- Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 2, April 2012, 164-168 이성목 이재화 신라대학교의생명과학대생명공학과 (2011 년 11 월 3 일접수, 2011 년 11 월 29 일수정, 2011 년 12 월 18 일채택 ) Organic Acid and Enzyme Pretreatment of Laminaria japonica for Bio-ethanol Production Sung-Mok Lee and Jae-Hwa Lee Department of Bioscience and Biotechnology, College of Medical and Life Science, Silla University, Busan 617-736, Korea (Received November 3, 2011; Revised November 29, 2011; Accepted December 18, 2011) 본연구는갈조류인다시마의당성분함량에대한분석과효소및유기산가수분해물을이용한생물학적바이오에탄올생산에대해연구하였다. HPLC 를이용한당성분분석결과 alginate 가 total sugar 의 65.99% 로가장많은것으로확인되었으며, laminaran 과 mannitol 이각각 6.24, 27.77% 로나타났다. 1.5% acetic acid 를이용하여 121, 60 min 동안가수분해결과최대 1.874 g/l 의환원당이생성되었으며, ascorbic acid 의경우 2.0% 에서최대 4.291 g/l 의환원당이생성되는것으로나타났다. Alginate lyase 와 laminarinase 와같은효소를이용한가수분해에서환원당생성량은최대 2.219 g/l 였다. 다시마가수분해물을이용한에탄올발효결과유기산을처리했을때에는에탄올생산량이오히려감소하는것으로나타났으며, alginate lyase 와 laminarinase 를혼합처리했을때에탄올생산량이 1.26 g/l 로가장높았다. We investigated for the production of biological bio-ethanol from Laminaria japonica using the hydrolysis reaction of enzymes and organic acids and the polysaccharide content was also analyzed. The composition of the polysaccharide was characterized as 65.99% alginate, 6.24% laminaran and 27.77% mannitol. The optimum concentration for reducing the sugar conversion by Laminaria japonica was found to be 1.874 g/l at an acetic acid concentration of 1.5%, 121 for 60 min, and for an ascorbic acid of 2.0%, 4.291 g/l was produced in the same condition. The enzyme hydrolysis such as alginate lyase and laminarinase contained the maximum 2.219 g/l reducing sugar. In the result of ethanol fermentation using hydrolysate of Laminaria japonica, the organic acid treatment showed a high of reducing sugar yield, but decreased the ethanol yield, and then the maximum ethanol production obtained was 1.26 g/l using the mixed treated of enzyme. Keywords: bio-ethanol, alginate lyase, laminarinase, Laminaria japonica 1) 1. 서론 현재지구의대기는산업혁명이후사용된화석연료에서발생한이산화탄소의증가로인해지구온난화및기상이변이발생하고있다. 이산화탄소의농도는빙하기시대에 180 ppm에불과했으나산업혁명이후급격히증가하여 1990년대후반에 370 ppm까지도달하였다 [1]. 온난화로인한지구연평균기온은지난 100년간약 0.74 증가하였으며 [2], 온난화에의한기온상승은해수를팽창시키고빙하를감소시켜해수면상승에기여하고있다. 특히한반도는 2011년기상청에서발표한지구대기감시보고서에의하면 1999년이후이산화탄소농도가매년 2.2 ppm씩증가하여현재지구평균인 388.6 ppm보다높은 394.5 ppm인것으로보고되어이산화탄소의증가가더욱빠른것으로나타났으며, 연평균기온또한 100년간세계평균상승폭의 3배에달하는 2.4 증가한것으로나타나지구온난화민감한것으로알 교신저자 (e-mail: jhalee@silla.ac.kr) 려져있다. 화석연료의과다사용은기후변화외에도매장량의한계로인해사용량이제한되어있어지속적인에너지의공급을위해서는새로운대체연료의개발을필요로한다. 현재전세계적으로주목하고있는대체연료는신재생에너지인풍력, 조력, 태양열등이있다. 그러나이러한것들은전기적에너지의생산만이가능하며화석연료와같은액체연료의생산을위해서는바이오매스를이용한바이오에너지생산만이대안이될수있다. 이중바이오에탄올은생물학적발효과정을통해쉽게생산할수있으며, 휘발유를대체할수있는유력한대체연료로서세계적으로그생산량이급증하고있다 [3,4]. 바이오에탄올생산은전분계인사탕수수, 옥수수등과목질계원료인농업부산물등을이용하여주로생산되고있다 [5-8]. 2008년한해동안전세계에서생산된바이오에탄올의총량은 670억 L이며, 이중최대생산국인미국과브라질에서바이오에탄올총생산량의 90% 이상을생산하는것으로알려져있다 [9]. 전세계바이오에탄올생산은매년급증하고있으나현재대부분곡물을주요원료로사용하고있어, 식량자원과의경쟁과이에따른가격상승으로문제가되고있 164
165 다. 따라서이러한문제를해결할수있는대체원료의개발이필요한실정이다. 해조류와같은해양바이오매스는성장속도가빠르고해양에서쉽게배양할수있으며식량자원과의경쟁을피할수있어육상자원을대체할수있을것으로기대되고있다. 이러한해조류중다시마와미역과같은갈조류는국내에서생산되는해조류에서가장많은양을차지하고있으며, alginate, laminaran 및 mannitol과같은다양한탄수화물을포함하고있다. 따라서본연구에서는갈조류인다시마를바이오매스로사용하기위해유기산및효소적처리를이용하여다시마를가수분해하고이를이용하여생물학적발효공정을통해바이오에탄올을생산하고자한다. 2. 실험방법 2.1. Alginate, Laminaran 및 Mannitol 함량측정다시마에함유된 alginate, laminaran 및 mannitol 각각의함량을확인하기위해 HPLC를이용하여당성분을분석하였다. HPLC는 Shimadzu사의검출기 (RID-10A) 와오븐 (CTO-10A), 펌프 (LC-10AD) 를이용하였으며, column은 Bio-Rad의 Aminex HPX-87H 300 mm 7.8 mm을이용하였다. 이동상은 d-h 2O 또는 50 mm H 2SO 4 를각각사용하였으며, 유속은 0.6 ml/min로조절하였고, column 온도는 40 로유지하였다. d-h 2O를이동상으로이용하여 alginate와 laminaran 의 total 함량을측정하였으며, 다시마시료와 100 mm H 2SO 4 을 1 : 1로혼합하여산성조건에서 alginate를응집시키고, 12000 rpm에서 5 min동안원심분리기를이용하여 alginate를침전시켜제거하고남은상층액을이용하여 laminaran과 mannitol의함량을각각구하였다. 2.2. 유기산및효소를이용한다시마가수분해실험에사용한다시마는부산부전시장에파는건조된다시마를이용하여분쇄기 (DW-BM5, Dongwon Scientific Co., Korea) 로입자를고르게파쇄한후사용하였다. 에탄올발효및가수분해에사용한다시마는 20 g/l의농도로이용하였다. 산전처리에의한환원당생성및에탄올발효영향을확인하기위해 acetic acid과 ascorbic acid를이용하여 0.25% 에서 2.5% 까지다양한농도로처리하였다. 각농도별산용액 80 ml에다시마를각각 2.0 g씩첨가하여고압멸균기로 121 에서 30 min 또는 60 min 동안처리하였다. 멸균후배지는 NaOH를이용하여중화하였으며, 최종배양부피를 100 ml로조절하여에탄올발효배지로이용하였다. 전처리과정에서생성된환원당측정을위해 DNS법을이용하여 540 nm에서흡광도 (UV/Vis spectrometer Optizen 2120UV, Mecacys Ltd., Korea) 를측정하여확인하였으며, 환원당생성이높은전처리배지를에탄올발효배지로이용하였다. 다시마의주요다당류인 alginate와 laminaran의효소가수분해에의한환원당생성을확인하기위해 Sigma aldrich의 alginate lyase (A1603, from Flavobacterium sp.) 와 laminarinase (L5272, from Trichoderma sp.) 를이용하여효소가수분해를진행하였다. 효소가수분해는 121 에서 15 min 동안고압멸균한다시마를실온에서냉각후효소를첨가하여반응을진행하였다. 효소반응은 0.3 M GTA buffer를이용하여 ph 5.7로유지한상태에서 alginate lyase 10.0 unit와 laminarinase 1.0 unit를각각또는동시에첨가하여 150 rpm, 37 에서반응시키며시간에따른환원당농도변화를측정하였다. Table 1. Carbohydrate Composition of Laminaria japonica L. japonica Alginate Laminaran Mannitol Total Dry weight % (Total sugar %) 41.45 (65.99) 3.92 (6.24) 2.3. 가수분해물을이용한다시마에탄올발효 17.44 (27.77) 62.81 에탄올발효균주로는효모인 Saccharomyces cerevisiae (KCCM11290) 를이용하였으며, 균주의보관은 20% glycerol 로하여, -70 에서보 관하였다. Stock 한균주는 YPD 배지 (glucose 20.0 g/l, peptone 20.0 g/l, yeast extract 10.0 g/l) 를사용하여 30, 150 rpm 에서전배양하 였으며배지내에남아있는 glucose 를제거하기위해 3000 rpm 에서 5 min 동안원심분리하여배지를제거한후 Yeast nitrogen base medium without amino acids (Difco TM ) 를배지농도와동일한양을첨가 하여 3 회반복하여세척하였다. 전처리한다시마가수분해물을에탄 올발효배지로사용하기위해모든배지의 ph 를 HCl 및 NaOH 를이 용하여초기배지 ph 를 7.0 으로맞춰주었으며, 배양전과정동안 ph 는인위적으로조절하지않았다. 에탄올발효는 300 ml 삼각플라스 크를이용하여 working volume 100 ml 로배양하였으며고무마개를 이용하여산소의출입을막았다. 배양은 shaking incubate 를이용하여 30 의 150 rpm 에서진행하였다. 2.4. 에탄올함량측정 생성된에탄올의정량을위해발효된시료를 12000 rpm 에서 5 min 동안원심분리후상층액을 gas chromatography (GC) 를이용하여분 석하였다. GC 는 HP 5890 series Ⅱ 를사용하였고, 검출기는 flame ionization detector (FID) 를이용하였다. 칼럼은 HP-FFAP (Cross- Linked PEG-TPA 30 m / 0.25 mm / 0.25 µl) 을사용하였다. 이동상은 N 2 를 0.6 ml/min 로사용하였으며, injection temperature 150, detector temperature 200, oven temperatures 120 로일정하게유지 하였다. 3.1. 다시마당성분함량 3. 결과및고찰 갈조류는건조중량의약 30 67% 의탄수화물을함유하고있으며 [10,11], 이러한해조류탄수화물은구성성분이다양하며, 채취시기 및종에따라이들의성분비율은크게달라진다 [12,13]. 실험에사용 한다시마를이용하여주요당성분인 alginate, laminaran 및 mannitol 의함량을분석하였다 (Table 1). HPLC 를이용한당성분측정결과 alginate 의함량이다시마건조중량의 41.45% 로가장높게나타났으며, mannitol 17.44% 그리고 laminaran 은 3.92% 로가장낮은것으로확인 되었다. 이러한당성분의구성비율은다른갈조류인감태, 모자반및 톳에서도유사하게나타나는것으로보고되어있다 [13]. 당성분에따 른비율은 alginate 가 65.99% 로거의대부분을차지하는것으로나타 났으며 laminaran 은 6.24% 로매우낮게나타났다. 저장성다당류인 laminaran 의함량이급격히감소하는이러한경향은일조량이적은 1 3 월에수확된갈조류에서대부분나타나는것으로보인다 [12,13]. 3.2. 유기산을이용한다시마가수분해 유기산처리에따른다시마가수분해를확인하기위해 DNS 를이용 하여환원당생성량을측정하였다. 유기산은 acetic acid 와 ascorbic Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 2, 2012
166 이성목 이재화 Figure 2. Enzymatic Hydrolysis of Laminaran japonica: alginate lyase (5 unit/g L. japonica), laminariase (0.5 unit/g L. japonica). 를이용하여 raw seaweed (sea tangle 50%, sea mustard 50%) 에열처리하였을때처리시간에따른점도변화를확인한실험에서 ascorbic acid를이용하였을때점도가 500 cp에서 150 cp로가장낮게감소하는것으로나타났다 [15]. 갈조류의산및열처리에서점도의감소및환원당의증가는갈조류에풍부하게존재하는다당류인 alginate의가수분해에의한것으로보인다. 열처리시간에따른환원당생성량의차이는 ascorbic acid보다 acetic acid가더크게영향을받는것으로확인되었다. Figure 1. Effect of acid concentration on Laminaria japonica hydrolysis: 121, 30 and 60 min with autoclave, acid pretreatment concentration between 0.25 and 2.5%. a) acetic acid, b) ascorbic acid. acid를이용하였으며, 0.25% 에서 2.5% 까지다양한농도로처리하였다. 유기산을첨가하지않은다시마에서는 0.30 g/l의환원당이생성되는것으로확인되었으며, 유기산을첨가하였을때환원당생성량이급격히증가하는것으로나타났다 (Figure 1). 유기산을이용한가수분해결과 acetic acid보다 ascorbic acid에서환원당의최대생산량이약 2.3배정도높은것을확인할수있었다. 사용한두종류의유기산은각각최적농도가다르게나타났다. Acetic acid의경우 1.5% 농도에서 60 min 동안반응하였을때최대 1.874 g/l까지환원당생산량이증가하는것으로나타났으나, 0.75% (1.756 g/l) 이상의농도에서환원당의증가가급격히낮아지는것으로확인되었다. 반면 ascorbic acid의경우 acetic acid에비해비교적높은농도까지환원당이증가하는것을확인할수있었다. Ascorbic acid의경우 2.0% 농도에서 60 min 동안반응하였을때최대 4.315 g/l의환원당이생성되었으며, 그이상의농도 (2.5%, 4.291 g/l) 에서환원당생성량이오히려감소하는것으로나타났다. 이러한환원당생성량의감소는강산인 hydrochloric acid와 sulfuric acid 를이용한가수분해에서도확인된적이있다 [14]. 또한 ascorbic acid, hydrochloric acid 그리고 sodium hydroxide 3.3. 효소를이용한다시마가수분해효소를이용한다시마가수분해를위해시판되고있는 alginate lyase와 laminarinase를사용하여시간에따른환원당생성량변화를확인하였다 (Figure 2). Alginate lyase와 laminarinase는다시마 1.0 g을기준으로 5.0 unit와 0.5 unit 단위로각각또는두효소를함께처리하였다. 1차효소첨가후환원당은약 5 h 동안증가하였으며, 이후환원당생성량의변화가없어진 6 h에추가로효소를첨가하여가수분해를진행하였다. Alginate lyase에의한환원당의생성은초기 0.148 g/l에서효소첨가 6 h에 1.695 g/l까지증가하였다. 추가적인효소첨가에의해환원당은 2.017 g/l까지증가하였으나 1차효소첨가에서의증가율에비해약 20.8% 로매우낮게나타났다. Laminarinase에의한가수분해또한효소추가에서환원당증가가초기보다낮게나타났으며, 최대환원당생산량은 0.696 g/l로 alginate lyase 처리에비해 34.5% 로낮게나타났다. HPLC를이용하여측정된결과를바탕으로하면다시마 20 g/l에는 alginate가약 8.290 g/l, laminaran이약 0.784 g/l 포함되어있는것으로나타난다. 효소를이용한가수분해에서환원당의생산량은 alginate lyase의경우다시마에포함된전체 alginate의약 24.33% 로가수분해수율이낮았으나, laminarinase의경우 88.76% 로수율이높은것을나타났다. Alginate lyase와 laminarinase 를동시에첨가했을때최대환원당생산은 2.219 g/l까지증가하였으나효소를각각처리했을때에비해효율이낮은것으로확인되었다. 3.4. 가수분해물을이용한에탄올발효에탄올발효를위한해조류가수분해를위해유기산과효소가수분해의최적조건을이용하여다시마를전처리하였다. 즉, 단순한열처리그리고유기산인 acetic acid와 ascorbic acid의최대환원당생성조 공업화학, 제 23 권제 2 호, 2012
167 a) Heat b) Acetic acid Figure 3. Hydrolysis of Laminaria japonica treated using organic acid and enzyme: 121, 30 and 60 min with autoclave, acid pretreatment concentration (acetic acid: 1.5%, ascorbic acid 2.0%), enzymatic hydrolysis was used alginate lyase (5 unit/g L. japonica), laminariase (0.5 unit/g L. japonica). 건인 1.0% 와 2.0% 에서각각다시마를전처리하고그이후 alginate lyase와 laminarinase를각각또는동시에처리하여환원당의변화및가수분해물을이용한에탄올생산량의변화를확인하였다. 실험결과유기산을이용한가수분해에서효소에비해높은환원당이생성되는것을확인하였으나, 추가로효소처리를하였을때환원당이더욱증가하는것을확인할수있었다 (Figure 3). 환원당의증가는앞의효소가수분해와동일하게 laminarinase를사용했을때보다 alginate lyase를이용하였을때더욱크게증가하였다. 두종류의효소를동시에처리한결과또한 alginate lyase와 laminarinase를각각처리하였을때의증가된양과유사하게나타났다. 이러한결과는다시마의가수분해에있어한가지방법만이용하는것은환원당생성에한계가있다는것을나타낸다. 다시마가수분해물을이용한에탄올발효결과 acetic acid와 ascorbic acid를이용한가수분해물의경우환원당생성량은높으나에탄올생산량은오히려감소하는것으로확인되었다 (Figure 4). 산을이용하여가수분해를할경우중화과정에서생성되는염이에탄올발효균주에영향을미쳐에탄올생산이오히려감소할수도있다는것이 hydrochloric acid와 sulfuric acid를이용한가수분해물을이용한에탄올발효에서확인된바있다 [14]. 유기산을이용한가수분해도강산과마찬가지로중화과정에서생성되는염에의해에탄올생산이저해된것을보인다. 또한환원당함량이높은유기산을처리한다시마가수분해물에서보다열처리에서에탄올수율이높은것은다시마의성분중에서가수분해되어환원당이생성되는 alginate와 laminaran 외에도 DNS로측정되지않는비환원당인 mannitol도포함되어있기때문인것으로보인다. 열처리에의한가수분해물에서에탄올생산은 alginate lyase와 laminarinase의두가지효소를동시에사용하였을때최대 1.26 g/l의에탄올이생산되는것을확인할수있었다 (Figure 4(a)). 또한각각의효소처리에서는환원당생성량이높았던 alginate lyase 가수분해물보다 laminarinase를처리한것에서에탄올생산량이 107.88% 더높은것으로나타났다. 이러한에탄올생산량의차이는 laminarinase에의해생성되는가수분해물이 glucose이기때문인것에에탄올 c) Ascorbic acid Figure 4. Ethanol production from various Laminaria japonica hydrolysate. a) Heat pretreatment : 120, 30 min with autoclave, b) Acetic acid pretreatment : added 1.5% acetic acid at 121 for 60 min with autoclave, c) Ascorbic acid pretreatment : added 2.0% ascorbic acid at 121 for 60 min with autoclave. 로발효되기쉽기때문인것으로보인다. 반면 alginate lyase에대한가수분해물의경우초기에탄올생산이빠른것으로나타났는데이는 alginate의분해에의한점도감소로배양액의혼합이원활히이루어졌기때문으로보인다. 유기산을처리한가수분해물에서도에탄올생산량은열처리결과와비슷한경향을나타내는것으로나타났다. Acetic acid를이용한가수분해물에서의에탄올생산은효소혼합처리에서 0.75 g/l, laminarinase 처리에서 0.56 g/l로확인되었다 (Figure Appl. Chem. Eng., Vol. 23, No. 2, 2012
168 이성목 이재화 4(b)). 효소처리를하지않은것과 alginate lyase를처리한가수분해물의에탄올생산은각각 0.36, 0.39 g/l로거의차이가없는것으로나타났다. Ascorbic acid의가수분해물을이용한에탄올발효는 acetic acid와비슷한결과가확인되었으나, 효소를처리하지않은가수분해물에서의에탄올생산량은 0.56 g/l로 acetic acid에비해약 1.56배높은것으로나타났다 (Figure 4(c)). 이러한결과는 acetic acid를중화과정에서생성된염이다시마가수분해물을이용한발효에서에탄올생산을더크게저해하기때문인것을보인다. 4. 결론 바이오에탄올생산을위해해조류중갈조류에속하는다시마를이용하여다양한가수분해를진행하였다. 다시마는유기산및효소를이용하여가수분해하였으며처리농도및반응시간에따른환원당의변화를확인하였다. 또한생성된가수분해물을이용하여실제에탄올발효를하였을때생산되는에탄올함량의변화를확인하였다. HPLC 를이용하여다시마에포함된 alginate, laminaran 및 mannitol과같은당성분의함량을측정하였으며, 이중 alginate의함량이총당성분의 65.99% 를차지하는것으로나타났다. 유기산을이용한다시마가수분해는 acetic acid와 ascorbic acid를이용하였을때환원당이각각최대 1.874 g/l와 4.315 g/l 생산되는것으로확인되었으며, 유기산의농도를 2% 이내에서처리하였을때농도증가에따라환원당의생산량도증가하는것으로확인되었다. 또한 alginate lyase와 laminarinase 를이용한효소적가수분해에서 alginate lyase를이용하였을때환원당이 2.017 g/l까지증가하는것을확인하였으며두효소를동시에처리하였을때, 2.219 g/l의환원당이생성되는것을확인하였다. 에탄올발효결과 alginate lyase와 laminarinase를혼합하여처리한가수분해물에서최대 1.26 g/l의에탄올이생산되는것을확인할수있었다. 감사 본연구는국토해양부소관해양생명공학기술개발사업의연구비지원에의해수행되었습니다. 참고문헌 1. J.-I. Park, H.-C. Woo, and J.-H. Lee, Korean Chem. Eng. Res., 46, 833 (2008). 2. S.-M. Lee, J.-H. Kim, H.-Y. Cho, H. Joo, and J.-H. Lee, J. Korean Ind. Eng. Chem., 20, 517 (2009). 3. M. Balat and H. Balat, Applied Energy., 86, 2273 (2009). 4. N. E. Tolbert, Regulation of atmospheric CO 2 and O 2 by photosynthetic Carbon Metabolism, ed. J. Preiss, 8, Oxford University Press, Oxford (1994). 5. J.-R. Do, Y.-J. Nam, J.-H. Park, and J.-H. Jo, J. Kor. Fish. Soc., 30, 428 (1997). 6. A. Hirano, R. Ueda, S. Hirayama, and Y. Ogushi, Energy, 22, 137 (1997). 7. B. C. Saha and M. A. Cotta, Enzyme Microb. Technol., 41, 528 (2007). 8. B. Hahn-Hagerdal, M. Galbe, M. F. Gorwa-Grauslund, G. Liden, and G. Zacchi, Trends Biotechnol., 24, 549 (2006). 9. Renewable Global Status Report. Renewable energy network for the 21 st century (REN21). Washington, DC: Worldwatch Institute Paris, REN21 Secretariat (2009). 10. J.-H. Kim, D.-S. Byun, J. S. Godber, J.-S. Choi, W.-C. Choi, and H.-R. Kim, Appl Microbiol. Biotechnol., 63, 553 (2004). 11. H.-I. Kang, M.-S. Ko, H.-J. Kim, S.-W. Kim, and T.-J. Bae, J. Kor. Fish. Soc., 29, 716 (1996). 12. S. A. Lee, J. U. Kim, J. G. Jung, I. H. Kim, S. H. Lee, S. J. Kim, and J. H. Lee, Kor. J. Biotechnol. Bioeng., 21, 389 (2006). 13. Y.-H. Park, Bull. Korean Fish. Soc., 2, 71 (1969). 14. S.-M. Lee and J.-H. Lee, Appl. Chem. Eng., 21, 154 (2010). 15. D. B. Choi, H. S. Sim, Y. L. Piao, W. Ying, and H. Cho, J. Ind. Eng. Chem., 15, 12 (2009). 공업화학, 제 23 권제 2 호, 2012