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Koren Journl of Miroiology (2013) Vol. 49, No. 1, pp. 24-29 DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2013.232 Copyright 2013, The Miroiologil Soiety of Kore 보문 In vitro 발효에서 Preiotis 와 Proiotis 가돼지장내미생물과발효산물에미치는영향 김동운 1 * 채수진 1 김영화 1 정현정 1 이성대 1 박준철 1 조규호 1 사수진 1 김인철 1 김인호 2 1 농촌진흥청국립축산과학원 2 단국대학교동물자원학과 Effets of Preiotis nd Proiotis on Swine Intestinl Miroflor nd Fermenttion Produts In Vitro Fermenttion Dong-Woon Kim 1 *, Su-Jin Che 1, Young-Hw Kim 1, Hyun-Jung Jung 1, Sung-De Lee 1, Jun-Cheol Prk 1, Kyu-Ho Cho 1, Soo-Jin S 1, In-Cheul Kim 1, nd In-Ho Kim 2 1 Ntionl Institute of Animl Siene, R.D.A., Seonghwn 331-308, Repuli of Kore 2 Deprtment of Animl Resoure nd Siene, Dnkook University, Cheonn 330-714, Repuli of Kore (Reeived August 27, 2012 / Aepted Deemer 27, 2012) In the present study, the effets of preiotis nd preiotis+proiotis on intestinl miroflor nd fermenttion produts were evluted in pig in vitro fermenttion model. The sustrtes used in this study were iso-mlto oligoshride (IMO), prtilly digested hiory-inulin (CI), rffinose (RA), nd ylodextrin (CD) s preiotis nd Ltoillus reiteri s proiotis. For pig in vitro fermenttion, the experimentl diet for growing pigs ws predigested using digestive enzymes sereted y smll intestine nd this hydrolyzed diet ws mixed with uffer solution ontining 5% fresh swine fees. The mixture ws then inuted with either preiotis or preiotis+proiotis for 24 h. Smples were tken t 24 h, nd vile ounts of miroflor, gs, ph, voltile orgni ompounds (VOCs) nd short-hin ftty id (SCFA) were nlyzed. The vile ount of Enteroteriee ws signifintly deresed (p<0.001) in ll tretments ontining preiotis nd preiotis+proiotis when ompred to the ontrol. However, the numer of lti id teri inresed in the preiotis nd preiotis+proiotis tretment. The ph vlues in the fermenttion fluid deresed in ll tretments when ompred to the ontrol, nd their effets were greter in the preiotis+proiotis group thn preiotis group. Fermenttion with preiotis resulted in redution in mlodorous ompounds suh s mmoni, hydrogen sulfide nd sktole when ompred to the preiotis+proiotis group. Short-hin ftty id prodution ws lso higher for tretment with preiotis+proiotis thn tretment with preiotis. In onlusion, the results of this study demonstrted tht fermenttion with preiotis ws effetive in reduing the formtion of mlodorous ompounds nd preiotis+proiotis ws effetive in inresing lti id teri nd SCFA nd reduing the ph. Moreover, further studies will e needed to determine whether the results oserved in the in vitro model would our in pigs tht ingest these preiotis or proiotis. Keywords: in vitro fermenttion, preiotis, proiotis, short-hin ftty id Proiotis는살아있는유익미생물이며섭취에의하여숙주동물의장내세균총을변화시켜건강에유익한작용을한다 (Hvenr nd Huis in t Veld, 1992). Preiotis는대장에존재하는미생물총중에서비피도박테리아와락토바실러스의성장을선택적으로자극한다 (Shrezenmeir nd de Vrese, 1999). 비피도박테리아는락토바실러스속미생물과함께건강증진작용을하는 proioti 이다. 비피도박테리아는대장균과같은병원성균을억제한다고 *For orrespondene. E-mil: dwkim9405@kore.kr; Tel.: +82-41- 580-6704; Fx: +82-41-580-6719 알려져있고, 이러한기능은초산, 유산과같은물질생성으로 ph를낮추거나박테리오신과같은항균물질을생산함으로써가능하다 (Mkrs nd Vuyst, 2006). 최근의연구에서 proiotis는돼지의성장에긍정적인역할을한다고알려져있다. 비피도박테리아, 락토바실러스, 바실러스및효모와같은유익미생물이가축의성장을증진시킨다고보고되었다 (Dnek et l., 1991; Ae et l., 1995; Mthew et l., 1998; Alexopoulus et l., 2004, 2004). Stewrt 등 (1993) 의보고에의하면 preiotis는병원성균의억제, 효소반응촉진및암모니아와페놀의생산량을감소시키는효과를보인다는연구결과가보고된바있다. 특히

In vitro fermenttion of preiotis nd proiotis 25 Tle 1. Composition of the diets used during in vitro fermenttion Ingredients % Corn 70.45 Soy en mel 17.91 Whet 8.09 Soy en oil 1.00 Limestone 0.97 Dilium phosphte 0.61 Vitmin/minerl premix 0.35 L-lysine HCL 0.27 Slt 0.25 Provided per kg diet: 20,000 IU of vitmin A, 4,000 IU of vitmin D 3, 80 IU of vitmin E, 16 mg of vitm K 3, 4 mg of thimine, 20 mg rioflvin, 6 mg of pyridoxine, 0.08 mg of vitmin B 12, 20 mg niin, 50 mg of C-pntothente, 2 mg of foli id nd 0.08 mg iotin, 140 mg of Cu, 179 mg of Zn, 12.5 mg of Mn, 0.5 mg of I, 0.25 mg of Co nd 0.4 mg Se. nonstrh polyshrides (NSP) 는분으로배설되는악취물질의감소에효과있다고보고되었다 (Mroz et l., 2000). Nemová 등 (1999) 의보고에의하면 fruto-oligoshride와락토바실러스를어린돼지에급여한결과락토바실러스, 비피도박테리아, 총혐기성균및호기성균이증가하였다고하였다. 그러나 Mikkelsen 등 (2003) 은 fruto-oligoshride 급여하더라도분변박테리아수에영향을끼치지않았다고보고하였다. 따라서이러한개념은아직명확하지않아규명되어야할필요가있으며, 결장의미생물총을유익한미생물이우점하도록조절하는 proiotis와 preiotis의효과에관한연구자들의관심이높아지고있다. Syniotis, 즉 proiotis와 preiotis의조합은장내미생물을유익한미생물총으로변환시켜숙주동물의장건강을증진시킬수있다는개념이다 (Collins nd Gison, 1999). 특히본실험에서사용하는 preiotis 중에서사이클로덱스트린은난소화성다당이며돼지장내발효에미치는효과를검토함으로서향후 preiotis 로서사용가능성에대한기초자료가될수있을것이다. 따라서본연구는돼지 in vitro 모델을이용하여장내미생물과발효산물변화에대한 4종류의 preiotis와 1종류의 proiotis 를단독, 조합효과를검토하였다. 재료및방법 Proiotis 와 preiotis 본시험에서사용한 preiotis는이소말토-올리고당 (IMO), 부분분해치커리이눌린 (CI), 라피노스 (RA), 사이클로덱스트린 (CD) 을사용하였으며 proiotis는 Ltoillus reuteri를사용하였다. 소장조건에의한사료의가수분해물제조육성돈 (growing pig) 사료 (Tle 1) 를 Boisen nd Fernndez (1995) 의방법으로미리소장의조건으로가수분해하였다. 1 g 의사료를 25 ml의 phosphte uffer (0.1 M, ph 6.0) 을잘혼합한후, 1 M HCl을사용하여 ph 2로조정하였다. 이혼합물에 pepsin (Sigm) 을 0.04% 를첨가하고 37 에서 4시간 shking wter th에서배양하였다. 두번째단계에서는 10 ml의 phosphte uffer (0.2 M, ph 6.8) 와 5 ml의 0.6 M NOH 용액을첨가하였다. 그리고 1 M HCl 또는 1 M NOH 용액을사용하여 ph 6.8로조정하였다. Pnretin (Sigm) 을 0.14% 를첨가하고 shking wter th에서 37, 18시간배양하였다. 효소반응이끝난후 80 에서 15분간열처리하여동결건조하였다. 가수분해물은소장에서미리소화된사료로서 in vitro 발효시험에사용되었다. In vitro 장내발효멸균완충액 100 ml에육성돈의신선한분변 5 g과 1 g의가수분해물을첨가하고잘혼합한후 0.5 g의 preiotis 또는 1 ml의 proiotis (1 10 9 Log CFU/ml) 를넣었다. 혼합물을 CO 2 로 15 분간치환한후 37 에서 24시간배양하였다. 이후시료를채취하여즉시미생물의수를측정하였고, 샘플의일부는 -20 에보관한후 VOCs 및 SVFA를분석하였다. 완충액의조성 (MDougll, 1948) 은 1 L의증류수에 9.8 g NHCO 3, 9.3 g N 2HPO 4, 0.67 g NCl, 0.57 g KCl, 0.12 g MgSO 4 6H 2O, 0.079 g CCl 2 6H 2O 를넣고 ph 7로조정하였다. 가스량과 ph 측정 Serum ottle내의발효과정에서생성된가스량은 wter displement pprtus (Ferork nd Hrwdey, 1983) 를사용하여측정하였다. 발효액의 ph는 eletroni ph meter (HANNA 212, Itli) 를사용하여측정하였다. 암모니아, 휘발성유기물및황화수소분석발생된 mmonium ion (NH + 4 ) 은 Chney와 Mrh (1962) 의방법에따라 spetrophotometer를이용하여 630 nm의파장에서측정하였다. 발효과정에서생성된 VOCs의농도는 gs hromtogrphy를사용하여분석하였다 (Willing et l., 2005). 발효액은원심분리하였고상등액 2 ml에 4 ml의 4 M NOH와 1 ml의 hloroform 을첨가하고혼합하였다. 이것을 3,500 rpm에서 10분간원심분리한후 DB-5ms olumn이장착된 gs hromtogrph (Agilent, 6890N, USA) 를이용하여분석하였다. 황화수소는 Gste detetor tue No. 4LL을장착한 Gste detetor (Model GV-100, Gste, Jpn) 를사용하여측정하였다. 단쇄지방산과미생물분석발효액의단쇄지방산농도는 HP-INNOW WAX olumn이장착된 gs hromtogrph (Agilent, 6890N, USA) 에의하여분석하였다. 발효액을원심분리하고 5 ml 상등액은 0.05 ml의 sturted HgCl 2 와 1.0 ml의 25% HPO 3 와혼합하였다. 그리고혼합물은 12,000 rpm에서 10분간원심분리한후상등액을 0.2 mm syringe filter로여과하여 gs hromtogrphy 방법으로분석하였다. 미생물분석락토바실러스미생물의생균수는 MRS gr를사용하였고엔

26 Kim et l. Tle 2. Counts of miroflor fter 24 h of in vitro fermenttion of swine fees with preiotis nd/or proiotis Item (Log CFU/ml) Without proiotis With proiotis P-vlue for ontrsts CON IMO CI RA CD P IMO CI RA CD SE CON vs. OTH PRE vs. SYN Enteroteriee 7.86 7.40 6.81 6.99 6.51 6.34 6.57 6.32 6.38 6.26 0.09 0.001 0.001 Lti id teri 8.00 8.26 8.26 8.18 8.18 8.65 9.28 9.34 9.08 9.00 0.02 0.001 0.001 CON, ontrol; P, CON + Ltoillus reuteri; IMO, CON + iso-mlto oligoshride 0.5%; CI, CON + hiory-inulin 0.5%; RA, CON + rffinose 0.5%; CD, CON + ylo-dextrin 0.5% Pooled stndrd error Effets: CON, ontrol ; OTH, other tretment ; PRE, preiotis ; SYN, preiotis + proiotis Tle 3. Gs prodution nd ph vlue fter 24 h of in vitro fermenttion of swine fees with preiotis, nd/or proiotis Item Without proiotis With proiotis P-vlue for ontrsts CON IMO CI RA CD P IMO CI RA CD SE CON vs. OTH PRE vs. SYN Gs prodution 8.83 17.50 17.00 13.33 16.33 8.33 17.33 15.33 9.68 18.33 0.57 0.001 0.040 ph 6.62 6.10 6.09 6.23 6.12 6.54 6.03 5.88 5.93 5.97 0.04 0.001 0.001 CON, ontrol; P, CON + Ltoillus reuteri; IMO, CON + iso-mlto oligoshride 0.5%; CI, CON + hiory-inulin 0.5%; RA, CON + rffinose 0.5%; CD, CON + ylo-dextrin 0.5% Pooled stndrd error Effets: CON, ontrol; OTH, other tretment; PRE, preiotis; SYN, preiotis + proiotis 테로박테리아는 DHL gr를사용하였다. MRS gr plte는혐기적조건에서 37, 48시간배양하였고 DHL gr pltes는 37, 24시간배양하여생균수를분석하였다. 통계분석모든실험결과에대한통계분석은 SAS (Sttistil Anylsis System) 의 GLM (Generl Liner Model) 을이용하여분산분석을실시하였다. 처리구간의대비는대조구 (CON) 와다른처리구 (OTH), 프리바이오틱스 (PRE) 와신바이오틱스 (SYN, Preiotis+Proiotis) 로구분하여 95% 유의수준으로분석하였다. 결과및고찰미생물의변화돼지 in vitro 장관조건에서 preiotis와 proiotis를첨가하고 24시간배양한후미생물수를분석하였다 (Tle 2). 엔테로박테리아의수는무첨가와비교시 preiotis, preiotis+proiotis 첨가시유의적으로감소하였다 (p<0.001). 락토바실러스의수는무첨가와비교시 preiotis, preiotis+proiotis 첨가한모든처리구에서증가하였다. 특히 preiotis 첨가구에비하여 preiotis+ proiotis 첨가구에서락토바실러스수가증가하였다. 인간의경우 oligofrutose 첨가후비피도박테리아수는증가하였으며급여기간동안총혐기균의비율이 3.5% 에서 9.5% 로증가하였다 (Wng nd Gison, 1993). 렛에 glto-oligoshrides의급여결과비피도박테리아와락토바실러스의수가유의적으로증가하였고엔테로박테리아는감소하여 preiotis로서가능성을보여주었다 (Rowlnd nd Tnk, 1993). Nemov 등 (1999) 은어린돼지에 fruto-oligoshrides와 Ltoillus prsei 를급여한결과락토바실러스와비피도박테리아가증가하는결과를보고하였다. 본실험의결과는올리고당과생균제첨가가 in vitro 또는 in vivo에서락토바실러스의증가와엔테로박테리아가감소한다는이전의결과와유사하였다. 가스생산과 ph 변화가스생산에대한 preiotis와 proiotis의효과는 Tle 3에표시하였다. 대조구에비교하여 preiotis와 proiotis 첨가시가스생산량이유의적으로증가하였다 (p<0.001). H 2, CO 2, CH 4 와같은장내가스는난소화성올리고당의대장발효에기인한다고알려져있다 (Delzenne nd Roerfroid, 1994). 본연구의결과 preiotis, preiotis+proiotis의첨가구에서가스생산의증가는비피도박테리아, 락토바실러스이외의다른미생물의성장에의하여발생한다는간접적인증거가될수있다. 왜냐하면이들유익미생물은 homolti fermenttion 동안에가스를생산하지않기때문이다. 발효액의 ph는무첨가구와비교시 preiotis와 proiotis 첨가한모든처리구에서유의적으로감소하였다 (p<0.001). 특히 ph 저하는 preiotis 첨가구보다 preiotis+proiotis 첨가구에서분명히관찰되었다. Flikinger 등 (2000) 은 short hin frutooligoshrides를개의분변미생물과함께배양하였을때 ph 가 17% 감소하였다고보고하였다. 맹장내용물의 ph 감소는락토바실러스와비피도박테리움과같은유산생성박테리아의성장에유리함을보여준다 (Gottshlk, 1979; Hill, 1983). Tle 3 의결과는 preiots, preiots+proiotis 첨가구에서 ph 저하원인은유기산생성미생물증가로유산과초산과같은대사산물의증가에기인한다고생각된다. 악취물질생성돼지생산과관련하여대표적인악취물질로는 mmoni, hydrogen sulfide, phenol 및 sktole류의화합물이다. 이들악취성분생성에대한 preiotis와 proiotis의효과는 Tle 4에표시하였다. 배양과정에서 mmoni, hydrogen sulfide, 4-methyl phenol 및 sktole 화합물의생성은 preiotis+proiotis 처리구보다 preiotis 처리구에서유의적으로는감소하는것이관찰되었다 (p<0.001). 특히 preiotis 중에 CI 처리구에서암모니아및황화수소감소에효과적이었는데이것은 CI를특이적으로이용하는미생물에의해 ysteine desulfunse와같은효소를생산하는

In vitro fermenttion of preiotis nd proiotis 27 Tle 4. Mlodor gs emission fter 24 h of in vitro fermenttion of swine fees with preiotis, nd/or proiotis Without proiotis With proiotis P-vlue for ontrsts Item (ppm) CON vs. PRE vs. CON IMO CI RA CD P IMO CI RA CD SE OTH SYN + NH 4 270.50 64.33 16.83 74.00 31.17 304.67 161.50 102.33 188.17 120.83 4.61 0.001 0.001 H 2S 26.75 39.25 6.75 20.00 17.75 21.00 74.25 13.25 55.75 41.25 0.86 0.001 0.001 4-methyl phenol 8.18 7.82 7.03 7.76 11.99 7.60 11.83 10.76 10.34 10.58 0.22 0.001 0.001 Indole 2.20 1.68 1.29 2.39 2.26 1.64 2.26 1.78 2.31 2.11 0.14 0.120 0.030 Sktole 2.14 1.71 1.63 1.62 1.64 2.29 2.19 2.42 2.47 2.60 0.02 0.001 0.001 CON, ontrol; P, CON + Ltoillus reuteri; IMO, CON + iso-mlto oligoshride 0.5%; CI, CON + hiory-inulin 0.5%; RA, CON + rffinose 0.5%; CD, CON + ylo-dextrin 0.5% Pooled stndrd error. Effets: CON, ontrol; OTH, other tretment; PRE, preiotis; SYN, preiotis + proiotis Tle 5. SCFA onentrtion fter 24 h of in vitro fermenttion of swine fees with preiotis, nd/or proiotis Item (ppm) Aeti id Without proiotis With proiotis P-vlue for ontrsts CON vs. CON IMO CI RA CD P IMO CI RA CD SE OTH PRE vs. SYN Propioni id 986.48 1609.47 1212.42 1368.08 1371.04 1344.10 1545.40 1708.50 1375.60 1691.90 53.74 0.001 0.001 iso-butyri id 954.33 1394.31 1237.71 1514.94 1409.23 1507.40 1644.50 1854.50 1711.90 1736.70 85.91 0.001 0.001 Butyri id 42.11 27.74 21.76 25.61 29.75 47.74 36.37 35.13 30.33 40.42 0.89 0.001 0.001 iso-vleri id 288.12 340.22 264.42 349.32 243.11 350.19 392.53 360.23 359.21 443.57 10.41 0.001 0.001 Vleri id 98.80 58.69 45.85 49.64 64.52 106.75 82.33 71.56 67.45 82.33 2.28 0.001 0.001 CON: ontrol; P: CON + Ltoillus reuteri; IMO: CON + iso-mlto oligoshride 0.5%; CI: CON + hiory-inulin 0.5%; RA: CON + rffinose 0.5%; CD: CON + ylo-dextrin 0.5%. Pooled stndrd error. Effets: CON, ontrol; OTH, other tretment; PRE, preiotis; SYN, preiotis + proiotis 미생물의활성이억제된것으로생각된다. Govers 등 (1999) 은결장의입구에들어온비소화전분량이증가하게되면결장말단부위의암모니가농도가낮아진다고보고하였다. 또한 Piv 등 (1997) 은돼지에 ltitol을급여하면맹장미생물에의한 indole과 3-methylindole의생산이감소한다고보고하였다. Vn Heugten과 Vn Kempen (2002) 는비육돈에 ellulose 급여시분변의 p-resol 농도가감소함을보고하였다. 본연구의결과 preiotis, preiotis+proiotis 처리구에서악취물질의감소는 ltoilli와같은유산생성미생물의증가와낮은 ph 때문이라고생각된다. 왜냐하면낮은 ph 조건에서 indole, sktole, hydrogen sulfide, mmoni 생성을촉매하는 tryptophnse, ystein desulfunse와같은효소를생산하는미생물의활성을감소시키는것으로사료된다. 단쇄지방산생성 Preiotis와 proiotis 첨가에의한단쇄지방산생산에대한효과는 Tle 5에표시하였다. Preiotis, preiotis+proiotis 첨가구에서 eti id, propioni id, utyri id, vleri id 의농도가무첨가구에비하여유의적으로높게나타났으며 (p<0.001). 특히 preiotis 처리구와비교시 preiotis+proiotis 처리구모두에서단쇄지방산생성이높았다. 또한 iso-utyri id와 iso-vleri id 생성의감소는대조구와비교하여 preiotis, preiotis+proiotis 처리구에서뚜렷이관찰되었다 (p<0.001). 발효과정에서단쇄지방산을생산하는미생물이증가하였다는것을의미한다. 단쇄지방산은동물의대사에여러가지중요한역할을한다. Roediger (1982) 의보고에의하면 utyrte는렛결장세포의주된에너지원이다. 또한단쇄지방산은돼지총유지에너지요구량의 28% 를공급한다 (Imoto nd Nksim, 1978). Inulin 급여는렛모델에서높은단쇄지방산을생산한다 (Levrt et l., 1993; Younes et l., 2001). 돼지에 fruto-oligoshride (FOS) 를 0%, 0.25%, 3% 첨가급여시 3% 에서결장의 ph가 5.94에서 5.53으로낮아지며이것은아마도단쇄지방산의증가때문일것이라고한다 (Gison nd Roerfroid, 1995; Shim et l., 2005). 또한 3% FOS 급여는대장발효를촉진시키고단쇄지방산의생산이흡수력보다빠르다는것을암시하였다. FOS를첨가하고발효 11시간후단쇄지방산이증가했다는 Flikinger 등 (2000) 의결과는 Tle 5의 in vitro 실험과유사하였다. CD는렛에경구투여시장관상부에서는대사되지않고맹장이나결장의미생물에의해분해된다 (Mrtin Del Vlle, 2004). 흥미로운것은 CD 첨가시 in vitro 발효는악취물질생성의감소와단쇄지방산및유산균의증가를보였으며이러한결과는 CD가 preiotis로서돼지대장에서발효기질로사용가능하다는것을보여주고있다. 본연구에서사용한여러종류의 preiotis와 preiotis가단쇄지방산을증가시켜장에서식하는다양한미생물중에서유기산및유산을생성하는유산균의성장에도움을줄것으로사료된다. 또한본실험에서사용한돼지 in vitro 발효모델은새로운 preiotis, proiotis들이경구투여시숙주동물의소화관발효에미치는효과를예측하는데도움이될것이다. 결론적으로본시험결과는사용한 preiotis는악취물질생

28 Kim et l. 성을감소시키고 preiotis+proiotis 사용은유산균과단쇄지방산을증가시키고 ph를감소한다는것을보여주었다. 적요 본연구는 preiotis와 proiotis가 in vitro 배양조건에서돼지장내미생물및발효산물에미치는영향에대하여검토하였다. preiotis로써이소말토-올리고당 (IMO), 부분분해치커리이눌린 (CI), 라피노스 (RA), 사이클로덱스트린 (CD) 을사용하였으며 proiotis로는 Ltoillus reuteri를사용하였다. In vitro 발효시험은육성돈사료를소화효소로가수분해시킨사료와 5% 의돈분그리고 preiotis와 proiotis를첨가또는무첨가하여 24시간동안배양시켰다. 배양후발효액내의미생물, 가스, ph, 암모니아, 황화수소, 단쇄지방산을분석하였다. 엔테로박테리아는 preiotis와 proiotis 첨가구가대조구와비교하여유의적으로감소하였으며, 락토바실러스수는유의적으로증가하였다. 발효액의 ph는대조구에비하여첨가구에서낮았으며 preiotis보다 preiotis+proiotis 첨가구에서더욱낮았다. 암모니아, 황화수소및스카톨의농도는 preiotis+proiotis 구보다 preiotis 첨가시유의적으로감소하였다. 단쇄지방산은 preiotis 보다 preiotis+proiotis 구에서유의적으로많이생성되었다. 본시험의결과 preiotis 첨가는암모니아, 황화수소및스카톨의농도를감소시키는데효과가있었으며, preiotis+proiotis 는유산균과단쇄지방산의농도를증가시키는효과가있었다. In vitro에서얻어진실험결과가실제로돼지에급여시같은결과가얻어질런지에대한추가적인연구가필요하다. 참고문헌 Ae, F., Ishishi, N., nd Shimmur, S. 1995. Effet of dministrtion of ifidoteri nd lti id teri to neworn lves nd piglets. J. Diry Si. 78, 2838 2846. 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