생약학회지 Kor. J. Pharmacogn. 45(1) : 35 40 (2014) 감꼭지의항산화활성성분 차배천 * 상지대학교보건과학대학제약공학과 Ingredients of Antioxidant Activity from Calyx of Diospyros kaki Thunberg Bae Cheon Cha* Department of Pharmaceutical Engineering, College of Health Sciences, Sangji University, Wonju 220-702, Korea Abstract In this study, in order to search for new functional materials from natural products, was carried out the study of antioxidant active ingredients in persimmon calyx(calyx of Diospyros kaki Thunberg). I have experimented with the effect of antioxidant activity of five different extract(meoh, n-hexane, EtOAc, n-buoh and H 2 O extract) obtained from persimmon calyx. As a result, the butanol extract, that is the main component fraction of antioxidant activity was found. Three compounds were isolated by silica gel column chromatography from the n-buoh extract of persimmon calyx. Their structures of compound 1, 2 and 3 isolated from n-buoh extract of persimmon calyx were identified as quercetin, (+)-catechin and gallic acid by using the TLC, 1 H-NMR and 13 C-NMR. Key words Calyx of Diospyros kaki Thunberg, Antioxidant activity, Quercetin, (+)-Catechin, Gallic acid 인체는생명유지에필요한에너지를만들기위해끊임없이산소를필요로하며에너지를만드는호흡과정에서흡입되어진산소중일부분 ( 약 2-3%) 은활성산소라고불리어지는물질로전환되어생체에특이한반응을하는것으로알려져있다. 1) 이러한활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 에는체내효소계, 환원대사등에의해생성되는일중항산소 ( 1 O 2 ) 나 superoxide(o 2 ) 와같은 free radical 과과산화수소 (H 2 O 2 ) 나 lipid peroxide (ROOH) 등으로서이들은분자구조적으로매우불안정하기때문에고분자의생체내세포성분들을공격하여쉽게산화적스트레스의환경을조성하기도하며, 2,3) 다양한성인병질환의유발과도연관되어져있는것으로알려져있다. 4-7) 따라서생체내의활성산소종을제어하는것이질병예방을위한중요한대응책중하나이며이의대표적물질중의하나가항산화제이다. 항산화제는크게천연항산화제와합성항산화제로나누어지며, 천연항산화제로는식품의가공또는저장중발생되는산화를방지하기위하여널리사용되는 vitamin E, C 등으로서이들은안전성은높으나단독으로는산화반응저지능이약하고가격이고가인단점이있다. 8) 반면에합성항산화제인 butylated hydroxyanisole(bha) 과 butylated hydroxytoluene * 교신저자 (E-mail) : bccha@sangji.ac.kr (Tel): +82-33-730-0554 (BHT) 은효과는우수하나페놀계합성항산화제의안전성으로인하여그사용이점차감소되고있는추세이다. 9-11) 이에천연물질이나약용식물로부터합성항산화제를대체할수있는부작용이적고항산화활성이우수한새로운천연항산화제의개발연구가활발히진행되고있다. 12-14) 감 (Diospyros kaki Thunberg) 은예전부터우리나라에서는제사에사용할뿐만아니라다양한용도로이용되는과일로알려져있지만, 한국, 일본, 중국등의동아시아에서는민간약으로도사용해왔다. 예로부터동의보감이나향약집성방에의하면감은종기나염증질환, 부스럼, 화상을치료하고고혈압을예방하고동맥경화에효능이있다고알려져있다. 감의열매꽃받침을모아서말린것을감꼭지즉생약명시체 ( ) 라고하며, 감꼭지에는 betulinic acid, oleanolic acid, ursolic acid, 포도당등이함유되어있고민간에서는딸국질, 야뇨증등에효과가있는것으로알려져있다. 15) 이외에감꼭지의효능에대해서는혈액응고억제효과 16) 와미백과항염증효과가보고되어져있으며, 17) 항산화와항염증활성연구도알려져있으나 18) 항산화활성주성분에대한상세한연구는보고되어져있지않다. 이에본연구에서는보다안전하고우수한활성을나타내는항산화제를천연물로부터개발하고자하는연구의하나로감꼭지의다양한극성별용매분획물에대하여 DPPH법 35
36 Kor. J. Pharmacogn. 에의한 free radical 소거작용과총페놀법에의한항산화활성물질의함량검색을통해우수한항산화활성을나타내는활성분획물을확인하고, 활성분획물로부터 column chromatography 에의해활성주성분을분리한후분리되어진화합물에대하여 NMR 등의기기분석을통해감꼭지의항산화활성주성분을다음과같이확인하였으므로이를보고하고자한다. 재료및방법 실험재료 본실험에사용한감꼭지는강원도원주시우산동에소재한천일약업사에서구입하여음건하고세절하여실험재료로사용하였고, 상지대학교제약공학과의약화학실험실에보관중이다. 기기및시약 성분분리를위한순상 column chromatography 용 silica gel 은 Kiesel gel 60(70-230 mesh, ASTM, Merck) 을사용하였고, 성분확인용 TLC plate 는 Kiesel gel 60F 254 (ART.5715, Merck) 를사용하였다. Free radical 소거효과측정용시약인 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 는 Aldrich 사제품을구입하여사용하였으며, 표준품인 α- tocopherol 및 BHA(butylated hydroxyanisole) 는 Sigma 사제품을구입하여사용하였고, 추출및분획용용매는모두특급시약을사용하였다. 흡광도는 Milton-Roy spectronic Genesys-5 UV 분광계를사용하여측정하였고, FT-NMR 은 Varian Mercury 300 MHz 를, 융점은 Mettler FP-5 융점측정기를사용하였으며보정은하지않았다. 추출및분리 음건한감꼭지 510 g 을 MeOH 1,500 ml 를가하여수욕상에서 3 회반복추출하여여과후농축하여감꼭지 MeOH extract(16.5 g) 를얻었다. 얻어진 MeOH extract 의일부를증류수에현탁시켜 n-hexane, EtOAc, n- BuOH 및 H 2 O 순으로분획후농축하여각분획물 n-hexane 분획물 (1.2 g), EtOAc 분획물 (5.4 g), n-buoh 분획물 (2.6 g), 및 H 2 O 분획물 (6.2 g) 을각각얻었다. 분획물중가장우수한항산화효과를나타낸 n-buoh 분획물 (2.5 g) 을 CHCl 3 : MeOH = 20:1 부터단계적으로극성을높인전개용매를이용하여 silica gel column chromatography 를실시하여 6 개의활성소분획인 fraction 1(0.1 g), fraction 2(0.1 g), fraction 3(0.07 g), fraction 4(0.03 g), fraction 5(0.1 g) 및 fraction 6(1.5 g) 로나누었으며, 가장높은항산화효과를나타낸 fraction 4 와 fraction 5 및 fraction 6 으로부터재차 silica gel column chromatography 와 Sephadex-LH 20 을실시하여각각화합물 1(10.2 mg) 과 2(30.5 mg) 및 3(120.3 mg) 을분리하였다. Compound 1 Light yellow powder; m.p: 313-314 o ; UV: λ max (MeOH): 267, 371; IR (KBr)cm -1 : 3380 (OH), 1676 (C=O), 1608, 1516, 1235 (aromatic C-O); 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 6.19 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 6.40 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.89 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5'), 7.64 (1H, dd, J=2.3, 8.5 Hz, H-6'), 7.74 (1H, d, J=2.3 Hz, H-2'); 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ: 176.1 (C-4), 164.4 (C-7), 161.3 (C-5), 157.0 (C-9), 147.6 (C-2), 146.7 (C-4'), 145.0 (C-3'), 136.0 (C-3), 122.9 (C-1'), 120.4 (C- 6'), 115.0 (C-5'), 114.8 (C-2'), 103.3 (C-10), 98.0 (C-6), 93.2 (C-8); EI-MS: m/z 302 [M] + Compound 2 Light yellow powder; m.p: 175-176 o ; UV: λ max (MeOH): 284 (3.29); IR (KBr)cm -1 : 3300 (OH), 1630 and 1525 (aromatic ring); 1 H-NMR (300 MHz, CD 3 OD) δ: 4.56 (1H, d, J=8.0 Hz, H-2), 3.99 (1H, ddd, J=5.5, 8.0, 8.2 Hz, H-3), 2.84 (1H, dd, J=5.5, 16.1 Hz, H-4a), 2.50 (1H, dd, J=8.2, 16.1 Hz, H-4b), 5.85 (1H, d, J=2.0 Hz, H-6), 5.92 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 6.83 (1H, d, J=1.9 Hz, H-2'), 6.76 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5'), 6.71 (1H, dd, J=1.9, 8.3 Hz, H-6'), 13 C-NMR (100 MHz, CD 3 OD) δ: 157.1 (C-9), 156.6 (C-5), 156.3 (C-7), 145.1 (C-4'), 144.9 (C-3'), 131.5 (C-1'), 119.4 (C-6'), 115.0 (C- 5'), 114.6 (C-2'), 99.9 (C-10), 95.5 (C-6), 94.8 (C-8), 82.1 (C-2), 67.7 (C-3), 29.9 (C-4); EI-MS m/z 290[M] + Compound 3 Colorless amorphous powder; m.p: 249-251 o ; UV: λ max (EtOH): 217, 265; IR (KBr)cm -1 ; 3402 (OH), 1650 (CO); 1 H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 7.14 (2H, s, H-2, 6); 13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ) δ: 109.8 (C-2,6), 121.8 (C-1), 138.6 (C-4), 145.8 (C-3,5), 168.5 (COO); EI-MS m/z 290[M] + 감꼭지분획물및항산화활성주성분의 DPPH 라디칼소거작용의측정 Uchiyama 등 19) 의방법을약간변형시킨 Yoshikawa등 20) 의방법에의해다음과같이측정하였다. 0.1 M의초산완충액 (ph 5.5, 2.0 ml) 에시료의 EtOH 용액 (2.0 ml) 및 2 10-4 M DPPH EtOH용액 (1.0 ml) 을가하여전량을 5ml로하고실온에방치한후, 30분후 517 nm에서의흡광도를 1/2로감소시키는데필요한시료의양 (mg) 을 α-tocopherol 및 BHA와같은기존의항산화제를대조군으로하여시험하였다. 감꼭지분획물의총폴리페놀함량의측정 총폴리페놀함량은 Folin- Denis의 21) 방법에의해다음과같이측정하였다. Blank 및 gallic acid를 MeOH로희석하여 0, 50, 100, 250, 500 ppm의농도로제조하여 700 nm에서의흡광도로측정한검량선을작성하였다. 각분획물 10 mg을 MeOH 1 ml를가하여녹인다음 0.2 N Folin-Ciocalteau 시약을 0.5 ml 가하여실온에서 3분간반응시킨다음 10% Na 2 CO 3 0.5 ml를가하고증류수 1ml을넣은후실온에서 1시간동안반응시킨다. 이어서 1시간후 700 nm에서의흡광도를측정하여검량선대비총폴리페놀함량을계산하였다.
Vol. 45, No. 1, 2014 37 결과및고찰 기존에널리알려진천연항산화제인 α-tocopherol 과합성항산화제인 BHA 를대조군으로하여감꼭지의용매별분획물에대하여 DPPH 법에의한 free radical 소거작용실험을실시한결과 Table I 에나타낸바와같이감꼭지의각분획물들가운데에서 n-buoh 분획물이가장강력한 free radical 소거효과를나타내었다. 또한그들의함량과항산화활성간에연관성이있는것으로알려진 22) 폴리페놀화합물이감꼭지의어느분획물에가장많이함유되어있는지는확인할수있는총폴리페놀함량측정법에의한폴리페놀의함량실험결과 Table II 에서와같이 n-buoh 분획물에서가장높은총폴리페놀함량을보임으로서 DPPH 법에의한 free radical 소거작용실험결과와함께감꼭지의 n-buoh 분획물이항산화활성의주성분분획물임을확인할수있었다. 계속하여가장강한항산화활성을나타낸 n-buoh 분획물로부터항산화활성주성분을규명하기위하여 n-buoh 분획물을 CHCl 3 와 MeOH 혼합용매를사용하여전개용매의극성을단계적으로증가시키면서 silica gel column chromatography 를실시하여얻어진 6 종의소분획물에대해서도 DPPH 법에의한 free radical 소거작용을실시하였다. Table I. Radical scavenging effect of persimmon calyx extracts on DPPH method Sample 50% reduction(mg) a α-tocopherol 0.022±0.001 BHA 0.015±0.001 MeOH extract 0.070±0.002 n-hexane extract 0.081±0.002 EtOAc extract 0.039±0.001 n-buoh extract 0.014±0.001 H 2 0 extract 0.076±0.002 a Amount required for 50% reduction of DPPH(2 10-4, 0.079 mg) solution. Data are expressed as means±se of triplicate experiments. Table II. Total phenolic contents of persimmon calyx extracts on Folin- Denis methods Sample Total phenol content (mg/g) a MeOH extract 4.95±0.24 n-hexane extract 0.81±0.17 EtOAc extract 5.11±0.14 n-buoh extract 5.78±0.12 H 2 0 extract 2.56±0.21 a Data are expressed as means±se of triplicate experiments. Table III. Radical scavenging effect of prepared fractions from n-buoh extract of persimmon calyx on DPPH method Sample 50% reduction(mg) a α-tocopherol 0.022±0.001 BHA 0.015±0.001 Fraction 1 0.088±0.002 Fraction 2 0.057±0.002 Fraction 3 0.055±0.002 Fraction 4 0.020±0.001 Fraction 5 0.022±0.002 Fraction 6 0.019±0.001 a Amount required for 50% reduction of DPPH(2 10 4, 0.079 mg) solution. Data are expressed as means±se of triplicate experiments. 그결과 Table III 에나타난바와같이 fraction 4, 5 및 6 이 BHA 보다는약하나 α-tocopherol 과는유사한항산화활성을보임으로서항산화활성주성분소분획물임을확인할수있었다. 이들소분획물로부터항산화활성주성분들을분리하기위하여 column chromatography 를연속적으로실시하여 fraction 4 로부터는화합물 1 을 fraction 5 로부터는화합물 2 를 fraction 6 으로부터는화합물 3 을각각분리하였다. 얻어진화합물 1 은미황색분말로 FeCl 3 시험에서녹색을, 아니스알데히드 - 황산시액에서오렌지색을나타내어 flavan 계물질로추정되었고, IR 에서수산기가확인되고 UV 에서벤젠환의존재를확인할수있었다. 또한 1 H-NMR spectrum 에서 sp 2 carbon 유래의 5 개의 signal 이 δ 6.19, 6.40, 6.89, 7.64, 7.74 에서관측되고, 이들 proton signal 의 chemical shift, 분열패턴및 coupling constant 값의비교분석과 TLC 에서의표준품과비교분석한결과화합물 1 은 quercetin 으로추정할수있었다. 최종적으로화합물 1 의기기분석치를표준품및문헌치 23-25) 의 spectral data 와비교분석한결과화합물 1 의구조는 Fig. 1 에나타낸것과같이 quercetin 으로동정하였다. 화합물 2 는 FeCl 3 시액에서청남색으로나타나페놀성화합물임을추정할수있었다. 1 H-NMR spectrum 에서 δ 6.83, 6.76, 6.71 에서 3 치환체의방향족탄소에결합된 3H 의 signal 들이검출되었다. A-ring 의 H-8 과 H-6 으로귀속되는 δ 5.92 와 5.85 의 m-coupled doublet 가확인되었고, δ 4.56 에서 C- ring 의 H-2 signal 이관찰되었으며 δ 3.99 의 H-3 과 coupling constant 가 8.0 Hz 로관측됨으로서 trans coupling 을하고있음을알수있었다. δ 3.99 와 2.84(H-4) 의 signal 양상으로보아화합물 1 은 flavan-3-ol 계통의화합물임을알수있었다. 26) 13 C-NMR spectrum 에서는 aromatic 영역에서 12 개의 carbon peak 와 aliphatic 영역에서 3 개등총 15 개의 carbon signal 을관찰할수있었으며, C-3 에귀속되는 δ 67.7 의
38 Kor. J. Pharmacogn. Table IV. Radical scavenging effect of quercetin, (+)-catechin and gallic acid isolated from persimmon calyx on DPPH method Sample 50% reduction(mg) a α-tocopherol 0.022±0.001 BHA 0.015±0.001 Quercetin 0.016±0.002 (+)-Catechin 0.015±0.001 Gallic acid 0.015±0.002 a Amount required for 50% reduction of DPPH(2 10 4, 0.079 mg) solution. Data are expressed as means±se of triplicate experiments. 결 론 Fig. 1. Structure of compound 1, 2 and 3 isolated from n- BuOH extract of persimmon calyx. hydroxyl carbon signal 을확인할수있었다. 이상의결과를기존문헌의 data 27-29) 와비교하여검토한결과화합물 2 의구조는 Fig. 1 에나타낸것과같이 (+)-catechin 으로동정할수있었다. 화합물 3 은무색의무정형분말로서 FeCl 3 정색시험에서청남색을나타내고, IR spectrum 에서수산기와카르보닐기가확인되고 UV 에서벤젠환의존재를확인함에의해페놀성화합물로추정하였다. 1 H-NMR 에서 δ 7.14 에서 2H 분의 singlet peak 가관측되고, 13 C-NMR 에서 galloyl 기에해당하는피크와 δ 168.5 의고자장영역에서카르보닐기유래의피크가관측됨에의해 gallic acid 로추정할수있었고, 표준품및문헌치 30,31) 와의 spectral data 의비교에의하여 Fig. 1 에서와같이화합물 3 은 gallic acid 로동정하였다. 감꼭지의항산화활성주성분으로단리된 quercetin, (+)- catechin 및 gallic acid 에대해서도항산화활성을 DPPH 법에의해실시한결과 Table IV 에나타낸것과같이 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid 모두대조군인 α-tocopherol 보다는우수하고 BHA 와는유사또는우수한항산화효과를보였다. 따라서이들 3 종의분리된화합물이감꼭지의항산화활성주성분임이명확해졌다. 현대사회는노인층의증가와식습관및환경의급속한변화에따라다양한성인병들이증가되고있으며, 활성산소가각종성인병질환및노화와연관성이있음이보고되어짐에따라이들활성산소를제거또는약화시키는항산화제의개발연구가활발히진행되고있다. 그러나지금까지개발되어진다양한천연및합성항산화제들은독성, 유해성및효능등에서다소미미한점을지니고있다. 이에천연물이나약용식물로부터새로운항산화제를개발하기위한연구의하나로, 본연구는감꼭지 ( 시체 ) 에대하여보다상세한항산화효과의검토와함께항산화활성주성분규명연구를실시한결과다음과같은지견을얻었다. 1. 감꼭지의용매별분획물에대하여 DPPH 법에의한항산화활성과총페놀법에의한폴리페놀성물질의함유량을측정한결과, 감꼭지의 n-buoh 분획물이가장우수한항산화활성을나타내었다. 2. 항산화활성주성분을규명하기위하여우수한항산화효과를나타낸감꼭지의 n-buoh 분획물에대하여항산화활성을검토하면서소분획을실시한결과, 가장높은항산화효과를나타낸 fraction 4 와 fraction 5 및 fraction 6 으로부터각각화합물 1, 화합물 2 및화합물 3 을분리하였다. 3. 분리된화합물 1 과 2, 3 의기기분석치를표준품및문헌치와 spectral data 를비교분석한결과화합물 1 은 quercetin 으로, 화합물 2 는 (+)-catechin 으로, 화합물 3 은 gallic acid 로동정하였다. 4. 감꼭지의항산화활성주성분으로단리된 quercetin, (+)-catechin 및 gallic acid 에대해 DPPH 법에의한 free radical 소거효과를실시한결과, 모두대조군인 α-tocopherol 보다는우수하고, BHA 와는유사또는우수한항산화효과를나타냄으로서이들이감꼭지의항산화활성주성분임이판명되었다.
Vol. 45, No. 1, 2014 39 사 본연구는상지대학교 2012 년교내연구비에의해수행되었으며, 이에감사드립니다. 사 인용문헌 1. Zwart, L. L., Meerman, J. H. N., Commandeur, N. M. and Verneulen, N. P. E. (1999) Biomarkers of free radical damage applications in experimental animals and in humans. Free Rad. Biol. & Med. 26: 202-226. 2. Papa, S. and Skulachev, V. P. (1997) Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging. Mol. Cell Biochem. 174: 305-319. 3. Ahmad, S. (1995) Oxidative stress and antioxidant defenses in biology. Chapman & Hall, New York. 4. Fukuzawa, K. and Takaishi, Y. (1990) Antioxidant. J. Act. Oxyg. Free Rad. 1: 55-70. 5. Halliwell, B. (1991) Drug antioxidant effects. Drugs 42: 569-605. 6. Ceratti, P. A. (1994) Oxy-radicals and cancer. Lancet. 344: 862-863. 7. Halliwell, B. and Gutteridge, J. M. (1984) Lipid peroxidation, oxygen radical, cell damage and anti-oxydant therapy. Lancet. 23: 1396-1397. 8. Lee, Y. S., Joo, E. Y. and Kim, N. W. (2005) Antioxidant activity of extracts from the Lespedeza bicolor. Korean J. Food Preserv. 12: 75-79. 9. Barene, A. L. (1975) Toxicological and biochemistry of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene. J. Am. Oil. Chem. Soc. 52: 59-63. 10. Ito, N., Fukushima, S. and Hasebawa, A. (1983) Carcinogenicity of BHA in F344 rats. J. Natl. Cancer Inst. 73: 343-352. 11. Chan, K. M., Decker, E. A. and Means, W. J. (1993) Extraction and activity of camosine a naturally occurring antioxidant in beef muscle. J. Food Sci. 58: 1-4. 12. Du, L., Shen, Y., Zhang, X., Prinyawiwatkul, W. and Xu, Z. (2014) Antioxidant-rich phytochemicals in miracle berry (Synsepalum dulcificum) and antioxidant activity of its extracts. Food Chem. 153: 279-284. 13. Boligon, A. A., Freitas, R. B., Brum, T. F., Piana, M., Belke, B. V., Rocha, J. B. T. and Athayde, M. L. (2013) Phytochemical constituents and in vitro antioxidant capacity of Tabernaemontana catharinensis A. DC. Free Rad. Antioxid. 3: 77-80. 14. Lee, M. G. and Kim, D. K. (2013) Antioxidant Activities of Bromotopsentin from the Marine Sponge Spongosorites sp. Korean. J. Pharmacogn. 44: 224-181. 15. Lee, D. B. (1974) Illustrated encyclopedca of fauna and flora of Korea Economic plants. 15: 393. 16. Ca, Y. S. Kim, K. A. and Choy, H. S. (2003) Purification and characterization of anti-coagulant activity fraction from Persimmon stem. J. Korean Sos. Food Sci. Nutr. 32: 1323-1327. 17. Cha, B. C. and Lee, E. H. (2013) Ingredients of Tyrosinase and Elastics Inhibitory Activity from Calyx of Diospyros kaki Thunberg. Kor. J. Pharmacogn. 44: 182-187. 18. Kim, H. J., Park, T. S., Jung, M. S. and Son, J. H. (2011) Study on the anti-oxidant and anti-inflammatory activities of sarcocarp and calyx of Persimmon (Cheongdo Bansi). J. Appl. Biol. Chem. 54: 71-78. 19. Uchiyama, M., Suzuki, Y. and Fukuzawa, K. (1968) Biochemical studies of physiological function of tocopheronolactone. Yakugaku Zasshi 88: 678-683. 20. Yoshikawa, M., Harada, E., Miki, A., Tsukamoto, K., Ling, S. Q., Yamahara, J. and Murakami, N. (1994) Antioxidant constituents from the fruit hulls of mangosteen (Garcinia mangostana L.) originating in vietnam. Yakugaku Zasshi 114: 129-133. 21. Turkmen, N., Sari, F. and Velioglu, Y. S. (2006) Effects of extraction solvents on concentration and antioxidant activity of black and black mate tea polyphenols determined by ferrous tartrate and Folin -Ciocalteu methods. Food Chem. 99: 835-841. 22. Atoui, A. K., Mansouri, A., Boskou, G. and Kefalas, P. (2005) Tea and herbal infusions: Their antioxidant activity and phenolic profile. Food chem. 89: 27-36. 23. Yoon, I., Wee, J. H., Moon, J. H., Ahn, T. H. and Park, K. H. (2003) Isolation and identification of quercetin with antioxidative activity from the fruits of Rubus coreanum Miquel. Korean J. Food Sci. Technol. 35: 499-502. 24. Peng, Z. F., Strack, D., Baumert, A., Subramaniam, R., Goh, N. K., Chia, T. F., Tan, S. N. and Chia, L. S. (2003) Antioxidant flavonoids from leaves of Polygonum hydropiper L. Phytochemistry, 62: 219-228. 25. Witting, J., Herderich, M., Graefe, E. U. and Veit, M. (2001) Identification of quercetin glucuronides in human plasma by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatography B. 753: 237-243. 26. Morimoto, S., Nonaka, G. I., Nishioka, I., Ezaki, N. and Takizawa, N. (1985) Tannins and related compounds. XXIX. Seven new methyl derivatives of flavan-3-ols and 1,3-diarylpropan-2-ol from Cinnamomum cassia, C. obusifolium and Lindera umbellata var. membranacea. Chem. Pharm. Bull. 33: 2282-2286. 27. Park, H. W. and Kim, D. K. (2005) Tannin components from the twigs of Vaccinium oldhami Miquel. Kor. J. Pharmacogn. 36: 191-194. 28. Kim, N. Y., Choi, J. H., Kim, Y. G., Jang, M. Y., Moon, J. H., Park, G. H. and Oh, D. H. (2006) Isolation and Identification of an antioxidant substance from ethanol extract of wild grape (Vitis coignetiea) seed. Korean. J. Food Sci. Technol. 38: 109-113.
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