ORIGINAL ARTICLE Korean J Clin Lab Sci. 2016, 48(1):15-21 http://dx.doi.org/10.15324/kjcls.2016.48.1.15 pissn 1738-3544 eissn 2288-1662 Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 1, Mar. 2016 15 Study of Aspergillus Species from Clinical Specimen Isolate Jang Ho Lee 1 and Bon-Kyung Koo 2 1 Department of Clinical Laboratory Science, Semyung University, Jecheon 27136, Korea 2 Department of Laboratory Medicine, Samsung Medical Center, Seoul 06351, Korea 임상검체에서분리된 Aspergillus Species 의연구 이장호 1, 구본경 2 1 세명대학교임상병리학과, 2 삼성서울병원진담검사의학과 Aspergillus is the most common opportunistic fungus causing infection. Aspergillus is the most morphologically identified in the laboratory. Recently, molecular genetic methods have been proposed for identification of fungi that unidentified morphologically or identified genus level. Of 475 cases of Aspergillus isolated from clinical specimens, there were Aspergillus fumigatus 257 (54.1%), A. niger 101 (21.3%), A. flavus 43 (9.1%), A. terreus 29 (6.1%), Aspergillus nidulans 2 (0.4%), Aspergillus clavatus 1 (0.2%), and the Aspergillus species 42 (8.8%). Eleven cases of unidentified or identified at the genus level included Aspergillus fumigatus 5, Aspergillus falvus 1, Aspergillus terreus 1, and Aspergillus lentulus 1 was identified in the sequencing of the strain level. It was identified as Aspergillus versicolor 2, and Emericella parvathecia 1. 92.2% of Aspergillus was identified as a possible morphological, 8.8% could not be identified at the species level. Sequence-based molecular analysis using the ITS and D1D2 is considered useful for identification of the species level. Keywords: Aspergillosis, Aspergillus, Sequence-based molecular analysis Corresponding author: Jang Ho Lee Department of Clinical Laboratory Science, Semyung University, 65 Semyung-ro, Jecheon 06351, Korea Tel: 82-43-649-1620 Fax: 82-43-649-7361 E-mail: jh56lee@semyung.ac.kr This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright 2016 The Korean Society for Clinical Laboratory Science. All rights reserved. Received: February 17, 2016 Revised: February 24, 2016 Accepted: February 25, 2016 서론아스페르길루스증 (aspergillosis) 은 Aspergillus 속의진균감염에의한질환을의미하며, 사람감염을일으키는사상균류중가장흔하며, 기회감염으로발생된다 [1,2]. 호중구감소증, 고용량의스테로이드사용, 항암치료등이주요위험요인으로폐, 부비동, 귀, 눈, 피부, 점막등거의모든조직을침범할수있으나, 부비동및폐감염이가장흔하다 [1,3]. 침습성 aspergillosis 는장기이식후발생하는경우에는장기마다발생률의차이가있으며특히심한면역억제상태의환자는사망률이매우높다 [1,3-5]. Aspergillosis 의진단은다양한방법으로이루어진다. 임상검체 에서배양되면대부분형태학적으로 Aspergillus 여부및균종을구분할수있다 [1]. Sabouraud dextrose agar 등진균배지에서대부분의균종은 3일내신속히성숙되나일부균종은느리게배양된다. 집락은처음에는흰색이나점차녹색, 연두색, 오렌지색, 갈색, 검은색등으로변하며균종에따라차이가난다 [1,2]. 그러나균의수가적거나항진균제치료중인경우배양검사에서배양되지않을수있다. 조직에서의직접검사도도움이되지만격막이있는균사를가진다른사상형진균과구분하기어렵다는단점이있다 [1]. Aspergillus 항체는알레르기성기관지폐아스페르길루스증이나 fungal ball이있는환자에서양성으로나타난다. Aspergillus 항원은면역결핍자의침습성감염을검출하는표지자로사용된다.
16 Jang Ho Lee and Bon-Kyung Koo. Study of Aspergillus Species from Clinical Specimen Isolate Table 2. Results of fungus culture from clinical specimen in a single institution Growth No. Yeast Dermatophytes Aspergillus Other Mold Mycobacterium 4,984 3,396 857 475 242 14 68.1% 17.2% 9.5% 4.9% 0.3% Table 1. Number of fungus culture of clinical specimen in a single institution Specimen Number No growth (%) Growth (%) Total specimen 98,697 91,523 (92.7) 7,174 (7.3) Except repeat specimen 51,462 46,479 (90.3) 4,984 (9.7) Galactomannan 이대표적인표지자로 aspergillosis 환자의혈청이나체액에서검사된다. 혈청이나 bronchoalveolar lavage (BAL) 에서의양성은주로고위험군의침습성 aspergillosis 와관련이있다. 그러나위양성에주의해야하며침습성감염의초기에는위음성을보일수있으므로열이나는호중구감소증환자에서는반복적으로검사한다 [1,4,6,7]. Aspergillus 균종은환경에널리분포하며검사실에서오염균으로배양되기도한다. Aspergillus는대략 180여종이알려져있으며, 검사실에서 Aspergillus 가배양되면대부분형태학적으로동정하며동정되는균종은 A. fumigatus, A. niger, A. flavus, A. terreus 등몇가지가대부분이다. 검사실에서는형태학적으로종수준까지동정하기까다로운균종인경우 Aspergillus species로보고하며, 이경우종수준의정확한동정을위하여염기서열분석등분자유전학적동정을필요로한다 [1,2,8,9]. 본연구의목적은임상검체에서분리된 Aspergillus의형태학적특성과염기서열분석의유용성에대하여보고하고자한다. 재료및방법 1. 연구대상 2008년 1월부터 2012년 12월까지서울소재의대형병원미생물검사실에의뢰된 98,697개의임상검체를대상으로중복의뢰로분리된균주를제외한 51,462건의배양검사에서분리된 4,984건의진균의종류와분리빈도를분석한자료에서 Aspergillus species로동정된 475건을형태학적으로동정된결과를기준으로, 형태학적으로종수준의동정이불가능하고, 임상적의의가있는균종을대상으로종 (species) 수준까지분자유전학적인방법으로동정하여형태학적분석자료와비교하였다 (Table 1, 2). Table 3. Result of 475 Aspergillus species of clinical specimen in a single institution Name Number Rate Aspergillus fumigatus 257 54.1% Aspergillus niger 101 21.3% Aspergillus flavus 43 9.1% Aspergillus terreus 29 6.1% Aspergillus nidulans 2 0.4% Aspergillus clavatus 1 0.2% Aspergillus species 42 8.8% 2. 연구방법 1) 진균의배양과동정 (Culture and identification of fungi) 진균배양을위한검체는병실에서검체를채취하여검사실로의뢰되면 Sabouraud dextrose agar (Hanil Komed Co., Korea) 에접종하여 30 o C에서 3일간배양하고검체에따라무균검체는실온 (23 26 o C) 에서 3주간배양하였고, 오염된비뇨생식기, 호흡기, 그리고소화기검체는실온에서 10일간배양하였다. 피부과에서의뢰하는검체는피부과처치실에서채취하여바로 MYCO-B agar (SDA with chloramphenicol and cycloheximide, Hanil Komed Co., Korea) 에접종하여검사실로보내오면실온에서 3주동안배양하였다. 배양된사상균의형태학적인동정은증식속도와색깔, 그리고형태등을관찰하고충분히자란것으로확인되면스카치테이프를이용하여도말슬라이드를만들어 lactopheol cotton blue (LPCB) 로염색하여광학현미경으로균사와분생자 (conidia) 의모양과배열의특성으로동정하였고. 일부형태학적구분이어려운균종은슬라이드배양을추가로시행하여형태학적동정을시행하였다. 2) 염기서열분석 (Sequencing) 분자유전학적동정은형태학적으로동정이불가능하거나형태학적으로유사하여동정이까다로운균주를대상으로종 (species) 수준까지동정을 sequencing 방법으로시행하였다. DNA 분리는자동핵산추출기 MagNA pure LC 1.0 (Roche Diagnostics Corp,. Japan) 를이용하여충분히성장한진균의집락을 phosphate buffered saline (PBS) 완충액에충분한량을풀어서 MagNA pure LC total nucleic acid isolation kit에서제공하는 bacterial lysis 완충액과 proteinase K를균희석액과혼합한후 65 o C에서 10분
Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 1, Mar. 2016 o 17 간 반응시키고, 95 C에서 10분간 끓인 후 식혀주었다. 전 처리된 PCR은 thermal cycler model 9700 (Applied Biosystems 검체는 magnetic-bead technology 원리를 이용한 MagNA pure Inc,.)를 이용하였고, 증폭된 산물의 염기서열 분석은 BigDye LC 1.0 장비로 chatropic salt를 포함하는 buffer에 반응시켜 terminator cycle sequencing ready reaction kit (Applied lysing 시킨 후, magnetic glass particles (MGPS) 표면에 DNA를 Biosystems Inc.)와 API Prism 3100 genetic analyzer (Applied 부착시키고 세척 과정을 거쳐 이물질이 제거된 순수 DNA를 분리 Biosystems Inc.)을 이용하였다. 증폭을 위한 표적부위로 ITS, 하였다. D1/D2, -tubulin을 선택하였으며, 시발체의 염기서열은 CLSI 가 Fig. 1. Morphology of Aspergillus clavatus, A. nidulans and A. versicolor. (A) Aspergillus clavatus colony and microscopic morphology (LPCB 400), (B) Aspergillus nidulans colony and microscopic morphology (LPCB 400), (C) Aspergillus versicolor colony and microscopic morphology (LPCB 400).
18 Jang Ho Lee and Bon-Kyung Koo. Study of Aspergillus Species from Clinical Specimen Isolate 이드라인 MM18-A를참조하였다. 염기서열상동성분석을위한데이터베이스로는 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ genbank/) 를이용하여퍼센트일치도를산출하였다. 결과 1. 형태학적인동정연구대상기간동안진균배양으로의뢰된 98,697건의배양검사에서 7,174건 (7.3%) 의검체에서진균이배양되었고, 한환자에서의뢰된중복검체를제외하면 4,984건 (9.7%) 의환자에서진균이배양되었다. 진균이배양된 4,984건을분석한결과효모균 3,396건 (68.1%), 피부사상균 857건 (17.2%), Aspergillus species 475건 (9.5%), 그외진균 242건 (4.9%), 그리고진균은아니지만항상성균이 14건이분리동정되었다 (Table 1, 2). 형태학적으로속 (genus) 과종 (species) 의동정이가능한균종은 Aspergillus fumigatus 257주 (54.1%), A. niger 101주 (21.3%), A. flavus 43주 (9.1%), A. terreus 29주 (6.1%), Aspergillus nidulans 2주 (0.4%), Aspergillus clavatus 1주 (0.2%) 이었다. 형태학적으로종구분할수없는 Aspergillus species는 42주 (8.8%) 이었고 Aspergillus fumigatus, A. niger, A. flavus, A. terreus는 LPCB 도말슬라이드의현미경관찰로속을구분하고집락의색깔로종을구분하였다. Aspergillus nidulans와 Aspergillus clavatus는집락의색깔로는구분할수없었고, LPCB 도말슬라이드의현미경관찰로종특성을찾아구분하여동정하였다 (Table 3, Fig. 1). 2. 염기서열분석 (Sequencing) 형태학적으로동정된결과를기준으로동정이불가능한진균, 형태학적으로유사하여동정이까다로운균주, 종 (species) 수준까지동정이요구되는진균을대상으로염기서열분석을시행하였다 (Table 4). Aspergillus species 8 균주를분석한결과 Aspergillus fumigatus 5주, Aspergillus falvus (ITS 98%) 1주, Aspergillus terreus (ITS 98%) 1주, 그리고 Aspergillus lentulus (ITS 100% D1D2 100%) 로동정되었다. Aspergillus fumigatus 5주는 4주에서 ITS 100% (2주) 와 99% (2주) 의결과를보였으며, 1주는 D1D2 에서 99% 를보였다. 미동정균주 1주와 Scopulariopsis sp. 로보고되었던 1주는 Aspergillus versicolor (ITS 100%, D1D2 100%) (Fig. 1) 로동정되었으며, Unidentified mold 1주는 Emericella parvathecia (ITS 100%, -tubulin 99%) 로동정되었다. Table 4. Phenotypic and Sequence-based molecular analysis data for 11 isolates Sequencing analysis ITS D1D2 -tubulin Microscopic Morphological ID Specimen Scequencing ID Accession No. Identity Accession No. Identity Accession No. Identity Transtracheal aspi Aspergillus spp. A. falvus JQ763433.1 531/542 (98%) Bronchial washing Aspergillus spp. A. fumigatus JX231005.1 402/402 (100%) JX174044.1 308/308 (100%) Bronchial washing Aspergillus spp. A. fumigatus JX231009.1 430/430 (100%) Sputum Aspergillus spp. A. fumigatus JX174044.1 410/411 (99%) Sputum Aspergillus spp. A. fumigatus JX232279.1 558/562 (99%) HQ285593.1 496/512 (97%) Sputum Aspergillus spp. A. fumigatus HQ392478.1 414/415 (99%) EndoTracheal Aspergillus spp. A. lentulus JN943567.1 361/361 (100%) JX174044.1 324/324 (100%) Discharge, ear Aspergillus spp. A. terreus EF567982.1 451/454 (99%) Fingernail Unidentified A. versicolor JX401544.1 450/450 (100%) HE820800.1 450/450 (100%) Tissue Scopulariopsis spp. A. versicolor AJ937750.1 584/584 (100%) AJ937751.1 597/597 (100%) Skin Swab Unidentified E. parvathecia GU594759.1 384/384 (100%) AB243111.1 469/470 (99%)
Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 1, Mar. 2016 19 고찰임상검체에서진균이배양되면대부분형태학적으로 Aspergillus 여부및균종 (species) 을구분할수있다. 형태학적으로종수준까지동정하기까다로운균종인경우 Aspergillus species로보고하며, 종수준의정확한동정이요구된다면염기서열분석등분자유전학적동정을한다. 본연구에서 Aspergillus 균종은효모균을포함한전체배양양성진균 46,479 주중에 475주로 14.4% 이며, 효모균과피부사상균을제외한사상균 717주중에 475주로 66.2% 가분리되었다. 457 주의 Aspergillus 균종은 Aspergillus fumigatus가 257주 (54%) 로가장많이분리된것으로나타나, 최근에국내에서 Heo 등이발표한 42.6% 와는모집단이달라약간의차이는있지만가장많이분리되는균종으로유사하게나타났다 [9]. Aspergillus 균종의동정에서집락의색깔과 Lactophenol cotton blue (LPCB) 도말슬라이드의현미경관찰에의한형태학적으로동정이가능한균종은 Aspergillus fumigatus, A. niger, A. flavus, A. terreus, A. nidulans, 그리고 A. clavatus 이었으며, A. fumigatus, A. niger, A. flavus, A. terreus 는 LPCB 도말슬라이드에서현미경으로분생포자 (conidia) 가소낭 (vesicle) 에형성되어있는형태로 Aspergillus를확인한후집락의색깔로동정이가능하나, A. clavatus, A. nidulans, 그리고 A. versicolor는집락의색깔과관계없이현미경적형태로동정이가능하다 [1,2]. 형태학적인동정에서가장흔하게분리되는 Aspergillus fumigatus는 SDA 배지에서납작하고벨벳또는솜털같은모양의집락으로 3 5 일이내에빨리자라서성숙된다. 집락의앞면색깔은엷은녹색, 청록색, 녹갈색을보이며, 집락의가장자리는하얗고, 뒷면은흰색이거나베이지색을보였다. 현미경소견에서는균사는투명하고격막이분명하며, 둥근열매구조가사슬형태로보이는데, 부풀어오른소낭 (vesicle) 의상부 2/3 부분에방사형태로경자 (phialides) 가덮이고여기에서둥근분생포자 (conidia) 가생성되어있다 [1,2,10]. Aspergillus niger의특징은 SDA에서대부분 3일내에빨리자라며, 집락은양털같으며처음에는흰색을보이다가분생포자가생성됨에따라검은색으로변한다. 대부분성장하면서방사상의균열 (fissure) 을보이며, 집락의뒷면은흰색또는연노란색을띠었다. 현미경적소견에서는균사는투명하고격막이분명하다. 분생자병 (conidiophore) 은길고부드럽고투명하며끝쪽으로가면서어두운색으로구형의소낭을형성한다. 소낭의모든부분은기저경자 (metula) 와그위에형성된경자의끝에서분생포자가생성되며어두운갈색또는검은색으로매우거친양상의구형으로보인다 [1,2,11,12]. A. flavus의집락은빨리자라 3 5 일이내에성숙되며, 벨벳또는솜털같은집락이방사성으로생성되며처음에는노란색을띠다가시간이지남에따라황록색또는올리브색으로변한다. 가장자리에하얀경계가있다. 집락의뒷면은노란색내지는황갈색으로보인다. 현미경적소견에서균사는격막이있으며, 분생자병은길고성숙하면소낭바로밑부분에가시가있는듯거칠어진다. 소낭은전체적으로경자에의해느슨하게둘러싸여방사형으로보인다. 경자의끝에서생성된분생포자는구형으로부드럽거나아주미세하게거칠며, 방사형사슬 ) 모양으로배열되어있다. A. fumigatus는소낭의상부 2/3 정도가경자에의해덮여있는반면, A. flavus는소낭의전체를경자가덮어있으며경자는모든방향으로뻗어있다 [1,2,6]. A. terreus도 SDA에서빨리자라 3일이내에성숙된다. 집락의표면은베이지색또는계피색, 황갈색이며, 벨벳 (velvety) 또는가루같은 (powdery) 성상을보이며, 뒷면은노란색또는황갈색이다. 현미경적소견에서균사 (hyphae) 는투명하고격막이분명하며, 분생자병은부드럽고상대적으로짧은편이다. 분생자병끝부분에서생성되는둥근소낭의상부 1/2 정도위로기저경자가덮이고, 이열의경자에구형의분생포자 (conidia) 가생성된다. 또한균사의측면에서분생자병과관계없이둥글고투명한분생포자가단독으로관찰되기도한다 [1,2,13,14]. A. nidulans, A. clavatus, 그리고 Aspergillus versicolor는집락의색깔과관계없이균종의형태적특성을알면현미경적으로형태학적동정이가능하다. A. nidulans는다른 Aspergillus 종들과마찬가지로 SDA 등진균배지에서잘자란다. 집락의질감은벨벳같고어두운녹색을띠며, 오래배양하면유성생식형태인자낭구 (cleistothecia) 가생성되는부위에서는담황색내지는노란색을보이고, 뒷면은붉은빛을띠는갈색으로보인다 [1,2]. 현미경적소견에서균사는투명하고격막이분명하고, 분생자병짧고갈색을띠며, 분생자병의끝에있는소낭은작고반구형으로상부에경자와기저경자가있으며, 분생포자는약간거친구형으로보인다. 그리고균사의주변에는주로뭉쳐있는두꺼운벽을가진 Hulle cells 이다수관찰된다 [1,15]. A. nidulans 감별에중요한특징은갈색의짧은분생자병과 Hulle cells이다. Hulle cells은 A. nidulans, A. calidoustus, A. versicolor 에서보일수있으나 A. calidoustus에서는길고불규칙한모양으로보이는데반해, A. nidulans와 A. versicolor의 Hulle cells은둥근구형이다 [2]. A. nidulans와 A. versicolor는모두 biseriate( 이열 ) 경자를가지고있으나 A. versicolor는분생자병끝에소낭이있는것과 Penicillium species 처럼소낭이없이분생자병에경자에분생자가사슬모양
20 Jang Ho Lee and Bon-Kyung Koo. Study of Aspergillus Species from Clinical Specimen Isolate 으로생성되는것으로구별할수있다. 또한 A. versicolor는유성생식형태의자낭구를자연적으로생성하지않지만, A. nidulans에서는자낭구가종종자연적으로생성된다 [1,2,4]. A. clavatus는집락은몇일내에빠르게성숙되고표면은벨벳 (velvet) 으로집락은파란빛을띠는녹회색을보이며가장자리는흰색으로, 시간이지나면분생포자가파랗게배지위로퍼져나간다. 배지뒷면은흰색내지황갈색을띤다. 현미경적소견에서긴분생자병과방망이모양 (clavate-shaped) 의매우큰소낭 (vesicle) 이관찰된다. 소낭은단층 (uniseriate) 의경자 (phialide) 에의해빽빽하게덮여있고분생포자는구형또는난원형이다. 이러한분생자머리 (conidial head) 는 A. clatvaus의매우특징적인소견이다 [1,2,16]. Aspergillus versicolor는다른 Aspergillus 종들보다좀천천히자라지만 5 7 일내에성숙한다. 갖가지색을뜻하는 versicolor 의의미처럼집락의색은다양할수있으나주로녹색또는황갈색을보이며성숙되면집락내에흰색의가장자리안쪽으로노란색이보인다. 집락의크기는다른 Aspergillus spp. 에비하여작은편이며, 배지뒷면은흰색, 황색또는적색이다. 특히배양초기에는 vesicle 이생성되지않고바로분생자병에끝에분생자가생성되어 Penicillium spp. 또는 Scopulariopsis spp. 로혼동될수도있다. 하지만오랫동안배양을하면소낭에서기저경자와이열방사배열 (biseriate) 경자에거칠고구형의분생포자와 A. nidulans와비슷하게 Hulle cells이관찰될수도있다 [1,2,17]. 진균의분자유전학적동정은대개 PCR을기반으로제한절편길이다양성 (RFLP), 교잡법 (hybridization), 염기서열분석 (sequencing) 등이사용되고있으며, 이중에서염기서열분석법이 gold standard 로받아들여지고있다 [8,18]. 본연구에서시행한염기서열분석에서는증폭을위한표적부위로 ITS, D1D2, 그리고 - tubulin을선택하여형태학적으로종수준의동정이불가능했던 Aspergillus species 8 균주와미동정 2 균주, 그리고 R/O Scopulariopsis species 로보고되었던 1주를포함한 11 균주중에서 10 균주가 ITS에서상동성이 98 100% 를나타냈고, 5 균주에서 D1D2에서 99 100% 의상동성을보였다. ITS에서동정된균주는 Aspergillus fumigatus가 5주로가장많았고, Aspergillus falvus, Aspergillus terreus, 그리고 Aspergillus lentulus가각각 1주씩종수준까지동정되었고, Aspergillus versicolor는 2주모두 ITS와 D1D2에서 100% 상동성을나타냈다. 형태학적검사에서분생자가생성되지않아미동정균주로보고되었던 1주는 Emericella parvathecia로 ITS 100%, -tubulin 99% 의상동성을보였다. Aspergillus parvathecia. 의 teleomorph로알려져있는 Emericella parvathecia는 brownish-green colony로뒷면은 purplish로관찰되며현미경상에서는 ascospore 를관찰할수있는균종으로알려졌으나임상적의의는분명치않다고알려져있다 [19]. 임상검사실에서진균의정확동정은 Aspergillus 뿐만아니라모든진균에서환자의진단과치료의근거를제공하는중요한정보이다. 과거에는침습성 aspergillosis 의치료에 amphotericin B가 gold standard로생각되었으나, 최근의보고들에의하면균종에따라항진균제의선택과용량이고려되므로 [1,12] 형태학적동정과더불어종수준의동정이요구되는경우염기서열분석을시행하면많은유용성을제공할것으로사료된다. 요약 Aspergillus는가장흔하게감염을일으키는기회감염균이다. 검사실에서 Aspergillus의동정은대부분형태학적으로이루어진다. 최근에는형태학적으로동정이안되거나, 속수준까지만동정이되는까다로운균들동정하기위하여분자유전학적인방법들이제안되고있다. 임상검체에서분리한 475건의 Aspergillus는 Aspergillus fumigatus 257주 (54.1%), A. niger 101주 (21.3%), A. flavus 43주 (9.1%), A. terreus 29주 (6.1%), Aspergillus nidulans 2주 (0.4%), 그리고 Aspergillus clavatus 1주 (0.2%), 그리고 Aspergillus species는 42주 (8.8%) 이었다. 미동정균주와종구분을위한 11건의염기서열분석에서는 Aspergillus fumigatus 5주, Aspergillus falvus 1주, Aspergillus terreus 1주, Aspergillus lentulus 1주동정되었다. Aspergillus versicolor 2주, 그리고 1주는 Emericella parvathecia로동정되었다. Aspergillus의 92.2% 는형태학적으로동정이가능하였고, 8.8% 는종수준의동정이불가능하였다. 종수준의동정을하기위해서는 ITS와 D1D2를이용한염기서열분석이유용한것으로사료된다. Acknowledgements: 이논문은 2015학년도세명대학교교내학술연구비지원에의해수행된연구임. Fundings: None Conflict ofinterest: None References 1. Lee NY, Heo HJ, et al. Clinical cases in medical mycology. 1st ed. Seoul; Panmun education. 2015. p133-172. 2. Larone DH, editor. Medically important fungi: A guide to identification. 5th eds. Washington DC. ASM Press. 2011. 3. Koulenti D, Garnacho-Montero J, Blot S. Approach to invasive
Korean J Clin Lab Sci. Vol. 48, No. 1, Mar. 2016 21 pulmonary aspergillosis in critically ill patients. Curr Opin Infect Dis. 2014;27:174-183. 4. Kim YK, Hong SR, Kim SH, Seo CW. Availability if identification by RAPD of Aspergillus species from sputum. Korea J Clin Lab Sci. 2009;41:158-166. 5. Ki HK, Koh JH, Kang SJ, Kim SW, Lee H, Kim S, et al. Invasive aspergillosis after solid organ transplantation. 1999;31:500-505. 6. Krishnan S, Manavathu EK, Chandrasekar PH. Aspergillus flavus: an emerging non-fumigatus Aspergillu species of significance. Mycoses. 2009;52:206-222. 7. Perfect JR. Fungal diagnosis: how do we do it and can we do better? Curr Med Res Opin. 2013;29(Suppl 4):3-11. 8. Jang JH, Lee JH, Ki CS, Lee NY. Identification of clinical mold isolates by sequence analysis of the internal transcribed spacer region, ribosomal large-subunit D1/D2, and -tubulin. Ann Lab Med. 2012;32:126-132. 9. Heo MS, Shin JH, Choi MJ, Park YJ, Lee HS, Koo SH, et al. Molecular identification and amphotericin B susceptibility testing of clinical isolates of Aspergillus from 11 hospitals in Korea. Ann Lab Med. 2015;35:602-610. 10. Dagenais TR, Keller NP. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in invasive aspergillosis. Clin Microbiol Rev. 2009;22:447-465. 11. Oda M, Saraya T, Wakayama M, Shibuya K, Ogawa Y, Inui T, et al. Calcium oxalate crystal deposition in a patient with aspergilloma due to Aspergillus niger. J Thorac Dis. 2013;5:E174-178. 12. Arendrup MC. Update on antifungal resistance in Aspergillus and Candida. Clin Microbiol Infect. 2014;20:S42-48. 13. Hachem R, Gomes MZ, El Helou G, El Zakhem A, Kassis C, Ramos E, et al. Invasive aspergillosis caused by Aspergillus terreus: an emerging opportunistic infection with poor outcome independent of azole therapy. J Antimicrob Chemother. 2014; 69:3148-3155. 14. Pastor FJ, Guarro J. Treatment of Aspergillus terreus infections: A clinical problem not yet resolved. Int J Antimicrob Agents. 2014;44:281-289. 15. Henriet SS, Verweij PE, Warris A. Aspergillus nidulans and chronic granulomatous disease: a unique host-pathogen interaction. J Infect Dis. 2012;206:1128-1137. 16. Opal SM, Reller LB, Harrington G, Cannady P Jr. Aspergillus clavatus endocarditis involving a normal aortic valve following coronary artery surgery. Rev Infect Dis. 1986;8:781-785. 17. Huh HJ, Lee JH, Park KS, Jun TG, Kang IS, Kim YJ, et al. A case of misidentification of Aspergillus versicolor complex as Scopulariopsis species isolated from a homograft. Ann Clin Microbiol. 2013;16:105-109. 18. Summerbell RC, Levesque CA, Seifert KA, Bovers M, Fell JW, Diaz MR, et al. Microcoding: the second step in DNA barcoding. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2005;360:1897-1890. 19. Zohri AA. Progesterone transformation as a biochemical aid in classification of the genus Emericella. Folia Microbiol (Praha). 2000;45(5):391-396.