理學碩士學位請求論文 수직배향된탄소나노튜브를사용한 레이저탈착이온화법 Matrix-free Laser Desorption/Ionization on Vertically Aligned Carbon Nanotube Arrays 2006 年 2 月 仁荷大學校大學院 化學科 ( 化學專攻 ) 辛秀珍
理學碩士學位請求論文 수직배향된탄소나노튜브를사용한 레이저탈착이온화법 Matrix-free Laser Desorption/Ionization on Vertically Aligned Carbon Nanotube Arrays 2006 年 2 月 地道敎授崔英植 이論文을碩士學位論文으로提出함
이論文을辛秀珍의碩士學位論文으로認定함 2006 年 2 月 主審ㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇ 副審ㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇ 委員ㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇㅇ
목 차 (Contents) 요약 i Abstracts ii Ⅰ. 서론 (Introduction) 1 Ⅱ. 실험 (Experiments) 5 Ⅱ-1. 실험장치및재료 5 Ⅱ-2. 실험방법 11 Ⅲ. 결과및토의 (Results and Discussion) 15 Ⅳ. 결론 (Conclusion) 35 Ⅴ. 참고문헌 (References) 37
요 약 MALDI-TOF는 matrix라불리는유기산을사용하여시료의이온화성능을월등히높여세계적으로널리사용되고있는질량분석기이다. 하지만, matrix의방해로저분자량을가지는시료를분석할경우분석하고자하는시료의피크는효율성이떨어지거나매트릭스와시료의피크가겹치는경우도발생하게된다. 이때문에상용되는 MALDI-TOF는저분자량을가지는시료의분석에는활발히이용되지못하고있다. 이러한점을보완하기위해매트릭스를사용하지않고시료를잘이온화시킬수있는탄소나노튜브 plate를여러대학과전문생산업체로부터제공받아단점을극복하고자시도하였다. 탄소나노튜브는 Silicon wafer 위에 PECVD, Thermal CVD법등으로다양한길이로수직증착되었으며, 이 plate 위에여러단백질과펩타이드를 dropping하여분석하였다. 분석결과, 탄소나노튜브 plate를사용하여도매트릭스를사용하여분석한것이상의깨끗한스펙트럼을얻을수있었다. 또한, 탄소나노튜브의성장길이와분석결과간에밀접한관련이있음을알수있었다. i
Abstracts The matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) technique developed by many researcher groups such as Karas, Hillenkamp, Tanaka, et al. has a beneficial effect on many research fields. The MALDI analysis of proteins and peptides is carried out typically by using organic matrices. Use of matrices greatly improved the ionization efficiency, but some problems arise. For example, analyte signals may be found only from specific spots and analytes of low molecular weight are not easily analyzed because of high background signals of the matrix in the low mass region. In search for good substrates for matrix-free LDI, we found vertically aligned carbon nanotubes arrays (CNTa). The vertically aligned carbon nanotube arrays were fabricated on silicon wafers either by plasma-enhanced or thermal CVD method. The grown nanotubes were several tens nanometers in diameter and several hundred nanometer to a few micron in length. The analyte samples dissolved in water were dropped on vertically aligned carbon nanotube plate and dried in air. The silicon wafer piece with carbon nanotube plate and analytes on it was attached to a stainless steel ii
sample plate for MALDI. Mass spectra of the analytes deposited on carbon nanotube plate were obtained with a commercial MALDI- TOF mass spectrometer(applied Biosystems Voyager DE-STR) equipped with a 337nm N 2 laser. Several small peptides with masses from 900 to 1,500Da gave excellent quality of spectra, demonstrating that vertically grown carbon nanotubes plate can be used as the substrate for matrix-free LDI. The LDI on the carbon nanotube plate was successfully applied for Insulin of which mass is about 5,730Da. In addition, it showed nearly the same performance when tested in long-time storage for months in air after fabrication. iii
Ⅰ. 서론 (Introduction) 1900년대초에질량분석법이처음으로사용되기시작한이래로다양한이온화법이발달되어왔으며, 일반적으로 EI(Electron Impact) 가표준이온화방법으로널리사용되고있었다. 그러나이방법은휘발성시료에만사용할수있으며, 열에불안정한시료에는사용할수없는단점을가지고있었다. 이러한이유로휘발성이없거나열안정성이없는시료의질량분석을위한여러가지이온화방법들이개발되었는데이렇게개발된방법들이 MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization), ESI(Electro Spray Ionization), SIMS(Secondary Ion Mass Spectrometry), FAB(Fast Atom Bombardment) 등이다. 그중에서도 1988년일본시마즈제작소의 Koichi Tanaka 2, 독일의 Hillenkamp 1 등에의해개발된 MALDI법은고분자시료에대해시료의분해없이기화 / 이온화가가능한방법으로일반적으로질량이크고열에불안정한생체고분자나합성고분자에매우이상적으로적용될수있는방법이다. 이연구성과로인해 Koichi Tanaka는 2002년에노벨화학상을수상하게되었다. MALDI-TOF 질량분석기는이온화방법인 MALDI법과비행시간형질량분석기인 TOF(Time of Flight) 가결합한형태로단백질, 유기화합 1
물, 고분자화합물의질량, 구조, 특성등을빠르고정확하게분석할수있다. 또한감도가매우뛰어나 pmole~fmole 수준의분석이가능하다. MALDI법은조사된레이저 ( 일반적으로 337nm의 N 2 laser를사용함 ) 에너지가결정화된매트릭스 (matrix) 를통해시료로전달되어시료를이온화시키는방법이다. 이온화과정을거친시료분자들은전기장으로가속되어 Time-of-Flight Mass Spectrometer(TOF-MS) 로이동하여질량대전하 (m/z) 비에근거하여분리된뒤검출기를거쳐분석된다. 일반적으로사용되는매트릭스는분자량이작은유기산이다. 유기산의특성상양성자를쉽게내놓기때문에탈착 / 이온화과정에서유기산으로부터시료로의양성자전달이이루어져서시료가이온화된다고알려져있다. 또한매트릭스가레이저에너지의대부분을흡수함으로써시료가레이저광에의해손상되는것을최대한줄여주는역할도한다. 하지만분자량이작은시료를분석할경우매트릭스 signal의방해로인해분석하고자하는시료의 signal은효율성이떨어지거나매트릭스와시료의 signal이겹치는경우도발생하게된다. 이때문에상용되는 MALDI-TOF는저분자량을가지는시료의분석에는활발히이용되지못하고있다. 이러한점을보완하기위해매트릭스를사용하지않고시료를잘이온화시킬수있는방법에대한연구가많이진행되고있다. 3-9 매트릭스를사용하지않고시료를이온화시키기위해서는매트릭 2
스의역할을하는새로운 sample plate의도입이필요했고, 이미다양한소재를사용한 sample plate가시도되고있다. 성공적인소재선택으로상용화에성공한 Desorption/Ionization on porous silicon(dios) 10 의경우, 시료의이온화에는성공적은결과를얻을수있었지만장기간보관시에성능이현저히떨어져서문제점을가지고있었다. 즉, 이온화효율도좋고안정성면에서도뛰어난소재가새로운 sample plate의조건으로대두되었다. 그러던중, 꿈의신소재 라불리는탄소나노튜브 (Carbon nanotubes, CNTs) 에서아이디어를착안하여, 탄소나노튜브를재료로하는새로운 plate를제작, 사용하게되었다. 탄소나노튜브는 1991년 Iijima에의해처음보고되었고이후, 많은영 역에서획기적인특성으로주목받고있는소재이다. 11-12 탄소나노튜브 의분석물흡착능력은이미이전의연구들에의해확인된바있다. 13-18 2003년 Xu 그룹에서는 arc discharging 방법을사용하여석탄으로부터얻어낸탄소나노튜브입자를마치매트릭스를섞듯이시료와섞어이온화효과를확인한결과가보고되었다. 19 이를토대로충남대, 서울대, 성균관대학교와의협력을통해실리콘웨이퍼 (Silicon wafer) 기판위에스퍼터링법 (sputtering) 을사용하여원하는패턴으로 Fe 박막을형성한후플라즈마화학기상증착법 (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition), 열화학기상증착법 (Thermal Chemical Vapor Doposition) 등에의해수직배향시킨탄소나노튜브를제공받을수있었고, 일진나 3
노텍및미국의 CNTs 생산업체 (Nano Lab, Nanocs) 에서도상용화된탄소나노튜브를구입하여본격적인실험을하였다. 실험전주사전자현미경 (scanning electron microscope) 을사용하여수직배향된탄소나노튜브의길이와모양등에대한정보를축적해놓았다. 실험결과, 탄소나노튜브를사용한새로운방법에서는매트릭스를사용하지않고도시료를잘이온화시킬수있었고, 매트릭스의방해를근원적으로제거하였기때문에시료의 signal로만이루어진깨끗한스펙트럼을얻을수있었다. 자연히스펙트럼의세기 (intensity) 나시료의감도 (sensitivity) 가좋아지는것을확인할수있었고저분자량을가지는화합물의분석에있어서특히효과가부각되었다. 또한탄소나노튜브는공기중에서도매우안정하고장시간변형없이보관할수있어서소재의안정성과효율성면에서매우뛰어난강점을가지고있다. 아직연구의초기단계이고이온화과정의정확한메커니즘이밝혀지지않았지만탄소나노튜브를응용한질량분석법연구는저분자량을가지는시료의분석에매우효과적인방법이라사료된다. 본논문의구성은다음과같다. 서론에이어실험장치및재료, 실험방법에대해기술하고, 얻은결과에대해보고하고토의한내용을다룬뒤, 마지막으로결론을맺고향후연구방향을제시하고자한다. 4
Ⅱ. 실험 (Experiments) Ⅱ-1. 실험장치및재료 [1] MALDI-TOF 질량분석기 본실험은 Applied Biosystems(Framingham, MA, USA) 의 Voyager DE-STR time-of-flight mass spectrometer를사용하여수행하였다. 질량분석기의비행관길이는 2.0m이며 (Reflector mode 사용시 3.0m), 시료의탈착 / 이온화는 3ns 펄스폭 (pulse width) 을갖는파장 337nm의질소레이저 (N 2 laser) 에의해이루어졌다. 질량분석기는크게이온화영역, 비행 ( 분리 ) 영역, 검출영역으로구분된다 ( 그림 1). 이온화영역이란매트릭스가혼합된시료에레이저광을조사하여시료를이온상태로만들어주는영역이다. 이온화된시료는전기장으로가속되어비행영역을지나면서질량대전하 (m/z) 비에따라분리된다. 질량에따라각기다른비행시간을갖는이온들은검출영역에도달하여 20-25 kv 이온화영역 비행영역 고진공 검출영역 검출기 그림 1. 질량분석기의기본적인구조. 5
MCP(Microchannel Plate) 에전류신호를내고신호는컴퓨터를통해처리, 해석되어질량스펙트럼으로보여진다. MALDI-TOF-MS는기본적으로 Reflector Mode, Accelerating Voltage: 20000V, Grid Voltage: 75.4%, Guide Wire: 0% 로설정하였으며모든스펙트럼은동일설정하에서얻어졌다. Laser Intensity는 1700~2500의범위내에서사용하였으며, Extraction Delay Time은분석하고자하는시료의분자량에따라 50~300의범위내로설정하였다. [2] 탄소나노튜브 (Carbon Nanotubes, CNTs) 서울대학교, 충남대학교, 성균관대학교와의협력을통해기판위에수직배향시킨탄소나노튜브를제공받았으며, 국내외의탄소나노튜브전문생산업체인일진나노텍, NanoLab(Newton, MA, USA), Nanocs(New York, NY, USA) 에서상용화된탄소나노튜브를구입하였다. 각각의탄소나노튜브는 well 타입, 증착방법, 사용한기판, 성장길이등에서차이를보였다. Well 타입은 single well과 multi well로구분되었으며, 증착방법은플라즈마화학기상증착법 (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition, PECVD), 열화학기상증착법 (Thermal Chemical Vapor Deposition, Thermal CVD), 전기방전법 (Arcdischarge) 등의다양한방법이사용되었다. 사용된기판으로는실리콘웨이퍼 (Silicon wafer) 가주를이뤘으며, 그밖에 Cr-SS, Cu 등이기판 6
으로사용되었다. 각탄소나노튜브의정보는아래의표에기술하였다 ( 표 1). 제공처 Well 타입 기판의종류 증착방법 성장길이 서울대학교 Single well Silicon wafer PECVD <5μm 충남대학교 Single well Silicon wafer Thermal CVD <5μm 일진나노텍 Multi well Silicon wafer Thermal CVD >100μm NanoLab Multi well Cr-SS PECVD <5μm Nanocs Multi well Cu CVD or Arc-discharge >5μm 성균관대학교 Multi well Silicon wafer PECVD <5μm 표 1. 각탄소나노튜브의상세정보. [3] 주사전자현미경 (Field Emission Scanning Electron Microscopy) 모든탄소나노튜브는실험전주사전자현미경 (field emission scanning electron microscopy) 으로분석하였다. 표면, 측면분석을통해탄소나노튜브의표면상태, 정확한성장길이등에대한정보를얻을수있었다. 사용된주사전자현미경은인하대학교공동기기실에서보유 7
하고있는 Hitachi 사의 S-4300 을사용하였으며각탄소나노튜브의주 사전자현미경분석사진은아래와같다 ( 표 2). 표 2. 각탄소나노튜브의주사전자현미경분석사진. 8
[4] 시료 (Samples) Bradykinin Fragment 2-9 구입처 : Sigma 분자량 (Formula Weight): 904.0 CAS No.: 16875-11-9 Substance P 구입처 : Sigma 분자량 (Formula Weight): 1347.6 CAS No.: 33507-63-0 Angiotensin Ⅰ human 구입처 : Sigma 분자량 (Formula Weight): 1296.5 CAS No.: 70937-97-2 Insulin from bovine pancreas 구입처 : Sigma 분자량 (Formula Weight): 5733 CAS No.: 11070-73-8 9
Insulin chain B oxidized from bovine pancreas 구입처 : Sigma 분자량 (Formula Weight): 3495.9 CAS No.: 30003-72-6 Lysozyme from chicken egg white 구입처 : Sigma 분자량 (Formula Weight): approx. 14305.14 CAS No.: 12650-88-3 아미노산서열 : Lys-Val-Phe-Gly-Arg-Cys-Glu-Leu-Ala-Ala- Ala-Met-Lys-Arg-His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg-Gly-Tyr-Ser- Leu-Gly-Asn-Trp-Val-Cys-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Ser-Asn-Phe- Asn-Thr-Gln-Ala-Thr-Asn-Arg-Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr- Asp-Tyr-Gly-Ile-Leu-Gln-Ile-Asn-Ser-Arg-Trp-Trp-Cys-Asn- Asp-Gly-Arg-Thr-Pro-Gly-Ser-Arg-Asn-Leu-Cys-Asn-Ile-Pro- Cys-Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ile-Thr-Ala-Ser-Val-Asn- Cys-Ala-Lys-Lys-Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asn-Gly-Met-Asn-Ala- Trp-Val-Ala-Trp-Arg-Asn-Arg-Cys-Lys-Gly-Thr-Asp-Val-Gln- Ala-Trp-Ile-Arg-Gly-Cys-Arg-Leu-------- 10
Ⅱ-2. 실험방법 [1] 탄소나노튜브 plate 준비주사전자현미경으로표면, 측면분석을실시한탄소나노튜브 plate 를상용화된 sample plate에테이프를사용하여부착시켰다. 기존에사용하던 Stainless steel 소재의 100-well plate를가로 3cm, 세로 5.7cm, 깊이 0.7mm 의직사각형모양으로깎아내어변형시켰다. 이는탄소나노튜브 plate의기판높이를고려한것으로서깎아낸부분에탄소나노튜브 plate를테이프로붙여서단단히고정시켰다 ( 그림 2). 그림 2. 변형된 100-well plate 에탄소나노튜브 plate 를부착시킨모습. 11
[2] 시료준비 Bradykinin Fragment 2-9 Bradykinin 1ⅹ10-4 M 제조 : 1mg의 Bradykinin을 8.41mL의 HPLC grade H 2 O에녹인다. Bradykinin 1ⅹ10-5 M 제조 : Bradykinin 1ⅹ10-4 M을 1mL 취한후 9mL의 HPLC grade H 2 O와혼합한다 (10배로희석 ). Bradykinin 1ⅹ10-6 M 제조 : Bradykinin 1ⅹ10-5 M을 1mL 취한후 9mL의 HPLC grade H 2 O와혼합한다 (10배로희석 ). Substance P Substance P 1ⅹ10-4 M 제조 : 1mg의 Substance P를 6.085mL의 HPLC grade H 2 O에녹인다. 위와같은방법으로희석하여 1ⅹ10-5 M, 1 ⅹ10-6 M, 1ⅹ10-7 M의 Substance P를제조한다. Angiotensin Ⅰ human Angiotensin Ⅰ 1ⅹ10-4 M 제조 : 1mg의 Angiotensin Ⅰ을 7.713mL 의 HPLC grade H 2 O에녹인다. 위와같은방법으로희석하여 1ⅹ10-5 M, 1ⅹ10-6 M의 Angiotensin Ⅰ을제조한다. 12
Insulin from bovine pancreas Insulin 1ⅹ10-4 M 제조 : 1mg 의 Insulin 을 1.744mL 의 HPLC grade H 2 O 에녹인다. Insulin chain B oxidized from bovine pancreas Insulin chain B 2.8ⅹ10-4 M 제조 : 1mg 의 Insulin chain B 를 1.022mL 의 HPLC grade H 2 O 에녹인다. Lysozyme from chicken egg white Lysozyme의 trypsin 가수분해반응 1. 100 mm ammonium bicarbonate(nh 4 HCO 3 ) 20μL 2. Lysozyme 3.5 10-4 M 20μL 3. Acetonitrile 5 μl 4. 0.4 μg/μl TPCK treatment Trypsin (Promega, Madison, WI) 1μL 위의순서대로혼합한후 37 에서 12시간동안반응시킨다. dowex 50WX8-200 ion-exchange resin 시료에포함되어 MH + signal 이작게나오게함으로써분석에방해가 되는불순물을제거하기위해사용한다. 13
ammonium form 형태로 beads 만들기. 1. beads를두배부피의 1mM ammonium acetate에넣고 overnight 시킨다. 2. beads를건져내어진공을건 Buchner funnel에서 water, acetone, hexane을사용하여차례로씻는다. 씻은 beads는무한기간보관이가능하다. 상온에시료를두었을경우, 시료가상할염려가있으므로모든시료는냉동보관되었고실험시에만꺼내어사용하였다. 필요에따라각시료의용액에 acetonitrile (ACN), sodium chloride (NaCl), trifluoroacetic acid (TFA) 를첨가하였다. 모든시료는 1μL씩취해서탄소나노튜브 plate에 dropping 하였고, 여러시료를섞어서혼합시료를만든후 1μL를취해 dropping 하기도하였다. Dropping된시료는공기중이나진공하에서말린후 MALDI-TOF-MS를사용하여분석했다. 14
Ⅲ. 결과및토의 (Results and Discussion) 기판위에증착된탄소나노튜브의길이에따라결과에차이가있음 을볼수있었다 ( 표 3). 제공처서울대학교충남대학교일진나노텍 NanoLab Nanocs 성균관대학교 성장길이 <5μm <5μm >100μm <5μm >5μm <5μm Activity Active Active Inactive Active Inactive Active 표 3. 탄소나노튜브의길이에따른 Activity. 위의표에서알수있듯이탄소나노튜브의성장길이가 5μm 이하일경우시료의이온화가잘일어나서결과를얻을수있었지만, 그이상일경우시료의이온화가일어나지않아서스펙트럼을얻을수없었다. 각탄소나노튜브에대한분석결과는제공처에따라분리하여아래에기술한다. 15
[1] 탄소나노튜브 plate( 서울대학교제공 ) 의결과서울대학교에서제공한탄소나노튜브 plate에여러종류의시료를 dropping 하여분석하였다. 시료의용액이가지는소수성과탄소나노튜브가가지는표면의소수성때문에시료가 tip의끝에서잘떨어지지않아서 10% ACN을첨가하여좀더쉽게 dropping 될수있도록하였다. Substance P 100pmole, 10pmole을분석한결과깨끗한스펙트럼을얻을수있었다 ( 그림 3). 스펙트럼을통해이온화가매우잘일어난다는것을확인할수있었고, MH + ion signal 뿐만아니라, MNa +, MK + ion의 signal도관찰되었다. TFA(Trifluoroacetic acid) 에의한이온화효과를알아보기위해시료용액에 0.1% 의 TFA를첨가한뒤분석해보았더니 ion signal의크기도증가할뿐만아니라, Signal to Noise(S/N) 도약 5배정도증가하는것을관찰할수있었다 ( 그림 4). TFA가산이기때문에양성자를풍부하게가지고있어서양성자를더잘전달해줌으로써시료의이온화의도움을주어 signal이더커지는효과를주는것이라판단된다. 16
그림 3. (a) Substance P 1ⅹ10-5 M(10% ACN) 1μL 분석 (10pmole). (b) Substance P 1ⅹ10-4 M(10% ACN) 1μL 분석 (100pmole). 17
그림 4. (a) Substance P 1ⅹ10-5 M(10% ACN) 1μL 분석 (10pmole). (b) Substance P 1ⅹ10-5 M(10% ACN, 0.1% TFA) 1μL 분석 (10pmole). 18
Trypsin 가수분해반응을수행한 lysozyme의분석결과, 5개이상의 digestion sequence가일치하는것을관찰할수있었다 ( 그림 5). 미지의단백질을효소를사용하여적당한길이로자른후분석하여얻은 sequence signal은데이터베이스검색을통해그단백질이무엇인지알아낼수있는정보를제공한다. 그작업을단백질의확인및동정화 (Protein Identification) 라고말하는데 lysozyme의경우를살펴보았을때, 탄소나노튜브 plate가단백질의확인및동정화에도문제없이사용될수있으리라판단된다. 다음의표는 lysozyme을 trypsin으로가수분해하였을때얻을수있는 sequence의분자량 (MH + ) 을나타내었다 ( 표 4). 표 4에서살펴보면 Num 5, 6, 7, 8, 9, 13, 16에해당하는 MH + signal을그림 5에서찾아볼수있다 ( 스펙트럼상에 * 표시된 signal). 19
그림 5. Trypsin 에의해가수분해된 lysozyme 의 mass spectrum (* 표시된 signal 은 lysozyme digestion sequence signal 이다 ). 20
21 Gly-Cys-Arg- 9.05 334.40 126-128 17 Leu- 6.04 132.18 129-129 18 Gly-Thr-Asp-Val-Gln-Ala-Trp-Ile- Arg- 7.04 1046.17 117-125 16 Cys-Lys- 9.30 249.33 115-116 15 Asn-Arg- 10.65 289.31 113-114 14 Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asn-Gly-Met- Asn-Ala-Trp-Val-Ala- 7.04 1676.90 98-112 13 Lys- 9.47 147.20 97-97 12 Asn-Leu-Cys-Asn-Ile-Pro-Cys- Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ile- Thr-Ala-Ser-Val-Asn-Cys-Ala-Lys- 5.84 2335.71 74-96 11 Thr-Pro-Gly-Ser-Arg- 10.80 517.56 69-73 10 Trp-Trp-Cys-Asn-Asp-Gly-Arg- 6.09 936.02 62-68 9 Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr- Gly-Ile-Leu-Gln-Ile-Asn-Ser-Arg- 3.92 1754.85 46-61 8 Phe-Glu-Ser-Asn-Phe-Asn-Thr- Gln-Ala-Thr-Asn-Arg- 7.02 1429.49 34-45 7 Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly-Asn-Trp-Val- Cys-Ala-Ala-Lys- 8.91 1268.46 22-23 6 His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg- 7.57 874.97 15-21 5 Arg- 10.76 175.21 14-14 4 Cys-Glu-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-Lys- 6.30 836.04 6-13 3 Val-Phe-Gly-Arg- 11.10 478.57 2-5 2 Lys- 9.47 147.20 1-1 1 Sequence pi MH + From- To Num Trypsin digestion sequence Gly-Cys-Arg- 9.05 334.40 126-128 17 Leu- 6.04 132.18 129-129 18 Gly-Thr-Asp-Val-Gln-Ala-Trp-Ile- Arg- 7.04 1046.17 117-125 16 Cys-Lys- 9.30 249.33 115-116 15 Asn-Arg- 10.65 289.31 113-114 14 Ile-Val-Ser-Asp-Gly-Asn-Gly-Met- Asn-Ala-Trp-Val-Ala- 7.04 1676.90 98-112 13 Lys- 9.47 147.20 97-97 12 Asn-Leu-Cys-Asn-Ile-Pro-Cys- Ser-Ala-Leu-Leu-Ser-Ser-Asp-Ile- Thr-Ala-Ser-Val-Asn-Cys-Ala-Lys- 5.84 2335.71 74-96 11 Thr-Pro-Gly-Ser-Arg- 10.80 517.56 69-73 10 Trp-Trp-Cys-Asn-Asp-Gly-Arg- 6.09 936.02 62-68 9 Asn-Thr-Asp-Gly-Ser-Thr-Asp-Tyr- Gly-Ile-Leu-Gln-Ile-Asn-Ser-Arg- 3.92 1754.85 46-61 8 Phe-Glu-Ser-Asn-Phe-Asn-Thr- Gln-Ala-Thr-Asn-Arg- 7.02 1429.49 34-45 7 Gly-Tyr-Ser-Leu-Gly-Asn-Trp-Val- Cys-Ala-Ala-Lys- 8.91 1268.46 22-23 6 His-Gly-Leu-Asp-Asn-Tyr-Arg- 7.57 874.97 15-21 5 Arg- 10.76 175.21 14-14 4 Cys-Glu-Leu-Ala-Ala-Ala-Met-Lys- 6.30 836.04 6-13 3 Val-Phe-Gly-Arg- 11.10 478.57 2-5 2 Lys- 9.47 147.20 1-1 1 Sequence pi MH + From- To Num Trypsin digestion sequence 표 4. Trypsin 으로가수분해한 lysozyme 의 sequence 와분자량 (MH+).
분석한모든시료의스펙트럼을깨끗하게얻을수있었으며, 매트 릭스를쓰지않고도시료의이온화가잘일어나는것을확인할수있었 다. [2] 탄소나노튜브 plate( 충남대학교제공 ) 의결과충남대학교에서제공한탄소나노튜브 plate의경우 CVD법으로탄소나노튜브를증착시키기전에 mask를제작하여기판위에올려놓음으로써원하는패턴을형성하여탄소나노튜브가그부분에만증착될수있게하였다. 덕분에일반적인 MALDI plate와비슷한모양을갖출수있었다. 그림 6. 패턴을형성한탄소나노튜브 plate 의 MALDI 장착모습. 22
그림 7. 다양한농도의 Substance P 분석결과. 23
탄소나노튜브 plate의감도가어느정도인지알아보기위해 10pmole, 1pmole, 100fmole, 10fmole의시료를제조하여다양한농도의 Substance P를분석해보았다 ( 그림 7). 분석결과, 100fmole 수준까지스펙트럼을얻을수있었으며매트릭스를사용하여분석한것이상으로감도가매우좋은것을확인할수있었다. MALDI-TOF의장점중에하나가혼합물의분석이가능하다는것이다. 혼합물을분석할때별다른분리과정이필요없고, 한번의분석으로다양한시료의질량을확인할수있다. 탄소나노튜브 plate에서도혼합물의분석이가능한지알아보기위해 Substance P 30pmole, Angiotensin 80pmole, Bradykinin 100pmole을혼합하여분석해보았다. 또한분석에방해가되는일부불순물들을제거하기위해시료에소량의 beads를섞어분석해보기도하였다 ( 그림 8). 실험결과, 혼합된모든시료의 signal을얻을수있었으며, 특히 beads 를사용한경우불순물제거효과로인해 MH + ion signal 이눈에 띄게커져서더깨끗한스펙트럼을얻을수있었다. 그림 8(b) 에서는 beads 를사용했을경우 Signal to Noise(S/N) 가현저히커지고, MNa + ion 과 MK + ion 의 signal 이줄어들고 MH + ion signal 이커진스펙트럼 을보여준다. 24
그림 8. 혼합물분석 (a) 혼합시료 (b) 혼합시료 +beads 25
고분자량을갖는시료의분석이가능한지확인하기위해 Insulin을포함하는새로운혼합시료를만들어분석해보았다. 일반적으로시료의분자량이 5000Da 이상일경우 Linear Mode로분석하는데, Insulin의분자량이약 5700Da 이기때문에 Angiotensin 40pmole, Bradykinin 50pmole, Insulin 50pmole을섞어서 Linear Mode, Accelerating Voltage: 25000V, Grid Voltage: 94%, Guide Wire: 0% 의조건하에서분석하였다. 이온화효과를높이기위해서이미앞선실험에서효과가입증되었던 0.1% TFA와 beads를시료에처리하였다 ( 그림 9). 그림 9 를살펴보면혼합한시료속의세가지시료의 ion signal을모두얻을수있었다. 탄소나노튜브 plate는저분자량을갖는시료뿐아니라, 고분자량을갖는시료에도적용이가능하며넓은분자량범위의시료에사용될수있다는가능성을볼수있었다. 또한넓은분자량범위를갖는혼합물에도분석이가능해서, 기존의 MALDI-TOF의장점을그대로살려별도의분리과정없이혼합물분석을쉽게할수있음을확인할수있었다. 26
그림 9. Insulin 을포함한혼합시료의분석결과. 27
MALDI-TOF에사용되는레이저는 plate로부터시료를탈착시킴으로서이온화될수있도록도와주는아주중요한요소이다. 레이저세기가너무약하면시료가탈착될수없어서스펙트럼을전혀얻을수없고, 반대로너무강하면시료가손상을입거나 Noise의 signal이커져서깨끗하지않은스펙트럼을얻게된다. 그러므로적정한레이저세기를사용하여시료를분석하는것은좋은결과를얻기위해매우중요한과정이다. 탄소나노튜브 plate를사용한실험의경우적정한레이저의세기가얼마인지알아보기위해레이저세기를변경하며실험을수행하였다. 레이저의세기는 1736부터시작하여 50단위로올렸으며 2086까지세기를변경하며탄소나노튜브 plate위에동일한위치를분석하였다. 분석결과, 레이저세기가 2036일때가세기면에서나 S/N 면에서가장적절한스펙트럼을얻을수있었고, 레이저세기가 1736일경우에는레이저가약해서시료의이온화가잘일어나지않아너무작은 signal을얻게되었다. 레이저세기를 2086으로조정하여분석하였을때는 Noise의 signal이커져서레이저세기에따른효과를쉽게판단할수없었다. 즉, 실험을통해적정수준의레이저세기가 2000 부근이라는것을확인할수있었다. 28
그림 10. 레이저세기에따른 Substance P 의스펙트럼 레이저세기 (a) 2036 (b) 1886 (c) 1786 (d) 1736. 29
[3] 탄소나노튜브 plate( 성균관대학교제공 ) 의결과성균관대학교에서제공한탄소나노튜브 plate는두가지종류였다. 크게보면 PECVD법을사용하여증착시킨것이라는점에서동일하지만, 세부적으로 dcpecvd와 MPECVD의두가지로나눠졌다. dcpecvd 방법으로증착시켰을경우길이의조절이더자유로워서 1~2μm 정도의길이를쉽게만들어낼수있었고, MPECVD 방법을사용하여증착시킨경우길이의세밀한조절이쉽지않아서약 10μm 길이의탄소나노튜브 plate를얻을수있었다. 두가지종류의탄소나노튜브를사용하여 Angiotensin 100pmole을분석해보았지만, 처음에예상했던것과같이길이가 5μm 이하인 dcpecvd 방법을사용한탄소나노튜브에서는좋은결과를얻을수있었지만비교적길이가길게성장한 MPECVD법을사용한탄소나노튜브에서는그에못미치는결과를얻었다. 같은시료를떨어뜨려같은조건에서분석한결과, dcpecvd법을사용하여분석했을때는깨끗한스펙트럼을얻은반면, MPECVD법을사용하여분석한경우 Noise가크게나왔고, 스펙트럼의세기도훨씬떨어지는것을관찰할수있었다 ( 그림 11). 30
그림 11. Angiotensin 100pmole 분석스펙트럼 (a) dcpecvd 법으로증착 (b)mpecvd 법으로증착. 31
[4] 탄소나노튜브 plate( 구입처 : NanoLab) 의결과미국의탄소나노튜브생산전문업체인 NanoLab(Newton, MA, USA) 에서 Stainless steel을기판으로하여 PECVD법으로수직증착시킨탄소나노튜브 plate를구입하였다. 기판은가로 10mm. 세로 10mm 의정사각형모양이며, 기판의두께는 0.25mm였다. 탄소나노튜브의성장길이는약 4μm이며, 성장된탄소나노튜브의직경은약 100nm였다. 탄소나노튜브기둥간의거리는약 200~300nm이며, 기판에성장된기둥의개수는 926개라는정보를 NanoLab을통해얻을수있었다. 시판되는탄소나노튜브는파우더형태가대부분이고, 기판위에성장시킨탄소나노튜브의경우길이가길어서결과가나오지않았었는데, NanoLab에서구입한탄소나노튜브 plate는길이가 5μm 이하여서결과에대한기대치를높일수있었고기대했던것처럼분석결과를얻을수있었다. Substance P 30pmole을분석한결과, MH + ion signal이크게검출되었고 ( 그림 12), 다른탄소나노튜브 plate에서얻은결과들과마찬가지로 TFA와 beads에의한이온화효과가향상되는것을관찰할수있었다. 32
그림 12. NanoLab 에서구입한탄소나노튜브 plate 를사용하여얻은 Substance P 30pmole 분석스펙트럼. 33
[5] 탄소나노튜브 plate( 구입처 : 일진나노텍, Nanocs) 의결과기판위에증착된길이가 100μm 이상인일진나노텍의탄소나노튜브와 Nanocs에서구입한탄소나노튜브의경우같은실험을수행하여도스펙트럼을전혀얻을수없었다. 처음에언급한바와같이탄소나노튜브의성장길이가결과에영향을미치는것으로판단된다. 위의 [1]~[5] 에해당하는결과를종합해보았을때, 처음제기한바와같이탄소나노튜브의성장길이가결과에큰영향을미친다고결론내릴수있었다. 탄소나노튜브의길이가 5μm 이상으로길경우, 분석을위해 dropping한시료가너무깊게흡수되어레이저에의해쉽게탈착되지못하여이온화가일어나지않을것이라추측하고있다. 하지만, MALDI의이온화메커니즘이아직정확히규명되지않았듯이, 탄소나노튜브 plate를사용한방법역시이온화메커니즘을정확히알수없어서결과를정확히해석하기는쉽지않다. 34
Ⅳ. 결론 (Conclusion) 탄소나노튜브 plate를여러대학과전문생산업체로부터제공받아기존의 MALDI-TOF의단점을극복하고자시도하였다. 매트릭스를사용하지않고시료를잘이온화시킬수있는탄소나노튜브 plate는 Silicon wafer 위에 PECVD, Thermal CVD법등으로탄소나노튜브를수직증착시킨형태이다. 여러종류의펩타이드와단백질을탄소나노튜브 plate에 dropping하여분석한결과, 감도와세기면에서매우좋은스펙트럼을얻을수있었고, 장기간의보관후에도변함없는성능을관찰할수있었다. 시료용액에 TFA와 beads를첨가한경우, 첨가하기전보다 ion signal은더커지고 noise는작아지는효과를확인할수있었다. 하지만탄소나노튜브의성장길이와분석결과간에밀접한관련이있어서탄소나노튜브가기판위에서 5μm 이하로성장하도록조건을갖추어주는것이매우중요했다. 탄소나노튜브를 MALDI-TOF에적용시킨연구는아직초기단계이다. 더욱이기판위에탄소나노튜브를수직증착시켜서 sample plate와같은역할을하도록적용시킨본연구와같은경우는아직보고된바가없다. 이온화메커니즘이정확히규명되지않았으며, 탄소나노튜브의성장길이와이온화효율간의상관관계를명확히알수는없지만탄소나노튜브 plate의도입과적용은저분자량을갖는시료뿐아니라다양한 35
범위의시료의분석에매우용이하고광범위하게사용될수있으리라 기대해본다. 36
Ⅴ. 참고문헌 (References) 1. Karas, M.; Hillenkamp, F. Anal. Chem. 1988, 60, 2299-2301 2. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yosida, Y.; Yosida, T. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151-154 3. Cuiffi, J. D.; Hayes, D. J.; Fonash, S. J.; Brown, K. N.; Jones, A. D. Anal. Chem. 2001, 73, 1292-1295. 4. Merchant, M.; Weinberger, S. R. Electrophoresis 2000, 21, 1164-1177. 5. Zou, H.; Zhang, Q.; Guo, Z.; Guo, B.; Zhang, Q.; Chen, X. Angew. Chem.,Int. Ed. 2002, 114, 668-670. 6. Go, E. P.; Prenni, J. E.; Wei, J.; Jones, A.; Hall, S. C.; Witkowska, H. E.; Shen, Z.; Siuzdak, G. Anal. Chem. 2003, 75, 2504-2506. 7. Shen, Z.; Thomas, J. J.; Averbuj, C.; Broo, K. M.; Engelhard, M.; Crowell, J. E.; Finn, M. G.; Siuzdak, G. Anal. Chem. 2001, 73, 179-187. 8. Han, M.; Sunner, J. J. AM. Soc. Mass Spectrom. 2000, 11, 644-649 9. Sunner, J.; Dratz, E.; Chen, Y.-C. Anal. Chem. 1995, 67, 4335-4342 10. Wei, J.; Buriak, J. M.; Siuzdak, G. Nature 1999, 399, 243-246. 37
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감사의글 2000년 3월, 대학에입학한이후로 6년이흘러어느덧졸업을눈앞에두고있습니다. 많은분들의관심과사랑으로대학생활을무사히마칠수있었기에졸업을앞둔지금, 이렇게감사의마음을전할수있게되어기쁘게생각합니다. 학부때부터석사과정을마칠때까지학문적인가르침뿐만아니라사람들과어울려살아가는법을가르쳐주신최영식교수님께깊은감사를드립니다. 바쁘신와중에도논문에신경써주신노철언교수님과이완인교수님께감사드립니다. 저에게많은관심을가져주시고늘좋은말씀을해주신김유항교수님과이익모교수님께도감사의말씀을전합니다. 훌륭하신화학과교수님들께서계셨기에제가화학이라는학문을선택한것에대해한번도후회하지않았던것같습니다. 진심으로감사드립니다. 실험에많은도움을주시고, 실험실생활에아무문제가없도록실험실을잘이끌어가주신구일오빠와두원오빠에게고맙다는말을전하고싶습니다. 이제는유부남이되어더욱책임이막중해진천기오빠, 여러가지로고마웠고남은대학원생활도성공적으로마칠수있기를바란다는말을전합니다. 틈틈이연락주시며많은관심을가져주신졸업생선배님들께도감사의말씀을전합니다. 저의뜻을잘따라준귀여운후배들정미, 선미, 정연, 부영. 언제나웃는얼굴보여준덕분에저에게많은힘이되었다고남은학교생활도지금처럼만잘해나가길바란다고말하고싶습니다. 화학과 5자매영림언니, 은영, 지선, 유정. 내가학교생활을잘할수있었던건변치않는우정이있었기때문이야. 앞으로도평생우정 39
간직하며서로를소중히생각하자. 함께수업을들으며친해질수있었던현기오빠, 동현오빠, 성훈오빠, 용주오빠, 진필오빠그밖에많은 97 학번오빠들. 항상관심가져주시고격려해주셨던충환오빠, 승용오빠, 정호오빠, 재웅오빠. 언제나상냥하게대해주셨던수정언니, 화경언니, 승희언니, 정은언니, 수진언니, 효경언니. 너무착하고성실한윤희, 모든걸열심히하는희준, 항상재미있었던은표오빠. 이밖에도이름을일일이열거하기어려울정도로많은분들의도움이있었기에 6년간의학교생활을무사히마칠수있었습니다. 진심으로감사의말을전하고싶습니다. 10년간의우정을지키며항상옆에서응원해준사랑하는친구들지은, 진하, 달, 혜미, 지영, 세정, 정희, 현주, 경란, 성연, 한진에게도고맙다는말을전합니다. 학교생활을잘마무리할수있도록너무나많은도움을준사랑하는영석오빠. 항상받기만한것같아서미안한마음도있지만늘옆에있어줘서고맙다는말을꼭하고싶습니다. 지금의저를있게한것은가족들의사랑과관심이가장컸다고생각합니다. 첫째손녀딸이제일이라며 26년간변치않는사랑을보내주신할머니, 항상큰딸의의견을존중해주시며성원해주셨던사랑하는부모님, 날이갈수록예뻐지는하나뿐인동생우리경진이. 저에게가족의사랑을느끼게해주셨던모든가족들께이글을빌어감사하다는말과사랑한다는말을전하고싶습니다. 또다시새로운출발의기로에서있는지금, 저에게관심을가져주시고사랑해주신모든분들의기대를져버리지않도록끊임없이노력하여더나은모습을보여드리는수진이가되겠습니다. 감사합니다. 2005년 12월 22일신수진 40