JOrientalRehabMed 2010;20(1):1-12 냉성어혈약침이외상성뇌손상흰쥐의신경학적회복과 BAX, BCL-2 의발현에미치는영향 조주현 최진봉 동신대학교한의과대학한방재활의학과교실 Effects of Cool Pharmacopuncture for Static Blood into Hyolhae(Sp10 ) on Neurological Recoverment and BAX, BCL-2 Expression in the Experimental Traumatic Brain Injury Rats Joo-Hyun Cho, O.M.D., Jin-Bong Choi, O.M.D., Ph.D. Dept. of Oriental Rehabilitation Medicine, College of Oriental Medicine, Dong-Shin University Objectives: CoolPharmacopunctureforstaticbloodisafamouspharmacopuncturetreatmentthattreateddiseasecausedbystaticblood.Hyolhae(Sp10)isalsoa famouspointofacupuncturethattreatedthat.thisstudywasdesignedtoevaluatetheefectsofcoolpharmacopunctureforstaticbloodinto Hyolhae(Sp10)onBAXandBCL-2expresionintheexperimentaltraumaticbraininjury(TBI)rats. Methods: Maleratsweredividedinto3groups.Ⅰ wasnotreatmentaftertbi.Ⅱ wastreatmentwithneedle-prickacupunctureaftertbi.Ⅲ wastreatmentwith CoolPharmacopunctureforstaticbloodintoHyolhae(Sp10)afterTBI. Theauthorcariedoutneurologicalmotorbehavioraltest,histologicalasesmenttest.Neurologicalmotorbehaviortestsconsistofrotarodtest,beam-walking testandposturalreflextest.inthehistologicalassessmenttest,baxandbcl-2expression,hematoxylin&eosinstainingwereexperimented. Results: Inneurologicalmotorbehaviortests,motorandcognitivefunctionrecoverywassignificantlyincreasedintheⅡ,Ⅲ ascomparedwithⅠ(p<0.05). EspecialyⅢ wassignificantlyincreasedascomparedwithⅡ(p<0.05).baxexpressionwassignificantlydecresedinorderoftheⅢ,Ⅱ,Ⅰ after7and 14dayslater.BCL-2expresionwasinvestigatedinthe Ⅲ,Ⅱ ascomparedwithⅠ.especialymostincresedexpresionwasexperimentedintheⅢ. Conclusions: Acordingtotheaboveresults,CoolPharmacopunctureforstaticbloodcaninhibitapoptosisofcelsafterTBIinratsbycontolofBAXandBCL expression. Keywords:Sp10,CoolPharmacopunctureforstaticblood,Traumaticbraininjury,BAXandBCL-2expresion,Neurologicalmotorbehavioraltest 접수 :2009 년 1월 6일, 수정 :2010 년 1월 13 일, 채택 :2010 년 1월 16 일 교신저자 : 최진봉, 광주광역시남구월산동동신대학교광주한방병원한방재활의학과 Tel:(062)350-7219,E-mail:jy1907@hanmail.net 1
Ⅰ. 서론 외부적으로가해지는외상으로인해뇌가손상되는외상성뇌손상 (TBI:traumaticbraininjury) 은최근들어교통사고, 낙상, 폭력, 스포츠손상등의결과로증가하고있는추세이며, 신경학적증상으로일차적인기계적손상에이차손상이점진적으로복합되어져나타나는것으로보고되고있다 1). 대부분의뇌손상의일차적손상기전은가속- 감속에의해발생하며, 미만성축상손상과뇌손상이특징적인현상이며, 이차적뇌손상에는뇌내출혈, 뇌부종, 흥분성세포독성, 산화제손상, 및뇌관류압력저하로발생된저산소증등이이에해당한다. 결론적으로외상성뇌손상은여러가지일차적및이차적기전에의해국소적인손상보다는광범위한손상을야기하며, 개개인에따라다양한신경학적, 신경정신학적장애를발생시킨다 2). 한편血海 (Sp10) 는足太陰脾經의經穴로슬개골내측상방 2 寸에위치하고, 穴性은調血和營, 淸瀉血熱, 宣通下焦, 健脾利濕등이며, 主治症은血熱證, 血瘀證, 血虛證, 出血證등이다 3,4). 또한냉성어혈약침은치자, 적작약, 택란, 황련, 황금, 황백등으로구성되어있고化瘀기능에淸熱瀉火, 祛瘀消腫, 活血通經등의기능이추가되어있는약침이다 5). 최근외상성뇌손상으로인한병태생리가차츰밝혀지면서韓醫學에서도이분야에대한연구가이루어지고있다. 외상성뇌손상을유발한흰쥐에인삼사포닌을투여하여신경보호작용에대한연구 6) 가보고된바있고, 홍삼을처방하여 BAX 와 BCL-2 의발현에유의한효과가있었음이보고 7) 된연구등이있다. 또한血海 (Sp10) 와약침 의뇌손상회복에대한연구도風池에천마약침을시술이뇌허혈에미치는영향 8) 을보고한논문과당귀약침의血海 (Sp10) 자입이뇌허혈에미치는영향 9) 에대한논문등이있으나외상성뇌손상과세포재생에대한연구는부족한실정이다. 이에본연구에서는외상성뇌손상을유발시킨후血海 (Sp10) 에냉성어혈약침을시술한뒤신경학적운동행동평가와조직화학적기법으로 BCL-2 와 BAX 유전자의발현을비교하여그효과를알아본결과유의성있는결과를얻었기에이에보고하는바이다. Ⅱ. 재료및방법 1. 재료 1) 실험동물본연구에서는체중이약 250±50g 의 Sprague -Dawley 계흰쥐 (8 주령, 웅성, 대한실험동물 ) 를각군당 20 마리씩할당하여 60 마리를사용하였다. 사육실온도는 25±1, 습도 55±10% 를유지하였으며, 명암은 12 시간주기로하였다. 고형사료 ( 삼양주식회사,Korea) 와물은자유롭게먹도록하였다. 외상성뇌손상을실험적으로일으킨후무작위로다음과같이세 group 으로나누어대조군인 Ⅰ(Control,n=20) 군과냉성어혈약침에비교하여일반적인침에의한치료를시도한 Ⅱ (Needle-Prickacupuncture,n=20) 군및냉성어혈약침을사용한 Ⅲ(CoolPharmacopunctureforstatic blood,n=20) 군으로나누었다 (TableⅠ). 2
냉성어혈약침이외상성뇌손상흰쥐의신경학적회복과 BAX,BCL-2 의발현에미치는영향 TableⅠ.ClassificationofEachGroups Group No. Intervention Ⅰ n=20 Notreatmentaftertraumaticbraininjury (controlgroup) Ⅱ n=20 TreatmentwithNeedle-Prickacupuncture aftertraumaticbraininjury Treatmentwith ColPharmacopuncturefor Ⅲ n=20 staticblodaftertraumaticbraininjury 2) 냉성어혈약침 500g 을처방 ( 치자 204g, 적작약 84g, 택란 84g, 황련 42g, 황금 42g, 황백 42g) 한약재를 채반에담아 ultrapurewater(3 차증류수기 Ulta Pure900,USA) 에세척하였다. 이후반응조하부 에약재를넣고 3 차증류수를부어서약 80-90 분 동안약재를불려주었다. 약재의불림이끝나면 105 120min 으로전탕을시작하고전탕이끝 나면호스의위치를증류냉각관쪽으로바꿔주 어서흐르게하고온도는 107 로올려주었다. 추출시간은 3 시간이상소요된다. 추출이끝나 고 1l PYREX 병에받아진약침액은무기염류 를침강시키기위해서하루동안냉장보관하였 다. 무기염류를침강시킨약침을상층액을분리 하여얻어내는데추출물을 ph Meter 기 (ORION, USA) 를사용하여 Na 3PO 4(Sodium phosphate) 를 첨가하여 ph 가 ph 7.25~7.35 가되게조절, 약전 소금 (NaCl) 을첨가하여 0.9% 등장액이되도록 염도계 (DEMTRA.Japan) 를이용하여조절하였 다. 이후 filter 장치를준비하고여과지 0.45 μm 0.2 μm 0.1 μm celulose 여과지 (whatman,germany) 로음압을이용하여여과하고고압증기멸균기 (highpressuresterilizer, 신진,Korea) 에넣어 30 분간 121,1.5 기압으로고압멸균한후냉장보 관하며사용하였다. 2. 실험방법 1) 외상성뇌손상유발 10) 외상성뇌손상을유발하기위해 weight-drop 형태의기구를사용한 Marmarou 10) 등의연구방 법을이용하였다. 실험동물의전신마취를유도 하기위하여마취챔버 (Royalmedical,Korea) 에 넣고 70% N 2O 와 28.5% O 2 가스에 1.5% 엔플루란 (enflurane) 을혼합시킨마취가스로흡입전신마취 후탄력성이있는 foam bed 위에흰쥐의전신을 올려놓아고정시켰다. 두부를삭모하고피부를 절개하여두개골을노출시키고 bregma 와 lambda 사이에직경 10 mm, 두께 3 mm의 stainlessteel disc 를고정하였다.Plaxiglastube 를흰쥐의두부 에있는 stainlessteeldisc 에수직으로고정하 고,450g 의추를 1m 높이에서관을통해자유 낙하시켜유발하였다. 실험이이루어지는동안 흰쥐의직장내체온을측정하고, 발열패드를 이용하여 36.5 ~37.5 를유지시켰다. 2) 냉성어혈약침의적용 외상성뇌손상유발 6 시간후부터실험기간동 안냉성어혈약침을양측血海에 0.1 ml씩 1 일 1 회주사하였다. 3. 결과측정 1) 신경학적운동행동검사 (Neurological motor behavioral test) 외상성뇌손상유발전, 유발 1 일후,7 일후, 14 일후에신경행동학적평가로 rotarodtest,beam -walkingtest,posturereflextest 의 3 가지로동일 평가자에의하여맹검방법을이용하여 3 회평가 하였다. 3
(1)Rotarodtest 11) Rotarodtest(rod: 직경 7.5 cm, 길이 10 cm, 높이 35 cm ) 는흰쥐의운동결손과균형유지를평가하기위해사용되었다. 처음 4rpm 으로시작하여 10 초당 4rpm 씩가속하여 20rpm 에서떨어지지않고몇초간버티는지 ( 최대 60 초까지 ) 측정하였으며,3 회측정하여평균값을비교하였다. (2)Beam-walkingtest 12,13) Beam-walkingtest 는전정감각의통합, 전정운동 (vestibulomotor) 의기능및정교한운동협응을평가하기위해사용되었다. 높이 30 cm의나무상자를마주보게배치하고폭 3cm, 길이 120 cm의나무막대를올려놓았다. 막대의한쪽끝은 20 16 20 cm의어두운상자를배치하고막대의반대끝에서상자를향해건너갈수있도록소리자극 (avoidancestimulus) 을적용하여막대를완전히건너는데걸리는시간 (sec) 을 3회측정하여평균값을비교하였다. (3)Posturalreflextest 14) 흰쥐를꼬리부터들어올려서바닥에천천히내려놓을때앞다리가대칭적으로바닥을짚으면 3점, 외상부위반대쪽의앞다리가몸통쪽으로굴곡되면 2점, 앞다리뿐만아니라어깨나몸통등도굴곡되면 1점을주었으며,3회측정하여평균값을비교하였다. 2) 조직학적검사 (Histological assessment) (1)Hematoxylin& eosin 와 cresylviolet 염색냉성어혈약침의효과를관찰하기위하여외상성뇌손상유발전,1 일후,7 일후,14 일후 ( 각시간대에 5마리씩 ) 에전신마취제인럼푼 (Rompun, Bayerkorea) 으로복강주사 (0.6 mg / kg ) 하여마취한후, 심장관류를통해 0.9% NaCl 용액으로관류수세하였다. 혈액이제거된후에는 4% 중성파라포름알데하이드 (paraformaldehyde) 로관류하여조직전고정을실시하였고, 전고정된실험동물로부터뇌를적출하여 24 시간동안 4% 파라포름알데하이드로후고정을실시하였다. 후고정이끝난조직은에탄올을이용한탈수 (dehydration) 과정과자일렌 (xylene) 을이용한청명 (cleaning) 과정을거쳐파라핀포매 (parafinembedding) 를실시하였다. 제작된파라핀블록 (parafinblock) 은미세절단기 (Sakura2040,Japan) 를이용하여 5μm두께로박절한후슬라이드에 mount 하여실온에서건조시킨후,Hematoxylin& eosin(h & E) 와 cresyl violet 염색을실시하였다. (2)BAX 와 BCL-2 의면역조직화학적염색파리핀포매된뇌조직절편을 5μm의두께로자른다음조직슬라이드에올린후,xylene 처리를하여탈파라핀과정을거치고여러단계의알코올로처리하여수화과정을거친뒤 3% hydrogen peroxide 에조직을담구어 30 분간 incubation 한후 phosphate-buferedsaline(pbs,ph 7.4) 에담궈씻어내었다. 일차항체로항 BAX 단백항체 (Santa Cruz Biotechnology,CA,USA), 항 BCL-2 단백항체 (Santa CruzBiotechnology,CA,USA) 를각각 1:500 의비율로희석하여조직에도포하고 4 에서 overnight 로 incubation 한후 PBS 로세척하였다.PBS 로씻은후 quickkit(dako LSAB R kit,dako Corp., Carpinteria,CA,USA) 의 biotinylatedanti-rabbit/ anti-mouseimmunoglobulins 를도포하여 30 분간 incubation 하였다.PBS 로세척한후 streptavidin peroxidase 를도포한후 10 분간 incubation 하였다. 다시 PBS 로씻어낸후 DAB(3,3`-diaminobenzidine, 4
냉성어혈약침이외상성뇌손상흰쥐의신경학적회복과 BAX,BCL-2 의발현에미치는영향 DAKO Corp.,Carpinteria,CA,USA) 용액을도포하여발색시켰다. 그후 hematoxyline 으로대조염색을실시후탈수및청명화과정을거친후봉입하였다. 의한차이를보였으며 (p=.003)Ⅱ 와 Ⅲ은유의한차이가없었다. 유발 14 일째에서 Ⅲ은 Ⅰ에비하여통계학적으로유의한차이를보였으나 (p=.003),Ⅱ 는유의한차이를보이지않았다 (TableⅡ,Fig.1). 3) 조직학적분석조직학적분석은광학현미경 (Olympus BX50, Japan) 에장착된 CCD 카메라 (Foculus,Germany) 와개인용컴퓨터를연결시켜 Image-proplusver 4.0forwindows(mediacybernetics,USA) 를사용하여관찰하였다. 4. 통계처리본연구의통계학적분석은 SPSS12.0ver.for windows 을사용하였다. 각군의실험결과는평균과표준편차로나타내었고, 각실험군간의시간경과에따른차이를비교하기위해일원배치분산분석 (one-wayanova) 을실시하였고, 사후검정은 Duncan`smultiplerangetest 를실시하였다. 분석시유의수준 α=0.05 로설정하여검정하였다. Ⅲ. 결과 1. 신경학적운동행동평가 1) Rotarod test 외상성뇌손상후냉성어혈약침의효과를알아보기위해각 group 간의 Rotarodtest 에대한측정시기에따른사후검정을실시한결과, 유발 7일째에서 Ⅱ Ⅲ 은 Ⅰ에비하여통계학적으로유 TableⅡ.ChangeofScoreonRotarodTestfolowing TimeLapsed (unit:sec) Days Groups Pre(baseline) 1 7 14 Ⅰ 57.20±1.48 16.60±2.41 25.20±4.97* 35.80±3.11* Ⅱ 57.40±2.07 17.00±1.87 30.40±2.97 39.40±2.97* Ⅲ 57.00±2.35 17.60±2.41 34.80±1.48 43.20±1.79 Valuesareshowedmean±SD. *, :Valuewithdiferentsuperscriptsinthesamecolumn (days)aresignificant(p<.05)byduncan'smultiplerangetest. Ⅰ :Controlgroup Ⅱ :Needle-Prickacupuncturetreatedgroup Ⅲ :ColPharmacopunctureforstaticbloodtreatedgroup Fig.1.Changeofscoreonrotarodtestfolowingtime lapsed. Valuewithdiferentsuperscriptsinthesamecolumn (days)aresignificantbyduncan'smultiplerangetest (a,b;p<.05) 2) Beam-walking 검사 외상성뇌손상후냉성어혈약침의효과를알 아보기위해각 group 간의 Beam-walking 검사 에대한측정시기에따른사후검정을실시한결 과, 유발 7 일후에서 Ⅰ 과 Ⅱ Ⅲ 은통계학적으로 유의한차이를보였으나 (p=.010),Ⅱ 와 Ⅲ 은유의 한차이를보이지않았다. 유발 14 일후에서는 5
Ⅰ 은 Ⅱ Ⅲ 그리고 Ⅱ 는 Ⅲ 과각각통계학적으로 유의한차이를보였다 (p=.000)(tableⅢ,fig.2). Table Ⅲ.Change ofscore on Beam-Walking Test folowingtimelapsed (unit:sec) Days Groups Pre(baseline) 1 7 14 Ⅰ 10.60±1.14 30.40±2.61 26.60±3.21* 23.60±1.95* Ⅱ 10.40±1.67 29.80±1.92 21.80±2.59 19.80±1.92 Ⅲ 10.20±1.79 31.20±3.56 20.80±1.92 17.00±1.00 Valuesareshowedmean±SD. *,, :Valuewithdiferentsuperscriptsinthesamecolumn (days)aresignificant(p<.05)byduncan'smultiplerangetest. Ⅰ :Controlgroup Ⅱ :Needle-Prickacupuncturetreatedgroup Ⅲ :CoolPharmacopunctureforstaticblodtreatedgroup Table Ⅵ.Change ofscore on PosturalReflex Test folowingtimelapsed (unit:sec) Days Groups Pre(baseline) 1 7 14 Ⅰ 3.00±0.00 1.20±0.45 1.40±0.55 1.80±0.45* Ⅱ 3.00±0.00 1.20±0.45 1.60±0.55 1.80±0.45* Ⅲ 3.00±0.00 1.00±0.00 1.80±0.45 2.60±0.55 Valuesareshowedmean±SD. *, :Valuewithdiferentsuperscriptsinthesamecolumn (days)aresignificant(p<.05)byduncan'smultiplerangetest. Ⅰ :Controlgroup Ⅱ :Needle-Prickacupuncturetreatedgroup Ⅲ :ColPharmacopunctureforstaticbloodtreatedgroup Fig.2.Changeofscoreonbeam-walkingtestfolowing timelapsed. Value with diferentsuperscriptsin thesame column (days)aresignificantbyduncan'smultiplerangetest (a,b,c;p<.05) 3) Postural reflex 검사 외상성뇌손상후냉성어혈약침의효과를알 아보기위해각 group 간의 Posturalreflex 검사에 대한측정시기에따른사후검정을실시한결과, 유발 14 일후에서 Ⅰ 과 Ⅱ 는통계학적으로유의 한차이를보이지않았으나,Ⅰ Ⅱ 와 Ⅲ 은통계 학적으로유의한차이를보였다 (p=.033)(tableⅥ, Fig.3). Fig.3.Changeofscoreonposturalreflextestfolowing timelapsed. Value with diferentsuperscriptsin the samecolumn (days)aresignificantbyduncan'smultiplerangetest (a,b;p<.05) 2. 조직학적검사 1) H & E 와 cresyl violet 염색 외상성뇌손상유발후 H & E 와 cresylviolet 염색을실시한결과, 좌측두정엽및전두엽에 출혈성병변과손상부위주변으로미소공포형성, 핵과세포질의위축, 신경세포주위의신경교세 포의팽윤, 신경망의공포형성등의신경병리학적 소견을확인할수있었다 (Fig.4). 6
냉성어혈약침이외상성뇌손상흰쥐의신경학적회복과 BAX,BCL-2 의발현에미치는영향 Fig.4.Photographsshowingthemorphologicalfeatures oftraumaticbraininjury. (A:H &E staining,b:cresylvioletstaining, 200) 2) 면역조직화학염색 (1)BAX 염색 흰쥐의 Cerebral-cortex 부분에서 BAX 단백질 발현을면역조직화학염색을통하여관찰한결과, 유발 7 일후에는 Ⅰ 에비해 Ⅱ Ⅲ 은다소감소된 면역반응을보였으며, 유발 14 일후에는 Ⅰ Ⅱ 는 다소감소된면역반응을 Ⅲ 에서현저히감소된 면역반응을확인할수있었다 (TableⅤ,Fig.5,6). TableⅤ.EfectofColdEo-HyeolHerbalAcupuncture onbax Expressionsin CerebralCortexof TBIRats Group Time(day) Pre 1d 7d 14d Ⅰ - +++ +++ ++ Ⅱ - +++ ++ ++ Ⅲ - +++ ++ + -:Negative,+ :Weak positive,++ :Moderatepositive, +++:Strongpositive Ⅰ :Controlgroup Ⅱ :Needle-Prickacupuncturetreatedgroup Ⅲ :CoolPharmacopunctureforstaticblodtreatedgroup Fig.6.Representative sectionsofbax expressionsin cerebralcortexaftertraumaticbraininjury-induced 14day. (A:Controlgroup,B:Needle-Prickacupuncturetreated group,c :CoolPharmacopuncture forstatic blood treatedgroup, 400) (2)BCL-2 염색 흰쥐의 cortex 부분에서 BCL-2 단백질발현을 면역조직화학염색을통하여관찰한결과, 유발 1 일후에는모든 group 에서발현이관찰되지않 았고,7 일후에 Ⅱ 와 Ⅲ 에서다소증가된면역반 응을보였다. 유발 14 일후에는 Ⅲ 에서더욱증 가된면역반응을확인할수있었다 (TableⅥ,Fig. 7,8). TableⅥ.EfectofColdEo-HyeolHerbalAcupuncture onbcl-2expressionsincerebralcortexof TBIRats Group Time(day) Pre 1d 7d 14d Ⅰ - - - - Ⅱ - - + + Ⅲ - - + ++ -:Negative,+:Weakpositive,++:Moderatepositive +++:Strongpositive Ⅰ :Controlgroup Ⅱ :Needle-Prickacupuncturetreatedgroup Ⅲ :ColPharmacopunctureforstaticbloodtreatedgroup Fig.5.Representative sectionsofbax expressionsin cerebralcortexaftertraumaticbraininjury-induced 7day. (A:Controlgroup,B:Needle-Prickacupuncturetreated group,c :CoolPharmacopuncture forstatic blood treatedgroup, 400). Fig.7.RepresentativesectionsofBCL-2expressionsin cerebralcortexaftertraumaticbraininjury-induced 7day. (A:Controlgroup,B:Needle-Prickacupuncturetreated group,c :CoolPharmacopuncture forstatic blood treatedgroup, 400) 7
Fig.8.RepresentativesectionsofBCL-2expressionsin cerebralcortexaftertraumaticbraininjury-induced 14day. (A:Controlgroup,B:Needle-Prickacupuncturetreated group,c:coolpharmacopunctureforstaticbloodtreated group, 400) Ⅳ. 고찰 뇌세포는허혈, 외상, 저산소증, 저혈당, 감염 등여러가지외부손상에매우민감하며, 일차적 손상으로인해뇌에많은장애가유발되고, 이어 발생되는이차적신경손상은환자의예후를더욱 악화시키는역할을하기때문에이를위한다양 한치료와연구가이루어지고있다. 이와관련하 여외상성뇌손상시유병률이나사망률을낮추 기위해여러가지동물실험모델들이연구되고 있다 14). 흰쥐는인간의두부외상시초기단계부 터유사하게재현되기는어렵지만뇌조직에변형 을가져오게되어신경학적결과를나타내는데, 이는인간의두부외상시와유사하여외상성뇌 손상모델로서가치가인정되고있다 15). Apoptosis 는정상적인세포의성장과정이나 병리적인원인등에의해일어나며형태학적으로 는세포의크기축소, 염색질의응축및 apoptotic body 등을특징으로하는세포사의한형태로서 1972 년에 Ker 등에의해소개된이후의학계나 생물학계에서가장활발히연구되고있는분야들 중의하나이다 16,17).Apoptosis 가나타나는시기는 저자에따라차이가있다. 사람에서심하지않은 외상성뇌손상의경우에는신경세포자연사는 1 일째에서최고조로달하다가약 22 주까지지속된 다는보고가있으며 18), 실험동물의경우에는 2주이상자연사가지속되며, 충격 1시간후부터 2일까지자연사하는세포수가증가하다가 2일부터 2 주까지점차감소하는것으로보고되고있다,19,20). 본연구에서는 Marmarou 등 10) 의뇌손상유발방법을이용하여냉성어혈약침의血海 (Sp10) 시술효과를알아보기위해신경학적운동행동변화로 rotarod test,beam-walking test,postural reflextest 와신경세포의자연사관련주요인자로 BAX 와 BCL-2 단백질발현을면역조직화학적방법을통하여알아보았다. 血海 (Sp10) 는 혈액이모이는곳 이란뜻으로주로혈병을다스리다는의미이고, 이명은血郄, 白蟲窠이며足太陰脾經의경혈로슬개골內側상방 2촌에위치한다. 穴性은調血和營, 淸瀉血熱, 宣通下焦, 健脾利濕등이며, 主治는자궁내막염, 대하, 피부소양증, 단독등의血熱症, 빈혈, 經閉, 血虛頭痛, 痺證등의血虛證, 月經困難, 月經痛등의血瘀證, 기능성자궁출혈, 崩漏不止, 血尿, 痔出血등의出血證이다 2,3). 최근血海 (Sp10) 에대한연구로는흰쥐의중대뇌동맥을폐색시켜유발된허혈성뇌손상모델에대한血海 (Sp10) 당귀약침을실험하여공간학습능력및기억측정에서유효한회복이관찰되었고, 혈압자체의커다란변화없이혈류량이증가하며, 신경화학적변화에있어서도 hippocampalca1 에서 choline 성뉴런의보호작용에일정한효과를나타내었다 9). 그러나이외의연구논문에서는血海 (Sp10) 에시술시나타난부작용에관한보고 21), 효능및효능에다른灸횟수 22) 등에대한논문으로血海 (Sp10) 와외상성뇌손상에대한부분은부족한실정이었다. 저자는이러한고전문헌및기존의연구결과를바탕으로血海 (Sp10) 에대한한의학적효능이제반외상성뇌손상의유효하리라인식하여본연구에서선택하게되었다. 8
냉성어혈약침이외상성뇌손상흰쥐의신경학적회복과 BAX,BCL-2 의발현에미치는영향 약침요법이란그동안의침요법이질병의치료나예방을목적으로일정한경혈에물리적인자극을주던치료형태에서한단계더발전하여약재의화학적인자극을경혈에추가한방법이다 23). 약침요법은약효가신속하고치료용량이적으며약물이위장관에서파괴되는것을방지하고내복하기힘든환자에게사용할수있다는장점등이있으며국소부위자극, 전신작용의발현등의단점도있다 24). 본실험에사용되는냉성어혈약침은치자, 적작약, 택란, 황련, 황금, 황백등의化瘀시키는약물로구성 23) 되어있으며, 치자는淸熱瀉火凉血, 적작약은淸熱凉血, 活血祛瘀, 택란은活血通經, 황련, 황금, 황백은淸熱燥濕, 瀉火解毒의효능이있어 25), 냉성어혈약침은活血祛瘀, 消腫止痛의효능에, 淸熱瀉火, 解毒의작용이강화된어혈치료처방이다 5). 뇌혈관내병변이발생했을때중추신경계의손상을최소화할수있고, 회복시킬수있는방법이있다고하면그것은효과적인치료법이될것이다. 한의학에서는외상성뇌손상의경우東醫寶鑑 26) 에서打撲, 墜落등과상응한다고볼수있으며, 대부분어혈의관점으로다루고있는데, 이에저자는냉성어혈약침을血海 (Sp10) 에시술하여어혈성뇌졸중상태를개선시킬수있을것으로기대되어흰쥐에유발된외상성뇌손상모델을통한신경학적운동회복상태및세포재생을관찰하고자본실험을실행하게되었다. 냉성어혈약침의효과를위한검사로 rotarod test 에서는실험 group 간에외상성뇌손상유발 7일후와 14 일후에서통계학적유의한차이를보였고, 유발 7일째에서 Ⅱ Ⅲ 은 Ⅰ에비하여통계학적으로유의한차이를보였으며 (p=.003)Ⅱ 와 Ⅲ은유의한차이가없었다. 유발 14 일째에서 Ⅲ은 Ⅰ에비하여통계학적으로유의한차이를 보였으나 (p=.003),Ⅱ 는유의한차이를보이지않았다 (TableⅡ,Fig.1).Beam-walkingtest 에서도유발 7일후와 14 일후에서통계학적유의한차이를보였고, 유발 7일후에는 Ⅰ과 Ⅱ Ⅲ 에서, 유발 14 일후에 Ⅰ은 Ⅱ Ⅲ 과 Ⅱ는 Ⅲ과각각통계학적으로유의한차이를보였다 (TableⅢ,Fig. 2).Posturalreflextest 는유발 14 일후에 Ⅰ Ⅱ 는 Ⅲ과통계학적으로유의한차이를보였다 (Table Ⅳ,Fig.3). 신경세포의자연사에대한연구는노화또는암과같은질병과관련하여다각적인연구가진행되고있지만아직까지 apoptosis 에관한분자생물학적현상에대하여명쾌한경로는제시되지못하고있으며, 분자생물학적기전중가장명확한것이 BAX 및 BCL-2 의작용기전이다 27).BAX 와 BCL-2 는 BCL-2familyprotein 으로서사망신호를받은세포로하여금생존여부를결정하게하며이를기능상두군으로나눌수있다.BAX 는 BCL-2protein 과아미노산배열에서많은동족관계 (extensivehomology) 를가지고있으며,BAX protein 의과다발현은 apoptotic 세포사를가져오는반면,BCL-2 는 programmedceldeath(pcd) 를억제하고세포생존을촉진한다.BCL-2 의 antiapoptoticactivity 는 BAX protein 과 heterodimer 를형성하고 BAX 의 apoptosis 유도기능을차단한다.BAX 는 ROS 의과잉생성시발현증가되어 Apoptosis 를유도하는단백질로서 28), 미토콘드리아내에존재하는 cytochromec 를세포질내로유리시켜 caspase-3 의활성을유도하고 apoptosis 를유발시킨다 29). 반면에 BCL-2 는칼슘의항상성유지, 핵으로의 glutathione 이동증가, 항산화효소계의강화등을통해 apoptosis 를억제하는단백질로서 30), 이들 BAX 와 BCL-2 의발현비율에따른상반작용에의해세포의생사가결정된다. 즉, BAX 와 BCL-2protein 은세포의생사를조절하는 9
서로상반되는역할을한다 31).BCL-2 와 BAX 의유전자발현은산혈증, 저산소증, 저혈당증및성장인자이용도의변화등세포내, 외환경의구성요소에반응하며임상에서는악성종양, 중추신경계외상혹은질환에서의증가도보고되고있다 32,33). 본연구의결과에서 BAX 는외상성뇌손상유발 7일후에 Ⅰ에비해 Ⅱ Ⅲ 은다소감소된면역반응을보였으며, 유발 14 일후에는 Ⅰ Ⅱ 는다소감소된면역반응을 Ⅲ에서현저히감소된면역반응을확인할수있었다 (TableⅤ,Fig.5, 6).BCL-2 는유발 1일후에는모든 group 에서발현이관찰되지않았고,7 일후에 Ⅱ와 Ⅲ에서다소증가된면역반응을보였다. 유발 14 일후에는 Ⅲ에서더욱증가된면역반응을확인할수있었다 (TableⅥ,Fig.7,8). 이는냉성어혈약침치료시간의경과에따라 cerebralcortex 에서 BAX 발현감소와 BCL-2 발현증가로 apoptosis 를억제하기위한기전이작용된것으로사료된다. 위실험결과신경학적운동능력회복과유전자발현에서신경학적자연사를억제하는작용이있는것으로보아외상성뇌손상치료에응용할수있으리라생각되며이에대한지속적인연구가필요할것으로사료된다. V. 결론 일후에서통계학적유의한차이를보였고, 유발 7일째에서 Ⅱ Ⅲ 은 Ⅰ에비하여통계학적으로유의한차이를보였으며 Ⅱ와 Ⅲ 은유의한차이가없었다. 유발 14 일째에서 Ⅲ은 Ⅰ에비하여통계학적으로유의한차이를보였으나,Ⅱ 는유의한차이를보이지않았다 2. 신경학적회복검사를위해시행한 beam -walkingtest 에서도외상성뇌손상유발 7 일후와 14 일후에서통계학적유의한차이를보였고, 유발 7일후에는 Ⅰ과 Ⅱ,Ⅲ 에서, 유발 14 일후에 Ⅰ은 Ⅱ Ⅲ 그리고 Ⅱ는 Ⅲ과각각통계학적으로유의한차이를보였다. 3. 신경학적회복검사를위해시행한 postural reflextest 는외상성뇌손상유발 14 일후에통계학적으로유의한차이를보였고,Ⅰ Ⅱ 는 Ⅲ과통계학적으로유의한차이를보였다. 4.BAX 는외상성뇌손상유발 7일후에는 Ⅰ 에비해 Ⅱ Ⅲ 은다소감소된면역반응을보였으며, 유발 14 일후에는 Ⅰ Ⅱ 는다소감소된면역반응을 Ⅲ에서현저히감소된면역반응을확인할수있었다. 냉성어혈약침의血海 (Sp10) 刺入이 TBI(traumatic braininjury) 흰쥐의신경학적운동능력회복과 BAX 와 BCL-2 의발현에미치는영향을살펴본결과다음과같은결론을얻었다. 5.BCL-2 는외상성뇌손상유발후큰변화가없다가유발 7일후에 Ⅱ와 Ⅲ에서다소증가하였고, 유발 14 일후에는 Ⅲ에서더욱증가하였다. 1. 신경학적회복검사를위해시행한 rotarod test 에서는외상성뇌손상유발 7 일후와 14 이상의결과로볼때, 냉성어혈약침이치료시 간의경과에따라 Cerebralcortex 에서 BAX 발현 10
냉성어혈약침이외상성뇌손상흰쥐의신경학적회복과 BAX,BCL-2 의발현에미치는영향 을감소시키고 BCL-2 발현을증가시켜신경세포의자연사를억제하기위한기전이작용된것으로생각되며향후이에대한지속적인연구가필요할것으로사료된다. 참고문헌 1.ZhangL,YangKH,KingAI.Biomechanicsof neurotrauma.neurolres.2001;23(2-3):144-56. 2. 김진호, 한태륜. 재활의학. 서울 : 군자출판사.2006: 366-7. 3. 안영기. 경혈학총서. 서울 : 성보사.1995:236-7. 4. 임종국. 침구치료학. 서울 : 집문당.1983:320. 5. 大韓藥鍼學會. 약침요법총론. 서울 : 대한약침학회.1999:314. 6. 지용철. 흰쥐의실험적외상성뇌손상에서 Ginseng TotalSaponins 의신경보호작용. 중앙대학교대학원박사학위논문.2005. 7. 김정길. 홍삼투여가흰쥐외상성뇌손상의 Bax 및 Bcl-2 발현에미치는영향. 경희대학교대학원석사학위논문.2007. 8. 나건호, 윤대환, 나창수, 채우석. 풍지 ( 風池 )(GB20) 의천마약침 ( 天麻藥鍼 ) 이 IntraluminalFilament 삽입술에의하여유발된백서 ( 白鼠 ) 의뇌허혈에미치는영향. 대한침구학회지.2008;25(1):1-14. 9. 한상균, 이병렬. 당귀약침의혈해자입이 Intraluminal Filament 삽입술에의해유발된백서의허혈성뇌손상에미치는영향. 대한침구학회지.2004; 21(2):1-20. 10.Marmarou A,FodaMA,van den BrinkW, CampbelJ,KitaH,DemetriadouK.A new modelofdifusebrain injury in rats.part Ⅰ: Pathophysiology and biomechanics. J Neurosurg.1994;80(2):291-300. 11.Hamm RJ,PikeBR,O`delDM,LyethBG, JenkinsLW.Therotarodtest:Anevqluation ofitsefectivenesinasesingmotordeficits folowingtraumaticbraininjury.jneurotrauma. 1994;11(2):187-96. 12.FeneyDM,GonzalezA,LawWA.Amphetamine, haloperidolandexperienceinteracttoafect rateofrecovery aftermotorcortex injury. Science.1982;218:855-7. 13.Goldstein LB,DavisJN.Beam-walking in rats:studiestowardsdevelopingananimal modeloffunctionalrecovery after brain injury.jneuroscimethods.1990;31:101-7. 14. 최석민, 석종식, 민병국, 황성남, 김영백, 김재현. 개량형피질충격모델의개발. 대한신경외과학회지.2002;32(5):458-62. 15.RoyoNC,Schouten JW,Fulp CT,Shimizu S,Marklund N,Graham DI,McIntosh TK. From celdeath to neuronalregeneration: buildinganew brainaftertraumaticbrain injury.jneuropatholexp Neurol.2003;62: 801-11. 16. 한국생화학분자생물학회.PosterSesion:Simvastatin inducesapoptosisthrough Bax translocation tomitochondriainmetha fibrosarcomacels. 춘계학술대회집.2006. 17. 박지현, 김세련, 송은섭, 임문환, 이병익, 이우영. 태아성장발육장애또는전자간증태반에서의세포고사 :Bcl-2,Bax 및 p53 단백발현에관한연구. 대한산부인과학회지.2005;48(4) :891-900. 18.HausmannR,BiermannT,WiestI,TubelJ, BetzP,Neuronalapoptosisfolowinghuman brain injury.intjlegalmed.2004;118(1): 32-6. 11
19.ColicosMA,DashPK.Apoptoticmorphology of dentate gyrus granule cels folowing experimentalcorticalimpactinjury in rats: possibleroleinspatialmemorydeficits.brain Res.1996;739:120-31. 20.KayaSS.MahmoodA,LiY,YavuzE,Goksel M,ChoppM.Apoptosisand expressionof p53responseproteinsand cyclin D1after corticalimpactinratbrain.brainres.1999; 818:23-33. 21. 김영화, 김영일, 이현. 음릉천혈해의자침부작용치료에대한증례보고. 대전대학교한의학연구원.2006:47-52. 22. 김상희, 손인길, 엄태식. 혈해 격수혈의혈성및구횟수와주치증에대한문헌적고찰. 대한침구학회지.1994;11(1):241-52. 23. 大韓藥鍼學會編. 약침요법시술지침서. 서울 : 대한약침학회.2000:161-2,284,323. 24. 大韓藥鍼學會編譯. 약침제제와임상응용 (1). 서울 : 대한약침학회.1997:1-5. 25. 임상본초학. 서울 : 영림사.2000:242,372,401-5, 533. 26. 허준. 동의보감. 서울 : 대성문화사.1992:55,466. 27.NicholsonDW.Mechanismsofapoptoticcontrol. Nature.2000;407:810-6. 28.Kannan,K,Jain,S.K.Oxidativestressand apoptosis.pathophysiology.2000;7(27):153-63. 29.Srinivasula,S.M,Ahmad,M,Fernandes- Alnemri,T.& Alnemri,E.S.Autoactivation ofprocaspase-9byapf-1-mediatedologomerization. MolecularCel.1998;1:949-57. 30.Fadeel,B.,Zhivotosky,B.& O renius,s.al alongthewatchtower:ontheregulationof apoptosisregulators.thefasebjournal.1999; 13:1647-57. 31.KrajewskiS,KrajewskaM,ShabaikA,Miyashita T,WangHG,ReedJC.Immunohistochemical determinationofinvivodistributionofbax, adominantinhibitiorfobcl-2.am JPathol. 1994;145(6):1323-36. 32.ClarkRSB,KochanekPM,AdelsonPD,Bel MJ,Carcilo JA,Chen M,WisniewskiSR, JaneskoK,WhalenMJ,Graham SH.Increases in bcl-2protein in cerebrospinalfluid and evidenceforprogrammedceldeathininfants and children after severe traumatic brain injury.jpediatr.2000;137(2):197-204. 33.ONG YL,McMulinMF,BailieKEM,Lappin TRJ,JonesFG,IrvineAE.Hingbaxexpresion isagoodprognosticindicatorinacutemyeloid leukemia.brjhaematol.2000;111:182-9. 12