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학술원논문집 ( 자연과학편 ) 제 52 집 1 호 (2013) 1-21 해양천연물 : 1세기간유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 金容海 * 1) Marine Natural Product : Puffer Fish poison (Tetrodotoxin) and the Analogous Derivatives Kim, Yong Hae * ABSTRACT Puffer fish poison (Tetrodotoxin ; TTX) which is known as a potent neurotoxin of an organic compound has been intensively studied due to the interesting biological activities. The TTX has been early known since thousand years ago in the period of Shun Nung emporor (2838-2698 B.C.) in China and in the ancient Egypt : there are discriptions for the TTX to be used as a medicinal drug. TTX has been found not only from the puffer fish but also from the various marine animals in the various places; from tiger salamandar in the near Stanford University Campus, California, America, from newts in Okinawa, Japan, from frogs' skin in Costa Rica in the Central America, from Octopus in * 大韓民國學術院自然科學部第 1 分科會員접수일 2013 년 7 월 23 일 - 1 -

2 金容海 the Australian coast, from goby fish in the Amami Oshima, Japan, and from goby fish in the Western coast of California, America. The toxins isolated from these marine animals have been elucidated to have the same structure of TTX. A new chiriquitoxin (CHTX) was isolated from Atelopus chriquiensis frogs'skin in the Costa Rica, Central America together with TTX : the chiriquiensis frogs contain two toxins. CHTX is a new derivative of TTX and has a high molecular weight. The biological activity of CHTX is about same to that of TTX. The structure and biological activities are described. The origin of TTX is intriguing. The venom of snakes' toxins has a protein structure. But TTX is an organic compound. The antitoxin of venom has been developed. But TTXs' antitoxin is not yet established. The origin of TTX is not yet elucidated. There is a possible origin of TTX caused by a symbiotic microorganism (bacteria). 초 록 복어독 (Tetrodotoxin : TTX) 은강력한신경계독성유기화합물질로서오랫동안연구의대상이되어왔다. 복어독 (TTX) 은흥미있는생리활성을보여주며또한그구조식도특이해서병리학자, 생화학자뿐만아니라유기화학자에게도흥미있는연구대상이되어왔다. 복어독 (TTX) 이알려진역사는수천년이되며, 중국의 Shun Nung 황제 (2838-2698, B.C.) 때, 고대이집트시대에의약으로도사용되었다는기록이있다. 이복어독 (TTX) 은복어뿐만아니라여러해양동물부터도발견되어져왔다. 그발생원인과지역도매우흥미롭다. 미국캘리포니아스탠포드대학캠퍼스부근과, 일본오끼나와에서식하는도마뱀, 중남미의코스타리카계곡에서식하는개구리 (Atelopus Chiriquiensis) 의껍질, 오스트레일리아의해안의문어, 일본의아마미오시마해안과미국캘리포니아태평양해안의고비물고기 (Goby fish) 등으로부터복어독 (TTX) 과똑같은구조를가진물질이발견되고있다. Costa Rica의 Atelopus Chirisquiensis 개구로부터는복어독 (TTX) 과복어독보다분자량이큰새로운유도체인 Chiriquitoxin 이처음으로발견되어, 흥미있는생리활성을보여주고있다. 구조식의결정과생리활성에대해서기술한다. 복어독 (TTX) 은단백질구조를가진뱀독과달리유기화학물질이다. 뱀독의해독제는개발되어있는데, 복어독 (TTX) 의해독제는아직개발되고있지않다. 복어독 (TTX) 의발생원인에대해서는아직명료하게증명되어있지않지만박테리아의공생에의한설이받아드려지고있다. - 2 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 3 차 례 Ⅰ. 머리말 Ⅱ. 해양천연물 Ⅲ. 복어독 (Tetrodotoxin : TTX) 참고문헌 Ⅰ. 머리말 복어로부터분리된 Tetrodotoxin (TTX) 은가장강력한독성물질의하나이며단백질이아닌유기화학물질이다. 그구조식이특이하며, 특히신경계독성물질이므로생리학, 병리학적으로매우흥미있는화합물이여서, 생화학과병리학자들에의해서꾸준히흥미있는연구대상의물질이되어왔다. TTX의발견은오래전부터이집트 1 나중국 2 에서거론되고있었다. 중국에서는 Shun Nung 황제때 (2838-2698.B.C) 복어알이의약품으로사용했다는기록이있고, 복어독 (TTX) 에대해서는 Engelbent Kaempfers History Japan이알려지고있다. TTX의분리, 정제, 약리작용의연구가이루어지는데는여러가지기기의개발이뒷받침하고있다. TTX가문헌에나타난이후, 정제, 약리작용등이알려지고, 그구조가결정되고, 전합성이이루어지기까지 100여년이걸렸으므로, 천연물유기화학에서는 1 세기의유기화합물이라고불러지고있다. 맹독의복어와많은다른일본의생활에대한기록은 Engelbent Kaempfers Japanese life (London in 1727) 3 에의해서발표되고있다. 최근에들어서복어독 (TTX) 의구조가결정되고, 유기화학자들에의해전합성도이루어졌다. 4-6 독성물질에대해서많은연구들이전세계적으로이루어졌고, TTX가복어뿐만아니라미국캘리포니아스탠포드근처에서의도마뱀이일종인 Taricha Torosa 7, 일본오키나와에서서식하는도마뱀, 오스트레일리아해변에서식하는문어, 중남미에만서식하는 Atelopus종외개구리, 일본의아미미오시마의작은 Goby 물고기, 캘리포니아서해안. Montray 해안부근에서포확된 Goby 물고기에서도똑같은 TTX가발견되어매우흥미롭다. 중남미의코스타리카, 콜롬비아, 파나마에서만서식하는 Atelopus종의개구리에서도 TTX가발견되었는데, 코스타리카의 Atelopus Chinquiensis 개구리피부로부터 - 3 -

4 金容海 맹독인, TTX와함께 TTX의유사물질인 Chiriquitoxin (CHTX) 이발견되어저자들에의해서구조가결정되었다. 8-10 CHTX는 TTX보다분자량이큰유일한신물질임을밝혔다. 11 CHTX는생리활성인 Na 찬넬을차단하는효과가있을뿐만아니라, K 찬넬도차단하는효과가있어서매우흥미있는물질로주목받고있다. 12 끝으로이런신경계독인 TTX가여러해양동물에서생성한다는사실이매우흥미롭다. 여러원인들이제기되고있으나현재로는먹는먹이에의해서생성된다는설보다는박테리아에의해서동물체내에공생한다는설이여러가지실험과관찰에의해서주목받고있다. Ⅱ. 해양천연물 천연물화학이발전, 파생해서유기화학및생화학분야로전개되어왔는데, 해양천연물은형태상으로볼때육지의천연물과거의유사하다. 그러나최근자료수집이기기발달, 수집기술이발달되어급속히해양천연물화학, 생화학, 분자생물학에많은영향을끼치고있다. 해양천연물이육지천연물과큰차이는대사물질등이할로겐 (F, Cl, Br, I) 을많이포함하고있고, 흥미있는생리활성물질들이육지천연물보다훨씬많은것이특징이다. 세계적으로대학, 연구소들이해양연구소 (Marin Station) 를세우고해양천연물연구에몰두하고있다. 참고로해양천연물의생물계통발생학을나무로나태나는그림을소개한다 ( 그림 1). 박테리아로출발해서개구리, 뱀, 게, 물고기까지진화하는그림이다. 해양식물로부터분리되는물질들은육지식물로부터분리되는물질들과종류, 형태는거의비슷하나개개의화합물들이포함하고있는관능기 (Functional Groups) 들은매우다른화합물들이많다. 예를들면브롬 (Br) 을포함하는해양천연물들이많은것이특징인데, 브롬을포함하고있는화합물들은화학적성질뿐만아니라생리작용도다른화합물질들이많이알려지고있다. 육지동 식물의천연물들에비해많은해양동 식물들이흥미있는약리장용을가지고있는것들이계속발견되고있는데, 해양천연물에대한연구가활발히이루어 - 4 -

해양천연물 : 1세기 유기 화합물로 알려진 복어독 (Tetrodotoxin) 및 유사물질 5 지고 있는 것은 이러한 이유에서이다. 특히 복어독 (Tetrodotoxin)이 특이한 구조를 가진 유기 화합물로서 신경계 맹독이라는 점이 특이한 예이다. 심장계 독을 가진 뱀은 육지 뱀이나, 바다 뱀독은 마찬가지로 단백질 구조를 가지고 있다. 박테리아로부터 발 [그림 1] The Phylogenetic Tree (생물계통 발생학표시) - 5 -

6 金容海 생하여포유동물, 새, 갑골생물로진화를하는데신경계맹독인복어독이가장진화된해양포유동물에서발견되었다는것은흥미롭다. 복어, 도마뱀, 문어, 고비물고기, 개구리등다양한해양동물로부터똑같은 Tetrodotoxin (TTX) 이발생하고있다. 처음에는연구자들이제각각독물의이름을지었으나, 복어의이름에따라 Tetrodotoxin으로통일되었다. 13 Ⅲ. 복어독 (Tetrodotoxin : TTX) 복어독의독성, 분리에관해서는여러문헌이인용되고있다. 14-19 복어독 (TTX) 은잘알려진가장독성이강한신경계유기화합물이다. 맹독인복어는식용으로도널리알려진물고기이며, 한국, 일본등에서는고가로판매되고있다. 복어의살부분에는거의독성이없기때문에요리전문가가요리하면안전하다. 참고로여러종의포유동물이독성을비교하기위하여 LD50 mg/kg, Mouse Unit/mg을 < 표 1> 에표시했다. < 표 1> Amphibian Toxins Compound Batrachotoxin Tetrodotoxin Chriquitoxin Zetekitoxin Samaderin Dehydribufotoxin Ephinephrin Saxitoxin Cobra Venom Strychine Sodium Cyanide LD 50 mg/kg (i.p. mouse) 0.002 0.008 0.01 0.012 0.3 6 5 0.01 0.02 0.5 10 Mouse Units/mg 25,000 7,000 6,000 5,000 170 10 10 6,000 3,000 100 5 LD 50 : 독성비교를가장잘표시하는것으로생쥐테스트때쥐의절반이희생되고절반이살아남는수치 Mouse Unit : LD 50 를결정하려면많은테스트쥐가필요하므로주로실험때많이사용하는수치 20g의쥐가 20분후에희생되는수치 - 6 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 7 [ 그림 2] Distribution of TTX and STXs in Biota ( 생태 ) 1882, Matsuhara et al., Toxicity and Pharmacology. 1902, Tahara, Purity : 0.2%, named "Tetrodotoxin" from "Tetroadontidae". 1952, Yokoo et al., successful in crystallization. 1964, Structure elucidation : Woodward Mosher Tsuda Hirata 1972, Total systhesis Kishi 2003, Isobe [ 그림 3] History of TTX - 7 -

8 金容海 Tetrodotoxin: Potent Neurotoxin Puffer Fish (32 Species) Present in Ovary (very strong), Liver (very strong) Intestines (quite strong), Skins (fairly strong), Meat (weak), Blood (none?) Season : Strong Toxin Season (Jan.-May) Back Ground : used for food and medicine in ancient China, Egypt and Japan [ 그림 4] Present of Tetrodotoxin [ 그림 5] Tetrodotoxin 의발생 - 8 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 9 < 표 2> Tetrodotoxin, Chiriquitoxin, Zetekitoxin 의생리활성비교 < 표 3> ZTX 의분자량예측 - 9 -

10 金容海 [ 그림 6] 여러종의독화합물의전기영동 [ 그림 7] ZTX 의분자량예측 - 10 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 11 [ 그림 8] Zeteki and Senex Frogs < 표 4> 여러종의개구리독화합물의비교 - 11 -

12 金容海 [ 그림 9] Mouse Unit 의결정 [ 그림 10] TTX 와 CHTX 의정제 - 12 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 13 [ 그림 11] TTX 와 CHTX 의분리 [ 그림 12] CHTX 의 Mass Spectrum - 13 -

14 金容海 [ 그림 13] CHTX 의 13 CNMR - 14 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 15 < 표 5> NMR spectral data of CHTX and CHTX-13, 6-lactone CHTX (1) a CHTX-13, 6-lactone (4) b C H C H 2 156.6 156.7 4 75.2 5.51 (d 9.4) 75.3 5.50 (d 8.5) 4a 40.5 2.31 (d 9.4) 41.7 2.16 (d 8.5) 5 73.5 4.40 (br s) 70.6 4.71 (br s) 6 72.1 84.3 7 81.1 4.39 (br t) 77.7 4.30 (br. t) 8 72.7 4.40 (s) 72.8 4.19 (d 1.5) 8a 59.3 59.5 9 70.9 4.00 (s) 70.7 4.03 (s) 10 111.0 111.1 11 70.3 4.90 (d 1.8) 69.7 5.20 (d 5.5) 12 58.1 4.27 (d 1.8) - 4.85 (d 5.5) 13 174.1 173.0 13 C NMR a. 75.5 MHz (GN-300), B. 100 MHz (JEOL GSX-4000), 13 CD 3COOD as 22.4 ppm. 1 H NMR a. 300 MHz (GN-300), b. 400 MHz (JEOL GSX 400), CHD 2COOD ad 2.06 ppm. Solvent: a. 4%CD 3COOD/D 2O, b. 1%TFA, 4%CD 3COOD/D 2O (45 ) - Unassignable carbon due to an exchange of H-12 with D. ( 13 C NMR spectrum of 4 was measured after keeping 1 in 1%TFA, 4%CD 3COOD/D 2O for one month at 5 ) - 15 -

16 金容海 [ 그림 14] CHTX 의 IR Science, 189, 151-152(1975) [ 그림 15] Cyclization of Chiriquitoxin - 16 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 17 [ 그림 16] Oxidation of Chiriquitoxin Tetrodotoxin, Chiriquitoxin, Zetekitoxin - 17 -

18 金容海 Washington 조약 Zetekitoxin - 18 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 19 Bioactivity of ZTX and STX 1. IC50 to expressed sodium channels in Xenopus oocytes sodium channel ZTX (pm) STX (nm) STX/ZTX human heart (hhla) 278 149 536 rat brain IIa 6 2.1 344 rat skeletal muscle μ (Ⅰ) 65 3.1 48 2. Toxicity to mice ddy, male, ip (μg/kg) 10 10 By Prof. Samuel C. Dudley. Jr. (Emory Univ. Division of Cardiology) Preliminary data. 20 MS Spectrum of ZTX - 19 -

20 金容海 Stereochemistry of C15 and C16 of ZTX TTX 의발생 - 20 -

해양천연물 : 1 세기유기화합물로알려진복어독 (Tetrodotoxin) 및유사물질 21 參考文獻 1. Gaillard, C. Mem. Inst. Francais Arch. Orient. 1923 : 51, 97-100. 2. Kao, C. Y. 1966. Poisonous and Venomous Animals of World. vol. 2. U.S. Government Printing Office. Washington D.C. 3. Kaempfers, E. 1727. the history of Japan. Giving an Acount of the Ancient and Present State and Government of that Empire ; of Its Temples, Palaces, Castles, and other Buildings : of Its,Metals Minerals. Trees, Plants, Animals. Birds, and Fishes; ets. J.G. Scheuchzer, Trans, London. 4. Kishi, Y. ; M. Aratani ; T. Fukuyama, F. Nakatsbo ; T. Goto, S. Inoue, H. Tanino ; S. Sgiune & H, Kakoi, 1972. J, Am, Chem, Soc., 94 : 9217-9219. 5. Kishi, Y. ; T. Fukushima, M. Aratani, F. Nakatsubo, T. Goto : S. Inone ; H. Tanino, S. Sgiune & H, Kakoi, 1972. J, Am, Chen, Soc., 94 : 9219-9222. 6. Isobe, M. ; 2003. J, Am, Chem. Soc., 125, 8798-8895. 7. Mosher, H.S. ; F. A. Fuhrman ; H. H. Buchwald & H.G. Fischen. 1964, Science 144 : 1100-1110. 8. Kim, Y. H. ; G. B. Brown ; H. S. Mosher, & F. A. Fuhrman, 1975. Science 189 : 151-152. 9. Kim, Y. H. ; G. B. Brown ; H. Kuntzee, & H.S. Mosher, 1977, Toxicon. 15 : 115. 10. Kim, Y. H. ; L. Pavelka, & H.S. Mosher, 1977, Toxicon. 15 : 135. 11. Kim, Y. H. ; M. Yotsu ; T. Yasumoto. 1990, Tetrahedron Lett. 31 : 3187. 12. Kao, C. Y. ; P. N. Yeoh ; M.D. Goldfinger, F.A. Fuhrman & H.S. Mosher, 1981, J. Pharmaeol. Exp. : 217, 416-429. 13. Tahara, Y. 1911. Biochem, Z. 10 : 255-275. 14. Mosher, H. S. ; F.A. Fuhrman ; H. D. Buchwald & H.G. Fischer. 1964. Science 144 : 1100-1110. 15. Tsuda, K., 1966. Naturwissenschaften, 53 : 171-176. 16. Halstead, B. W., 1967, Poisnous and Venomous Marin Animals of the World. vol.2 U.S. Government Printing Office Washington D.C. 17. Evans, M. H. 1972 Int. Rev. Newrobiol. 15 : 83-166. 18. Tsuda, K. ; S. Ikuma ; M. Kawamma ; R. Tachikawa ; K. Sakai ; C. Tamma & O. Amakasu. 1964. Chem. Pharm. Bull. Jpn. 12 : 1357-1374. 19. Goto, T ; Y. Kishi ; S. Takahashi ; & Y. Hirata. 1965. Tetrahedron 21 : 2059-2088 20. Kim, Y. H. ; M. Y-Yamashita; S.C. Dudly Jr. ; G. Chaudhary ; A. Pfahnee ; Y. Oshima and J. W. Daly, 2004. proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101 : 4346-4351. - 21 -