res. A, 101, 2392 (2013). 27. H. J. Ha, J. E. Song, Y. Kang, E. Y. Kim, S. J. Yoon, Y. I. Yang, D. Lee, and G. Khang, Biomed. Eng. Appl. Basis Commun., 26, 1 (2014). 28. J. C. Kim, H. J. Song, E. Jang, S. H. Kim, and H. W. Park, Polym. Korea, 39, 1 (2015). 폴리머, 제 41 권제 6 호, 2017 년