위암세포주에서 oligonucleotide microarra array 를이용하여항암제의효능예측을위한유전자발현양상의분석 연세대학교대학원의학과김용태
위암세포주에서 oligonucleotide microarra array 를이용하여항암제의효능예측을위한유전자발현양상의분석 지도교수 정현철 이논문을박사학위논문으로제출함 2005 년 12 월일 연세대학교대학원의학과김용태
김용태의박사학위논문을인준함 심사위원심사위원심사위원심사위원심사위원 인인인인인 연세대학교대학원 2005 년 12 월일
감사의글 본논문이완성되도록많은관심과격려를아끼지않으셨던지도교수님이신정현철교수님께깊은감사의인사를드립니다. 논문의기획에서부터논문의마무리까지본연구의가장큰도움을주셨고이논문이완성될수있도록저에게커다란힘이되어주셨습니다. 그리고본논문에대하여처음부터끝까지세심한정성으로검토하여주시고많은가르침을주신노재경, 라선영교수님과각별한관심과지도를하여주신권오헌, 노성훈교수님께깊은감사를드립니다. 본연구의실험과데이터정리에큰역할을하였던정재준선생님에게특별한감사의마음을전합니다. 또한데이터검토및저에게많은학문적도움을주셨던정희철, 안중배선생님께도깊은사의를표하며, 본논문에깊은관심을가져주시고많은조언을주셨던김주항, 유내춘, 손주혁교수님께도감사하다는말을전하고싶습니다. 논문이완성될수있도록많은격려와성원을하여주신일산병원박인서교수님, 양주영부장님, 전동운과장님, 이천균, 서정훈, 조용석, 원선영, 송영득, 이선민, 이찬희, 허애정, 박병규, 김정주, 강중구, 이상훈, 정은지, 최윤정, 민은희, 김인하, 원경선선생님에게도감사드립니다. 그동안사랑으로저를보살펴주시고격려해주셨던장모님, 누구보다도많은애정을보여주셨던할머님, 멀리미국과캐나다에있으면서도마음은항상같이있었던충호, 민호와이모님, 늘나에게귀감이되었고언제나커다란힘이되어주었던동생은태와귀여운조카하연이의사랑을늘감사하게생각하겠습니다. 끝으로오늘날의저를있게해주시고한평생우리형제들을위해희생으로살아오신제가가장존경하는아버님, 어머님과아빠엄마가늘함께있지못하지만무럭무럭잘커가는천사김근영과항상나의가장든든한동반자로언제나변함없이늘곁에있어준아내김미진선생님께깊은애정과감사의마음을전합니다. 저자씀
차례 국문요약.........ⅴ I. 서론...1 II. 연구방법......4 1. 세포주배양...4 2. RNA 분리...4 3. Oligonucleotide microarray...5 4. 항암제감수성검사...7 5. GC-matrix 분석...8 6. 유전자분석...9 III. 결과...............12 1. G-matrix: 위암세포주에서유전자발현양상...12 2. C-matrix: 위암세포주에서항암제감수성결과...12 3. GC-matrix: 위암세포주에서유전자발현양상과항암제감수성과의상관성...14 4. 위암세포주에서항암제감수성을의미하는공통유전자...16 5. 각항암제의 C-max 값을기준으로항암제의감수성을예측할수있는유전자조사...20 6. Paclitaxel과 docetaxel 에서의항암제감수성을예측할수있는유전자비교...27 IV. 고찰......3...32 V. 결론.........3...38 i
참고문헌............39 영문요약............45 ii
그림차례 그림 1. 연구의개략도...11 그림 2. 위암세포주에서유전자발현양상과항암제감수성결과...13 A) G-matrix: 13개의위암세포주를대상으로 17015개의유전자의발현양상...13 B) C-matrix: 13개의위암세포주를대상으로 16개의항암제의감수성결과...13 C) GC-matrix: 17015개의유전자발현양상과 16개의항암제감수성사이의상관관계...15 그림 3. 위암세포주에서공통적으로약제감수성을나타내는유전자군조사...18 A) 16개의항암제를대상으로 11개이상의항암제에서피어슨상관계수가 0.4 이상인 85개의유전자...18 B ) 8 5 개의유전자의발현양상에대한위암세포주의 hierarchical clustering...18 그림 4. 위암세포주에서약제별항암제감수성을나타내는유전자군의 hierarchical clustering...21 A) Cisplatin...21 B) Carboplatin...21 C) Irinotecan...22 D) Topotecan...22 E) Paclitaxel...23 F) Docetaxel...23 G) 5-FU...24 iii
H) Doxorubicin...24 I) Etoposide...25 J) Gemcitabine...25 K) Mitomycin...26 L) Vinblastine...26 M) Vincristine...27 표차례 표 1. 위암세포주에서공통적으로항암제감수성과연관이있는 85 개의 유전자...17 표 2. 유전자분석을통한항암제감수성에따른위암세포주 분류...19 표 3. 위암세포주에서 paclitaxel 과 docetaxel 에감수성과상관관계를 가지는발현유전자군...28 표 4. 항암제별감수성을나타내는유전자군...29 iv
국문요약 위암세포주에서 oligonucleotide microarray 를 이용하여항암제의효능예측을위한유전자 발현양상의분석 위암은우리나라에서발생하는가장흔한종양의하나로항암약물치료가치료의중요한역할을하고있다. 최근들어위암에대하여새로운항암제들이개발되고기존의항암제들과병합하여사용한결과치료반응률을많이향상시킬수있었다. 그러나. 아직임상에서항암약물치료전, 치료의반응을알수있는예측인자 (predictive marker) 로증명된것은없다. 본연구는치료전반응을예측하고자항암약물치료를하지않았던위암세포주를대상으로공통적으로또는항암제별로감수성과상관관계가있는유전자군을조사하고자최근많은발전을이룩한 oligonucleotide microarray 검사방법을이용하여위암세포주의항암제감수성을예측할수있는유전자의발현양상을조사하였다. v
1. 위암세포주에서항암제감수성과유전자의발현양상과의상관관계를 표현하는 database (Gene, chemosensitivity data base, GC matrix) 를 구축하였다. 2. GC-matrix를이용하여위암치료에사용되는항암제에대하여공통적으로감수성이있는유전자를선별하였다. 16개의항암제중 70% 인 11개이상에서피어슨상관분석의상관계수 (correlation coefficient) 가 0.4 이상인유전자를선별한결과 85개의유전자가선별되었고이중 positive correlation 유전자가 37개, negative correlation 유전자가 48개였다. 3. 위암에서다약제내성 (multi-drug resistant) 과관계있는유전자로알려진 MAD2L1 유전자의경우본연구에서항암제 etoposide, leucovorin, vinblastine, carboplatin, methotrexate, paclitaxel, vincristine, cyclophosphamide에공통적으로 negative correlation이관찰되었다 ( 각각상관계수 r=-0.75, -0.64, -0.52, -0.51, -0.42, - 0.39, -0.37, -0.36). 4. 약제저항성과연관성이있다고알려진 FAS 유전자의경우 irinotecan, topotecan, mitomycin, cyclophosphamide 그리고 gemcitabine에서공통적으로강한 negative correlation이조사되었다 ( 각각상관계수 r=-0.88, -0.80, -0.45, -0.41). vi
5. 항암제별로감수성과저항성을미리예측할수있는중요유전자선별결과 5-FU 항암치료시 KIAA0233 유전자 (r=0.42), cisplatin 항암치료시 HMGCL, HSD17B2 유전자 (r=-0.51, 0.49) 등이높은상관관계를나타냈으며이러한유전자들은과거발표되었던 data의결과와일치하였다. 6. Irinotecan에감수성이있는세포주에서 FAS (r=-0.88), AIF-1 (r=- 0.73) 와같이 apoptosis 또는 cell cycle arrest와관련성이있는유전자가과발현되었으며저항성이있는세포주에서는 FKBP1A (r=- 0.66), TNFRSF1B (r=-0.64), EDAR (r=-0.61), BBC3 (r=-0.67), PHGDH (r=0.69), PYGL (r=0.61), CTSL (r=0.64), PHKA1 (r=0.74) 와같이단백질이화작용 (catabolism) 과관련이있는유전자가과발현되었다. 7. Paclitaxel의경우 PBX3, ADAMTS19, ABCG4, NDUFV3, ZNF564 과같은유전자가과발현되었을경우감수성예상되어높은반응률을, INO80, INPP4B, TNFAIP9, BRE, MTHFD1L 유전자가과발현할경우항암약물치료시저항성을예상할수있는 predictive marker로서의가능성을확인하였다. vii
8. Docetaxel의경우 MAP4K2, MED8, GBF1, ZNF258, IQCG 유전자가과발현할경우감수성을, MGST2, C14orf108, SLC6A13, IGSF8, DHRS1 유전자가과발현할경우저항성의 predictive marker로서의가능성을확인하였다. 이상의결과로위암세포주를대상으로항암제반응성과유전자발현양상과의상관관계를 database화할수있었고항암약물치료전에항암치료의결과를미리예측할수있는유전자군을각항암제별로조사할수있었다. 이러한유전자군의효능이검증되고이를통해전향적비교연구 (prospective randomized study) 로효용가치가확인되면, 감수성예측유전자로항암제를선택하는개인별맞춤항암약물치료의임상적적용이가능해지며, 아울러항암제의반응예측및작용기전이해에도보다기여할것이다. 핵심되는말 : 위암, oligonucleotide microarray, 유전자, 항암제감수성. viii
위암세포주에서 oligonucleotide microarray 를 이용하여항암제의효능예측을위한유전자 발현양상의분석 < 지도교수정현철 > 연세대학교대학원의학과 김용태 I. 서론 항암약물치료 (chemotherapy) 는수술과더불어종양치료에가장중요한역할을하는치료방법이다. 그동안새로운항암제들이많이개발되어과거보다치료반응률이향상되었고부작용은감소되는경향이다. 항암약물치료시같은장기의종양, 같은병기의환자에서동일한항암제를사용하였어도치료효과는개인별로차이가있다. 즉, 완전반응으로병이완치되는경우가있는가하면부분반응이있거나, 또는전혀반응이없어독성만을환자가부담해야하는경우도있다. 1
항암치료에대한반응을미리예측하려는연구가과거부터많이있었지만 개인에따른항암제의반응과독성을미리알수있는예측인자 (predictive marker) 를발견하는것은어려운일이었다. 비록많은연구에서몇몇의 예측인자가조사되었지만 1-6 아직임상에서표준적으로사용될만큼 예측성이증명된인자는없다. 최근유전자지도의완성과더불어유전자의대한연구가활발히진행됨에따라항암제감수성 (chemosensitivity) 에영향을주는유전자에대한보고가많이나오고있다 1-3. 그러나특정단일유전자가전체항암제감수성을설명할수는없으며 5, 많은수의유전자가함께감수성에영향을주리라고사료된다. 그러므로어떤특정암을치료하기에앞서특정항암제에대한감수성을예견할수있는유전자군을미리알수있다면항암약물치료전에치료반응을예측할수있을것이며, 최적의항암제를선택하는데있어서많은도움을얻을수있다. 위암은전세계적으로가장빈도가높은암종의하나이며, 미국과유럽에서는발병률이낮은반면우리나라를포함한극동에서발생률이유의하게높은종양이다. 위암치료를위해서많은항암제들이개발되어 생존기간의연장과삶의질향상에도움을주고있으나 7-10 현재표준화된 치료약제는없으며개개인의치료에대한감수성과저항성을예측할만한표준화된인자도없다. Oligonucleotide microarray 검사방법 11-17 은기존의단일유전자를조사하던방법과는달리대규모의유전자의발현양상을동시에조사할수 2
있는획기적인방법으로이방법을통하여위암세포주에서여러가지항암제의감수성을예측할수있는주요유전자군을조사하였다. 이연구를통하여위암세포주에서항암제의감수성과상관관계가있는유전자군을조사함으로써조사된유전자군이발현되어있는위암에서항암제를사용하기전미리반응을예측할수있는기준으로사용하고자하는것이본연구의목적이다. 본연구에서는항암제의감수성을예측할수있는유전자군을알아내기위하여위암세포주와유전자와의관계를나타내는 in vitro G-matrix (Gene expression database) 를제작하였고, 위암세포주와항암제의감수성을나타내는 C-matrix (Chemo-sensitive database) 를제작하였다. G-matrix와 C-matrix의공통인자인위암세포주를매개로피어슨상관분석 (Pearson correlation) 을이용하여 GC-matrix (Gene-chemosensitivity data base) 를제작하였다. 이렇게만들어진 GC-matrix를통하여항암치료시에위암세포주에서공통적으로감수성과연관성이있는유전자군을조사하는것을본연구의첫번째목적으로하였고. 현재위암치료에널리사용되고있는대표적항암제에각각특이적으로감수성과관련이있는유전자군을조사하는것을두번째목적으로정하였다. 3
II 연구방법 1. 세포주배양 총 13개의위암세포주를대상으로시험하였다. AGS, NCI-N87 2개의세포주는 American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) 으로부터, MKN-45 와 SNU-series 세포주 (SNU-1, SNU-484) 는각각 Japanese Cancer Research Resources Bank와 Korean Cell Line Bank 에서구하였다. 나머지 8개의위암세포주 (YCC-1, YCC-2, YCC-3, YCC-6, YCC-7, YCC-10, YCC-11, YCC-16) 는연세의대암전이연구센터 (Cancer Metastasis Research Center, CMRC) 에서수립된것을사용하였다. 13개의위암세포주는 100U/ ml penicillin 과 0.1mg / ml streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY, USA) 과 10% FBS (Omega Scientific, Australia) 이첨가된 Minimum Essential Medium (MEM, GIBCO, Grand Island, NY, USA) 에서배양되었다. 이세포주들은 37 5% CO 2 의배양기에서 3일간격으로배지를교환하며배양되었다. 2. RNA 분리 총 13 개의위암세포주에서 TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 를이용하여 RNA 를분리하였다. RNA 의양과질은 GelDoc, Nanodrop 4
(NanoDrop Technologies, USA) 으로확인하였다. RNA 발현양상의기준이되는 reference RNA는 11개의사람세포주 (YCC-B1 (breast cancer), HCT-116 (colon cancer), SK-HEP-1 (liver cancer), A549 (lung cancer), HL-60 (acute promyelocyte leukemia), MOLT-4 (acute lymphoblastic leukemia), HeLa (cervix cancer), Caki-2 (kidney cancer), T98G (glioblastoma), HT1080 (fibrosarcoma), YCC-3 (gastric cancer) 로부터동량의 mrna를추출하여합성한 Yonsei reference RNA (CMRC, Seoul, Korea) 18 를사용하였다. 3. Oligonucleotide microarray 70개의염기로구성된 22,740 oligonucleotide가집적된 oligo chip (CMRC-GT, Seoul, Korea) 을이용하여 microarray를시행하였다. Microarray 실험은 CMRC의표준 protocol을따라시행하였으며, reference RNA (CMRC, Seoul, Korea) 를 Cy-3로, 각각의위암세포주에서추출한 RNA를 Cy-5로표지하는간접 (indirect) 실험 design으로하였다. 각위암세포주에서추출한 100μg의 RNA를 oligo-dt primer (Genotech, Daejun, Korea) 에섞어서 65 o C에서 10분간배양하고 SuperScript II (Invitrogen, USA), 5X first strand buffer, 100mM DTT, dt/dntp 와 RNA/oligo-dT에대한 Cy3- or Cy5-dUTP를혼합하여 5
42 에서 2시간동안역전사 (reverse trans-cription) 를유도하였다. 역전사후남은잔여불순물 RNA는 0.1M NaOH 용액에서 65 o C로 10분간배양함으로써제거하였고, 동량의 0.1M HCl 용액을첨가시켜중화시켰다. Cy3-와 Cy5-dUTP로염색된 probe들은 QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 을이용하여정화시켰고이렇게정화된 probe들은 Human Cot-1 DNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), yeast trna (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), poly(a) RNA (Sigma, Saint Louis, MO, USA) 와혼합하였다. Microcon YM-30 column (Millipore, Bedford, MA, USA) 를이용하여최종적으로 probe를농축시켰고 100 에서 2분간변성시켰다. 그사이에 42 에서 probe를적용하기 1시간이전에 5X sodium chloride/sodium citrate buffer (SSC) 와 0.1% sodium dodesyl sulfate (SDS), 그리고 10mg / ml bovine serum albumin (BSA) 를이용하여빈공간에서반응을일으키지않게 pre-hybridization을시행하였다. 준비된 probe는 drip위에점적후 42 에서 16 시간동안 hybridization시키고, 이러한 hybridization 이끝난후 array는 2X SSC 0.1% SDS, 1X SSC 0.1% SDS, 0.2X SSC, 0.05X SSC용액으로순차적으로 2분씩세척하고 500xg에서건조하였다. Microarray에서나타나는형광신호 (fluorescence signals) 는 GenePix 4000B scanner (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) 를이용하여얻었으며스캔을통한영상이미지는 GenePix Pro 4.0 software (Axon, Instruments, Foster City, CA, USA) 를사용하였다. 데이터분석에서 6
Cy5/Cy3 data는 log 계수로치환하였으며분석중발생할수있는 systemic error는 Lowess function 통계방법에의거하여 intensity dependent, within-print tip normalization 방법으로표준화하였다. 표준화후전체 data에서 1개이상의측정치가손실된경우 (missing value) 의유전자는분석에서제거하였다 (NMP: No Missing Proportion =100%) 28 4. 항암제감수성검사 13개의위암세포주를대상으로 16개의항암제 (5-fluorouracil, irinotecan, topotecan, doxorubicin, etoposide, mitomycin, docetaxel, paclitaxel, cisplatin, carboplatin, gemcitabine, vinblastine, vincristine, leucovorin, cyclophophamide, methotrexate) 를사용하였을때위암세포주의성장억제 (growth inhibition) 를 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma, Saint Louis, MO, USA) assay를통하여측정하였다. 각각의세포주를 96-well microplate (Falcon, BD, NJ, USA) 에심고 5% CO 2 상태가유지되는공간에서 37 로 24시간배양하였다. 특정항암제를배양배지에서순차적으로희석시킨후다양한농도로 96-well microplate에서반응시켰다. Microplate에서 72시간배양후 50ul (2mg/ml) 의 MTT를첨가해 4시간더배양시켰다. 400x g 에서 10분간전기영동시킨후 microplate에서 MTT와배지를제거하고여기에 150ul DMSO 7
(dimethyl sulfoxide, Sigma, USA) 를첨가하여 MTT-formazan crystal을용해시켰다. 10분간추가반응시킨후에 multi-well ELISA automatic spectrometer recorder (Behring ELISA Processor II, Germany) 를이용하여 540nm의파장에서흡광도 (absorbance) 를측정하였다. 결과는다음의공식에근거하여세포의생존비율로표시하였다. 세포생존률 (%) = ( 검체의평균흡광도 - 표준흡광도 / 대조군의 평균흡광도 - 표준흡광도 ) 100. 대조군의경우는항암제대신에생리식염수를사용하였다. 세포생존률과각각의항암제의다양한농도사이의관계를생장억제농도 (growth inhibitory concentration (IC)) 를기준으로표시하였고, 50% 의세포가생존하는농도 (IC 50 ) 는 Calcusyn software (Biosoft, Cambridge, UK) 를이용하여계산하였다. 각항암제의 IC 50 의편차가넓어단위보정을위해 IC 50 값은 log 단위로치환하였다. 5. GC-matrix 분석 세포주와유전자와의관계를나타내는 G-matrix (gene expression database) 와세포주와항암제감수성을나타내는 C-matrix (chemosensitivity database) 와의상관성은 Pearson correlation 을 8
이용하였다. 상관계수 r을구하는방법은다음과같다. 세포 i의유전자 x의발현도 log값 (log 2 Cy5/Cy3) 을 x i 라고하고, 세포i 에대한항암제 y의항암제감수성의 log 값 (log 10 IC 50 ) 을 yi 라고한다면, x m 은유전자 x의발현도의 log 값의평균이며, y m 은항암제감수성의 log 값의평균을나타내어상관계수 r은다음과같이표시될수있다. 이러한분석방법을이용하여 no missing proportion 100% 를기준으로 13 개의위암세포주에서 16 개의항암제와상관성이있는유전자군을 선별하였다. 6. 유전자분석 본연구의개요를그림 1에표시하였다. Hierarchical clustering을 cluster software를이용하여시행하였고, TreeView software (http://rana.lbl.gov/eisesoftware.htm) 를사용하여 dendrogram을작성하였다. G-matrix, C-matrix를이용하여 GC matrix의 hierarchical clustering을시행하고. GC-matrix는항암제의감수성을표현하는유전자를찾는데사용하였다. GC-matrix를통하여 16개의항암제중 11개이상에서 9
상관계수가 0.4 이상이거나 -0.4 이하인상대적으로높은상관관계가있는유전자를선별하였다. 또위암세포주를각각의항암제의 1상실험에서조사되었던최대농도 (maximum concentration, C-max) 를기준으로항암제의감수성이있는세포주와저항성이있는세포주로분류하였다. 각각의항암제에감수성이있는세포주와저항성이있는세포주를구별짓는유전자를찾기위하여 Significance Analysis of Microarray (SAM) 분석방법을사용하였다. 이렇게조사된유전자는 Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID) (http://apps1.niaid. nih.gov/david) 와 Stanford Online Universal Resource for Clones and Expressed sequence tags (SOURCE) (http://source. stanford. edu/cgibin/source/sourcesearch) 를이용하여유전자정보수집을하였다. 10
그림 1. 연구의개요를정리한개략도 *: SAM (Significance Analysis of Microarray) 11
III. 결과 1. G-matrix: 위암세포주에서유전자발현양상 13개의위암세포주를대상으로 oligonucleotide microarray를시행하여유전자를 clustering 하였다. No missing proportion (NMP) 이 100% 인유전자만을선택한결과 17015개의유전자가선택되었으며이유전자를대상으로 Log 2 (Red/Green) 의비율을기준으로하여 hierarchical clustering을시행하였다 ( 그림2 A). Clustering 결과위암의원발부위에서얻은세포주 (AGS, SNU-1, SNU-484) 나전이병소에서얻은세포주 (NCI- N87, MKN-45, YCC-1, YCC-2, YCC-3, YCC-6, YCC-7, YCC-10, YCC- 11, YCC-16) 그리고인종별로차이가발견되지는않았다. 2. C-matrix: 위암세포주에서항암제감수성결과 13개의위암세포주를대상으로현재임상에서사용되고있는 16개의항암제의성장억제정도 (growth inhibitor) 를측정하였다. 각각의항암제의 IC 50 를구하여 C-max와비교하여항암제의감수성유무를평가하였다. Hierarchical clustering 결과 16개의항암제는작용기전에따른분류와유사한 cluster로구분되는것을관찰하였다. ( 그림 2B). 12
A 그림 2. 위암세포주에서유전자발현양상과항암제감수성결과 A) G-matrix: 13 개의위암세포주를대상으로 17015 개의유전자의발현양상에따른분류 B S N U - 4 8 4 S N U - 1 M K N - 4 5 A G S Y C C - 6 Y C C - 7 Y C C - 1 6 Y C C - 1 0 N C I - N 8 7 Y C C - 3 Y C C - 1 1 Y C C - 2 Y C C - 1 B) C-matrix : 13개의위암세포주를대상으로 16개의항암제를대상으로감수성에따른분류 13
세포의유사분열시 tubulin에작용하여방추억제 (mitotic spindle inhibitor) 의역할을하는 vinca alkaloid (vincristine, vinblastine) 와 taxane (paclitaxel, docetaxel) 이인접하여위치하였다. Topoisomerase I 을억제하는 topotecan과 irinotecan이같이 clustering 되었고바로인접하여주작용기전이 topoisomerase II를억제하는 doxorubicin이위치하여작용기전이유사한약제들이 cluster 상에서도인접하였다. 또한 DNA alkylator인 cisplatin과 carboplatin이같이분류되는등현재작용기전별항암제분류와결과가유사하였다. 한편, C-matrix에서 13개의위암세포주의 clustering 결과는 G-matrix의위암세포주 clustering과다소차이가관찰되었고이는 C-matrix의경우항암제의감수성을기준으로세포주를분류한것인반면 G-matrix의경우유전자의발현정도를가지고분류한결과에서기인한것으로생각된다. 3. GC-matrix: 위암세포주에서유전자발현양상과항암제감수성과의 상관성 항암제감수성을예측할수있는유전자를찾기위하여피어슨상관분석의상관계수를이용, 두개의데이터 G-matrix, C-matrix를통합하여항암제에대한감수성과유전자의발현양상의상관성을조사하였다. 공통된세포주를기준으로유전자하나에대한발현도와항암제하나하나에대한 IC 50 값을각각 x, y축에놓고상관관계를구한후, 이러한 14
과정을반복하여전체유전자와항암제에대한상관관계를얻어표현하였다. 상관관계를이용하여유전자와항암제와관련된 hierarchical clustering 결과, 이 cluster 에서도항암제는작용기전별로모이는형태를취했고 유전자는각각항암제와의상관성을기초로분리되었다 ( 그림 2C). C C ) GC-matrix : 17015개의유전자발현양상과 16개의항암제사이의피어슨상관분석을이용한항암제의분류 이와같은 GC-matrix 는유전자의발현양상에따른항암제의감수성을 보여주는것으로 C-matrix 와마찬가지로전반적으로 topoisomerase inhibitor, tubulin inhibitor, antimetabolites 등항암제고유의작용기전에 15
가깝게분류되었으나이전의 IC 50 를기준으로 clustering 하였던 C- matrix와는차이가있었다. 즉, topoisomerase I inhibitor인 topotecan, irinotecan이 DNA alkylating 약제로편입되었고대사길항제 (anti metabolites) 인 5-FU가 tubulin inhibitor 주위에서 anti tumor antibiotics 옆으로배치되었다. 4. 위암세포주에서항암제감수성을의미하는공통유전자 GC-matrix를이용하여다수의항암제에감수성을예측할수있는유전자군을조사하였다. 전체 16개의약제중 11개이상에서 Pearson correlation 상관계수가 0.4 이상인유전자를조사한결과 85개의항암제감수성을의미하는공통유전자가선택되었다 ( 표 1). 16
표 1. 위암세포주에서공통적으로항암제감수성과연관성이있는 85 개의 유전자 Positively correlated genes Negatively correlated genes GenBank No. Symbol GenBank No. Symbol NM_015367 BCL2L13 NM_001643 APOA2 NM_024952 C14orf159 NM_020375 C12orf5 NM_017759 FLJ20309 NM_030568 C6orf148 NM_144600 FLJ31153 NM_022102 C6orf79 NM_022158 FN3K NM_019084 CCNJ NM_005814 GPA33 NM_001799 CDK7 NM_000841 GRM4 NM_021195 CLDN6 NM_033445 HIST3H2A NM_018403 DCP1A NM_032303 HSDL2 NM_022365 DNAJC1 NM_024013 IFNA1 NM_001387 DPYSL3 NM_016027 LACTB2 NM_005088 DXYS155E NM_002969 MAPK12 NM_022336 EDAR NM_005918 MDH2 NM_013241 FHOD1 NM_020460 MGC5395 NM_025139 FLJ12584 NM_022474 MPP5 NM_014366 GNL3 NM_002514 NOV NM_004832 GSTO1 NM_005047 PSMD5 NM_001524 HCRT NM_002842 PTPRH NM_016185 HN1 NM_002888 PAPPES1 NM_014804 KIAA0753 NM_014059 RGC32 NM_012311 KIN NM_017585 SLC2A6 NM_058169 LOH12CR1 NM_003098 SNTA1 NM_144565 NIP NM_020777 SORCS2 NM_017830 OCIAD1 NM_054114 TAGAP NM_022375 OCLM NM_013259 TAGLN3 NM_020190 OLFML3 NM_003234 TFRC NM_148961 OTOS NM_020131 UBQLN4 NM_006206 PDGFRA NM_031407 UBEB1 NM_005777 RBM6 NM_032050 ZNF278 NM_013349 SCIRP10 XM_096883 - NM_012244 SLC7A8 XM_040195 - NM_005985 SNAI1 XM_170868 - NM_003201 TFAM XM_098154 - NM_033285 TP53INP1 XM_173309 - NM_032236 USP48 XM_020224 - NM_007268 VSIG4 XM_032852 - NM_144621 ZPTB8 XM_047287 - XM_060462 - XM_113998 - NM_032739 - NM_032715 - NM_005758 - XM_173080 - XM_113861 - XM_092919 - XM_047196 - XM_066500 - XM_171129 - XM_050917 - -: Unknown gene 17
이 85개의유전자는위암세포주에서공통적으로항암제감수성에영향을주는유전자로여겨지며이 85개의유전자와항암제감수성과의연관성을표현한 hierarchical clustering은다음과같다 ( 그림 3A). 특정유전자들이모든항암제에동일한상관성을가지지않기때문에항암제별로명확하게분류되지는않았다. 그림 3A에서초록색은유전자와항암제가 negative correlation 즉감수성을의미하며붉은색은유전자와항암제가 positive correlation, 즉저항성을가지는것을의미한다. 또이 85개의유전자를대상으로 13개의위암세포주에서발현되는패턴을 one-way clustering을시행한결과항암제에저항성을가진세포주, 감수성을가진세포주, 중간형의세포주로구별되었다 ( 그림 3B). A B resistant sensitive intermediate 그림 3. 위암세포주에서공통적으로감수성및저항성을나타내는유전자조사 A) 16개의항암제를대상으로 11개이상에서피어슨상관관계가 0.4 이상인 85개의유전자의 hierarchical clustering. B) 85개의유전자의발현양상에대한세포주의 hierarchical clustering 18
그림 3B에서초록색은각각의위암세포주에서 reference RNA와비교해서발현이감소되는 (down-regulated) 유전자를, 붉은색은과발현 (upregulated) 되는유전자를의미한다. 공통적저항성 (common-resistant) 을가진세포주로분류되는위암세포주는조사결과 C-max가모든항암제의평균 IC 50 ±0.6 표준편차보다위쪽에위치한반면공통적감수성 (commonsensitive) 을나타내는세포주들은 IC 50 ±0.6 표준편차보다아래쪽에위치하였다. 그림 3A와그림 3B의유전자순서가같은것을고려한다면 positive correlation을가지는유전자들은공통적감수성세포주보다공통적저항성세포주에서과발현 (over-expressed) 되며 negative correlation을가지는유전자들은공통적저항성세포주보다공통적감수성세포주에서과발현 (over-expressed) 됨을관찰하였다 ( 표 2). 표 2. 유전자분석을통한저항성과감수성위암세포주의분류 Group Resistant cell lines Sensitive cell lines Intermediate cell lines Cell lines Number of exceeding Number of exceeding upper outlier lower outlier YCC-2 6 1 YCC-7 12 1 YCC-3 12 0 YCC-1 8 0 MKN-45 0 8 YCC-10 2 7 AGS 1 13 SNU-1 4 3 YCC-16 4 4 YCC-6 3 4 SNU-484 4 7 NCI-N87 3 2 YCC-11 3 4 19
5. 각항암제의감수성을예측할수있는유전자군조사 각약제별로항암제감수성관련유전자를선정하고자하였다. 피어슨 상관관계 (Pearson correlation) 조사에서상관계수가 0.6 이상인유전자를일차적으로선별, 그유전자를대상으로 MTT상감수성세포주와저항성세포주를구별하는 two-class Significance Analysis of Microarray (SAM) 분석을하였다. 이러한과정을통하여항암제의감수성이있을것으로예측되는유전자를설정하고 hierarchical clustering을시행하였다. 결과적으로현재임상적으로위암치료에널리사용되고있는항암제인 Cisplatin, Carboplatin, Irinotecan, Topotecan, Paclitaxel, Docetaxel, 5-FU, Doxorubicin, Etoposide, Gemcitabine, Mitomycin Vinblastine, Vincristin에대한치료반응과관련이있는유전자와세포주의 cluster들은다음과같다 ( 그림 4. A-M). 이연구에사용되었던각항암제별로유전자선별시에 False Discovery Rate (FDR) 은각각 0, 0, 0.139, 1.36, 0, 0.0046, 0, 0.19, 0.0032, 0, 0, 0, 0. 으로매우낮은수준이었다. 20
A B 86 genes 336 genes log 10 IC IC 50 log 10 IC 50 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 21 log 10 Cmax log 10 Cmax
C 58 genes 2.5 2.0 log 10 IC 50 1.5 1.0 log 10 Cmax 0.5 0.0 D 203 genes 3.0 2.5 2.0 log 10 IC 50 1.5 1.0 0.5 0.0-0.5-1.0-1.5 log 10 Cmax -2.0 22
E 130 genes 1.5 1.0 0.5 log 10 Cmax log 10 IC 50 0.0-0.5-1.0-1.5-2.0-2.5 F 103 genes 1.5 1.0 log 10 IC 50 0.5 0.0-0.5 log 10 Cmax -1.0-1.5 23
G 245 genes 3.0 2.5 log 10 ICIC 50 2.0 1.5 1.0 log 10 Cmax 0.5 0.0 H 90 genes 0.4 0.2 0.0 log 10 Cmax log 10 IC 50-0.2-0.4-0.6-0.8-1.0-1.2 24
I 138 genes 2.5 2.0 log 10 IC 50 1.5 1.0 log 10 Cmax 0.5 0.0 J 271 genes 3.0 2.5 2.0 1.5 log 10 Cmax log 10 IC 50 1.0 0.5 0.0-0.5-1.0-1.5-2.0 25
K 657 genes 1.5 1.0 log 10 IC 50 0.5 0.0 log 10 Cmax -0.5-1.0 L 294 genes 2.0 1.5 1.0 IC 50 log 10 IC 0.5 0.0-0.5-1.0 log 10 Cmax -1.5-2.0-2.5 26
M 211 genes 2.5 2.0 1.5 log 10 ICIC 50 1.0 0.5 0.0-0.5-1.0 log 10 Cmax -1.5-2.0-2.5 그림 4. 위암세포주에서약제별항암제감수성과저항성을나타내는유전자의 hierarchical clustering. A) Cisplatin B) Carboplatin C) Irinotecan D) Topotecan E) Paclitaxel F) Docetaxel G) 5-FU H) Doxorubicin I) Etoposide J) Gemcitabine K) Mitomycin L) Vinblastine M) Vincristine 6. Paclitaxel 과 docetaxel 에서의항암제감수성을예측할수있는 유전자군비교 동일한 taxane계통인 paclitaxel과 docetaxel은유사한작용기전으로항암치료에사용되고있으나그효과와부작용범위가다른것으로임상적으로관찰되고있다. 위암치료에많이사용되는이두항암제의감수성을예측할수있는주요유전자를조사한결과, 유사한작용기전을가진항암제임에도불구하고 paclitaxel과 docetaxel의치료반응에영향을줄공통의유전자는없었다. 두약제별로감수성과상관성이예상되는유전자군을표 3에정리하였다. 27
표 3. 위암세포주에서 paclitaxel 과 docetaxel 에감수성및저항성과 상관관계를가지는유전자 Paclitaxel Docetaxel Symbol r Symbol r - 0.8355-0.8485 INO80 0.8087 MGST2 0.8275 INPP4B 0.8002-0.8274 TNFAIP9 0.7554 C14orf108 0.8102 BRE 0.7501-0.8074 MTHFD1L 0.7501 SLC6A13 0.807 SH3TC2 0.7451 IGSF8 0.8042 MRPL33 0.6923 DHRS1 0.801 PLD1 0.6786-0.7926-0.6707-0.7662 IFNGR1 0.6563-0.7656 TNFSF13B 0.6551 GFOD1 0.76 PDE9A 0.6376 C6orf192 0.7499 DCL-1 0.63 C9orf88 0.7359 NOV 0.6293 ABHD4 0.7338-0.625 C14orf94 0.729 FLJ23033 0.6246 RABGGTA 0.7194 PCDH7 0.6185-0.7149 LGALS3BP 0.6125 MYLIP 0.7101 HERC6 0.6048 STXBP6 0.702 LAF4-0.725 SDC3-0.6777 SERPINB6-0.7289 MAP1LC3B -0.6778 CBX1-0.7362 RAB28-0.6851 - -0.7368 G10-0.7007 LIMS3-0.7384 APOL3-0.7082 GPC4-0.7421 RBAK -0.7172 KIFAP3-0.7543 MRPS6-0.7186 LTK -0.7612 CD68-0.7258 DLEU2-0.7616 - -0.741 - -0.7649 TRAPPC3-0.7559 LRP4-0.7667 SLC5A3-0.7661 SMAD5-0.7677 - -0.7698 PNRC2-0.7709 EPN2-0.7793 CCR3-0.7764 C6orf129-0.8042 PBX3-0.7836 IQCG -0.8055 - -0.7955 ZNF258-0.8146 ADAMTS19-0.7967 GBF1-0.8296 ABCG4-0.8075 MED8-0.8344 NDUFV3-0.8178 MAP4K2-0.863 ZNF564-0.8301 - -0.877 r: 피어슨상관분석의상관계수 28
표 4-1. 항암제별저항성및감수성을나타내는유전자 Cisplatin Irinotecan 5-FU Doxorubicin Symbol r Symbol r Symbol r Symbol r INSL4 0.8415-0.7474 STK6 0.7632 TAF7L 0.8077 AKAP8L 0.8409 PHKA1 0.7398 HIST1H2AM 0.7623-0.8063 ZNF613 0.8243-0.7282 ASPM 0.7333 INHBB 0.7547 PPHLN1 0.8056 PHGDH 0.6883 DDX58 0.7105 TBX3 0.7406 DSC2 0.7924 PFN2 0.6799 PI3 0.7086 CD151 0.7323 NKAP 0.7913 ARHGEF10 0.657 TRIP10 0.6841 DNAJC11 0.7288 NIT1 0.7847-0.6444 DHRS2 0.6661 GBP1 0.7266 HOXB5 0.7817 CTSL 0.6419 GIP3 0.6621 BIRC2 0.7185 FLJ40201 0.7761 PYGL 0.6051 AXL 0.6602 TSPAN2 0.6996 KLF12 0.7705 TNFRSR1B -0.6433 SLC39A1 0.6549 GPR175 0.6902 ALPL 0.7626 ARFGAP1-0.644 ATP1A1 0.6469 BIRC3 0.6801 HMX1 0.7624 DTNBP1-0.6559 BALAP2 0.6261-0.6729-0.7566 ZNF232-0.6612 TRIM29 0.6209 IRF1 0.6671 SARS 0.7557 KFBP1A -0.6647 THBS1 0.6208 PCDHB3 0.6635 MEPTK 0.7555 BBC3-0.6684 OLR1 0.6206 HSPA1B 0.6631 NEU1 0.7535 HSPC023-0.6693 - -0.7451 SH3GL3 0.6627-0.7521 - -0.673 LZTFL1-0.7485 CCND3 0.6596 MARS 0.7509 - -0.6922 DEFB119-0.7495 ZC3HDC1 0.6579 CDC26 0.7489 LOC197336-0.6936 SCYE1-0.7504 UBE1L 0.6564-0.7469 FLI1-0.7005 TSG101-0.7518 CBX6 0.6458 ACCN3-0.7637 - -0.7011 - -0.7545 TFAP2B -0.6975 MYBL1-0.7665 ATP13A1-0.7173 FLJ22318-0.7575 - -0.6988 - -0.7717 - -0.7194 PRSS15-0.7588 CASC1-0.7064 KCNMA1-0.7758 AIF1-0.7281 - -0.7608 - -0.7113 - -0.7786 NMUR2-0.7296 SENP6-0.7636 - -0.7122 BMP1-0.7858 CIGALT1-0.7319 ZNF277-0.7674 ZNF589-0.7168 ASAH2-0.7862 RFX1-0.7338 PRPSAP1-0.7693 - -0.7185 CXCR4-0.7864 HOXC5-0.7481 MGC10820-0.7771 - -0.719 OSR2-0.7883 - -0.749 FALZ -0.7798 ZNF46-0.7234 PARP3-0.7947 - -0.7587 HESX1-0.7915 - -0.7387 RBM30-0.7972 - -0.7718 PTER -0.7928 BAZ2B -0.7396 KCNAB2-0.8016 UGT2B4-0.7761 AKR1A1-0.7982 IGJ -0.7641 - -0.8077 NFE2-0.7819 ALOX15B -0.8079 HSRTSBETA -0.7649 Rg -0.8112 IGHMBP2-0.7915 - -0.8205 METTL4-0.789 PTTGHP -0.8132 ROR1-0.8005 SLC22A17-0.8238 - -0.8144 - -0.8211 PTS -0.82 POLL -0.8259 - -0.8277 - -0.8328 LDB1-0.8301 RICS -0.8391 FKSG2-0.8414 - -0.8431 HT036-0.8304 BAAT -0.8581 PCDHGC3-0.856 NRP2-0.8713 FAS -0.8762 IRF2-0.8639 - -0.8645 PLCB2-0.8824 C10orf11-0.8832 KIAA1737-0.8699 PRND -0.9166 r: 피어슨상관분석의상관계수 29
표 4-2. 항암제별저항성및감수성을나타내는유전자 Carboplatin Etoposide Gemcitabine Mitomycin Symbol r Symbol r Symbol r Symbol r IFNGR1 0.8725 PTPRH 0.8826 ATAD2 0.8264 YAP 0.8623 RPL4 0.8038 CYP4F3 0.28237 BARX2 0.8164 MPP5 0.8505. LIPH 0.7931 INPP4B 0.8102 ST5 0.8033 SOLH 0.8085 LCN2 0.7842 PDE9A 0.7976 SPOP 0.7986 FLJ12973 0.8045 C14orf139 0.7822 PIR 0.7836 PML 0.7713 LENG5 0.8038 PDE9A 0.7755 C118orf11 0.7748 GJA7 0.7649 BTN2A1 0.8022 AREG 0.7658 B3GNT4 0.7694 C21orf58 0.7473 MAPK8IP2 0.8013 ANXA13 0.7615 ASS 0.7507 DTNA 0.7331 MAP2 0.7942 GAL3ST1 0.7578 CYP4F11 0.7461 HMGCL 0.7331 HIST1H4A 0.7921 GADD45G 0.7511 NT5E 0.7388 SYNGR4 0.7305 CDKN2A 0.7863 SDCBP2 0.7506 NTN4 0.7234 NDUFA6 0.7274 KIAA1055 0.7826 SLC20A2 0.7486 NOTCH3 0.7141 GNE 0.7218 FLJ20309 0.7765 MUC13 0.7483 HSD17B12 0.7098 NDRG3 0.7103 TREX1 0.7755 HGD 0.7482 TAGAP 0.7028 DMD 0.7076 ADORA2A 0.7743 IL4R 0.7427 MEF2B 0.7008 LACE1 0.7075 STAU 0.7728 OCLN 0.7173 RGC32 0.6978 TPP1 0.7026 TNRC6B 0.7705 RGC32 0.7168 DAPK1 0.6957 COX6C 0.6944 TRIM16 0.7699 MUC1 0.7023 RNF127 0.6947 KIAA1055 0.6924 MAPK12 0.7694 WBSCR14 0.7004 RBKS 0.6927 TXNRD3 0.6921 PCTK1 0.7699 SGK2 0.6976 AKR1B10 0.6914 GATA2 0.6835 UCK1 0.7588 LRG1 0.6973 ABCC3 0.6905 RBM30 0.6792 MADD 0.7581 PSARL 0.6932 MAX 0.6895 OSR2 0.6784 DUSP9 0.7571 SLC2A12 0.6904 MAOA 0.6879 ACCN3 0.6731 PML 0.7566 LRRFIP2 0.6859 KIAA1166 0.6872 FLJ10546 0.6696 YAP 0.7546 TINAG 0.6784 SIAT4A 0.6851 IL17RE 0.6667 DTNA 0.7506 GBP1 0.6752 AASS 0.6837 EIF2AK1 0.6658 PDGFC 0.7449 BCMO1 0.6744 FLJ14146 0.6828 GLT8D2 0.6644 GTF2I 0.7447 IL10RB 0.6721 C14orf139 0.6815 TNRC6B 0.6641 NKD2 0.7428 CCL23 0.6615 PPP1R14C 0.6807 T1 0.6618 YAP 0.7418 BTBD11 0.6491 MGC16044 0.6771 DUSP9 0.6612 HTLF 0.7416 TXNDC11 0.6486 PIG8 0.6745 ADAMTS6 0.6574 NSDHL 0.7387 C5 0.6395 ORC6L -0.6029 SLC8A1-0.6003 SPSTS1-0.63003 DDC 0.6368 SKI -0.6047 PTPRB -0.6023 GPR77-0.6004 BTNL8 0.6282 CDK2AP1-0.6067 FLJ12484-0.6026 SIGLEC12-0.6004 TSGA2 0.6224 KIF2C -0.6073 RPGR -0.6039 ZNF503-0.6012 PCDHB3 0.6132 SEH1L -0.6089 PIGL -0.6041 PTPN4-0.6017 PRSS8 0.6052 MAP3K4-0.6109 KNS2-0.6048 ITGB1BP2-0.6018 PGAP1-0.6149 COL13A1-0.6189 CPLX2-0.6055 PAX9-0.6025 PSAP -0.6507 KIFF11-0.6246 CD24-0.6078 ICA1-0.6032 PC4-0.6533 PPIL2-0.6258 SFRS8-0.6079 ANK3-0.6033 FLJ14490-0.6615 C9orf81-0.6267 FGG -0.6082 ITGA6-0.6041 RHOA -0.6817 CLDN17-0.6308 ZNF281-0.6094 FLJ21148-0.6053 CNNM2-0.6825 HOXC6-0.6392 RPS6KL1-0.6094 GRB10-0.6057 CHSY1-0.6837 ERAF -0.6429 SPATS1-0.6097 AGTR2-0.6064 TRAPPC4-0.6866 MPP2-0.6464 C6orf59-0.6097 LNK -0.6072 EIF4G3-0.6884 Ch-TOG -0.6496 DCP1A -0.6099 NFE2L2-0.6074 SURB7-0.6981 NRGN -0.6523 CD5L -0.6124 NCAM1-0.6075 CGI-49-0.6988 MATR3-0.6551 UBC -0.6128 FUCA1-0.6077 CLIC4-0.7199 PI4KII -0.6601 RBM16-0.6145 NOS2A -0.6087 C14orf111-0.7227 FLJ38281-0.6612 PANK3-0.6147 ADD3-0.6093 C1QBP -0.7243 LILRB2-0.6712 LTBR -0.6171 ALG9-0.6096 PAPSS1-0.7373 CDC2-0.6726 DNPEP -0.6178 FLJ32926-0.6097 NISCH -0.7418 TUBB2-0.6764 SOX9-0.6201 RCN1-0.6103 LEPRE1-0.7472 RUFY2-0.6845 MERTX -0.6203 ARHGEF2-0.6115 FLJ20259-0.7518 NSD1-0.6858 CTNNAL1-0.6208 TRPC5-0.6121 STK38L -0.7804 H2AFZ -0.6918 DMGDH -0.6214 ADD3-0.6122 r: 피어슨상관분석의상관계수 30
표 4-3. 항암제별저항성및감수성을나타내는유전자 Topotecan Vinblastine Vincristine Symbol r Symbol r Symbol r PARD6A -0.6008 LAMA5 0.8483 SEC23B 0.7574 SEMA4C -0.6018 TNFAIP9 0.8046 QRSL1 0.7423 NFE2-0.6022 PLD1 0.7575 DPYSL2 0.7315 EDARADD -0.6024 C1orf27 0.7418 PTPN14 0.7262 CD40-0.6024 INPP4B 0.7415 INPP4B 0.7172 ZNF232-0.6031 KIAA0992 0.7323 TLR5 0.7098 FLJ20580-0.6054 MTHFD1L 0.7262 MKKS 0.6935 PRKRIR -0.6062 PTPN18 0.7189 GADD45G 0.6919 IRX5-0.6063 MAOA 0.7165 VPREB3 0.6906 IGHMBP2-0.6064 FGL2 0.7154 FLJ23451 0.6863 UBE2G2-0.6068 OSBP2 0.7088 CRADD 0.6841 MHC2TA -0.6069 NOV 0.7082 VPS13D 0.6831 NET1-0.6076 LRRC4 0.7047 CCDC10 0.6826 EBNA1BP2-0.6083 AD031 0.7032 BRE 0.6816 C12orf5-0.6083 TAGAP 0.7005 C1QR1 0.6803 KIAA1787-0.6091 SLC9A2 0.6949 PSMF1 0.6764 FLJ10415-0.6105 KIAA1804 0.6943 SORCS2 0.6619 UGT2B4-0.6109 PDE9A 0.6936 CXCR3 0.6605 DPH2L2-0.6117 APIN 0.6884 KEL 0.6541 UNC13A -0.6134 C14orf161 0.6876 NCOA1 0.6474 EIF4E2-0.6139 BRE 0.6845 PPP1CB 0.6463 MGC4549-0.6152 TA-KRP -0.6044 ProSAPiP2-0.6005 TSNAXIP1-0.6153 CLIPR-59-0.6078 KFBP3-0.6014 RUNX1-0.6158 POLK -0.6079 HT036-0.6027 DHODH -0.6174 LYAR -0.6092 NALP2-0.6041 FLJ10996-0.6175 PINK1-0.6107 FLJ30707-0.6049 EI24-0.6178 MASTL -0.6116 CCDC5-0.6057 CDK7-0.6183 TXNL5-0.6143 BIRC7-0.6061 FCGR2A -0.6193 LOC134492-0.6143 TRIP11-0.6082 SLC7A4-0.6216 BCL2-0.6144 PHTF1-0.6088 KIAA1971-0.6221 ZNF564-0.6155 MRPL51-0.6092 E4F1-0.6221 FLJ20580-0.6156 PNRC2-0.6097 AP3D1-0.6249 MATK -0.6159 EFEMP2-0.6103 MAPK8IP3-0.6264 GAJ -0.6169 LSM8-0.6124 PELP1-0.6271 RPF1-0.6172 PARVG -0.6133 DHRS7-0.6271 ZNF236-0.6182 SALL4-0.6135 MYL3-0.6277 ANGPTL6-0.6185 HN1-0.6141 CDS2-0.6281 TM7SF4-0.6186 POP5-0.6149 PRIC285-0.6284 GNL2-0.6209 UNC13A -0.6157 FLJ11016-0.6292 BNC2-0.6227 FLJ20580-0.6164 r: 피어슨상관분석의상관계수 31
IV 고찰과거 NCI 그룹에서 60개의종양세포주를가지고 118개의항암제를대상으로 1376개의유전자의감수성발현정도를조사한연구 2 가있었으나이연구의경우 60개의종양세포주가운데위암세포주는포함되어있지않았으며 118개의항암제의경우에도현재사용되고있는최신의약제가대부분제외되어임상에적용할수있는효용성에는많은제한점이있었다. 그러나본연구에서는이러한문제점을보완하여현재우리나라에서가장호발하는암중의하나인위암세포주만으로한정하였고좀더조사하는유전자수를늘렸으며, 더욱중요한내용은현재임상적으로가장위암치료에활발하게사용되고있는항암제와유전자의발현양상과의상관성관계에대한 database를구축하고 (GC-matrix) 이 database 를가지고감수성을예측할수있는유전자군을조사함으로써앞으로위암에대한항암치료시결과에대한예측과항암제작용기전연구에도움이되도록하였다. 과거위암세포에서여러항암제에공통적으로감수성을보이는유전자를 발표하였으나 3-5 사용된항암제가 3-4 종류로적은한계를가졌다. 그러나본 연구에서는 microarray라는대량유전자검색방법을이용하고 16개의많은항암제를대상으로분석하여항암제에공통적으로감수성과상관성이있는유전자군조사를시행하였다. 16개의항암제중 leucovorin과 cyclophos - phamide는 reference 항암제로사용하였다. Leucovorin은자체로만은항암효과가없으며 cyclophosphamide는간에서대사되어항암효과를내므로 in vitro 연구에서는활성화되지않기때문이다. 32
본연구에서 C-matrix에서분류된항암제 clustering과유전자와항암제와의상관성으로분류된 GC-matrix에서의항암제 clustering의결과가차이가나는이유는좀더유전자의기능적역할에비중을반영한것으로여겨진다. 예를들면 C-matrix에서는 topoisomerase I 을억제하는 topotecan, irinotecan이 topo isomerase II를억제하는 doxorubicin옆에위치하였으나 GC-matrix에서는 DNA alkylating 약제로편입되었다. 이는 DNA의알킬화를일으키는항암제와유사한작용기전이있을수있음을의미한다. 여러항암제에대하여공통적으로감수성과상관관계가있는유전자를선별하는기준으로 16개의항암제중 70% 인 11개이상에서피어슨상관분석의상관계수가 0.4 이상인 85개의유전자를선택하였다. ( 이중 positive correlation 유전자가 37개, negative correlation 유전자가 48개, 표 1). 이전연구에비하여상대적으로엄격한기준에의해서조사된유전자들을분석한결과과거발표되었던공통적항암제감수성유전자 (common chemosensitivity genes) 는 85개의유전자에서는관찰되지않았다. 본연구의상기기준에포함되지않지만과거에문헌에서보고되었던 MAD2L1 21, TXN 22, FAS 23 유전자의경우상관계수가 0.4 이상에는 미치지못하지만높은상관계수를나타내고있었다. Wu CW 등과 Yin F 등의연구에의하면 MAD2 유전자가세포의 mitotic arrest와관련이있고 MAD2가위암에서다약제내성 (multi-drug resistant) 과관계있는유전자로보고하였는데 19-21 본연구에서도 MAD2L1 유전자의경우항암제 33
etoposide, leucovorin, vinblastine, carboplatin, methotrexate, paclitaxel, vincristine, cyclophosphamide에공통적인 negative correlation이관찰되었다. ( 각각상관계수 r=-0.75, -0.64, -0.52, -0.51, -0.42, -0.39, - 0.37, -0.36). Pranav Sinha 등도위암세포주를대상으로한실험에서 다약제내성 (multi-drug resistant) 과관계있는세포주에서 thioredoxin (TXN) 의과발현을보고하였는데 22 본연구에서도 thioredoxin 유전자가 topotecan, irinotecan 과 cisplatin에서공통적인 positive correlation이관찰되었다 ( 각각상관계수 r=0.65, 0.51, 0.40). Xiao B 등에의하면위암에대한항암치료에서 FAS 유전자가약제저항성과연관성이있다고보고하였는데 23 본연구결과에서도 FAS 유전자의경우 irinotecan, topotecan, mitomycin, cyclophosphamide 그리고 gemcitabine에서공통적으로강한 negative correlation이조사되었다. ( 각각상관계수 r=- 0.88, -0.80, -0.45, -0.41). 각항암제별로감수성을미리예측할수있는중요유전자를찾기위하여 2단계에걸친분석을시행하였다. 우선 GCmatrix를이용하여각항암제와상관성이있는유전자를선별하였으며 (filtering) 다음단계로선정된유전자군을대상으로 SAM을시행하여각항암제에따른저항성과감수성그룹으로나뉘어지는과정에서감수성에상관관계가높은유전자군을조사하였다. 과거연구되어잘알려져있는여러항암제의 target 유전자들은본연구결과중등도의상관성을가짐이밝혀졌다. 예를들면 5-FU의 target 유전자인 TP의경우상관계수 (correlation coefficient) 는 0.28 이었으며그외에 5-FU 치료의중요 34
유전자인 UPP1(r=-0.34), etoposide 치료와관계가있는 TOP2A, -B 의 경우 ( 각각 r=-0.35, -0.37) 상관성이있었다. 또 5-FU 와관계가있는 KIAA0233 유전자 (r=0.42), cisplatin 과관계가있는 HMGCL, HSD17B2 유전자 (r=-0.51, 0.49) 의경우이전의타기관의연구 4 와거의같은 상관계수수치가나오는것을조사할수있었다. 그러나본연구에서는 항암약물치료시각항암제별로감수성을예측할수있는중요 유전자 (novel genes) 를찾기위하여좀더엄격한상관관계기준을적용하여 상관계수 (correlation coefficients) 0.6 이상인유전자검색을하였는데그 내용을표 4 에정리하였다. 위암치료에많이사용되는 irinotecan 의예를보면감수성예상되는세포 주에서 FAS (r=-0.88), AIF-1 (r=-0.73) 와같이 apoptosis 또는 cell cycle arrest 와관련성이있는유전자가과발현되는경향이있으며저항성이있는 세포주에서는 PHGDH (r=0.69), PYGL (r=0.61), CTSL (r=0.64), PHKA1 (r=0.74) 와같이 protein catabolism 과관련이있는유전자가과발현되는 것이조사되었다. 흥미롭게도 FAS (apoptosis), AIF1 (cell cycle arrest) 유전자의경우 irinotecan 과작용기전이유사한 topotecan 의경우에도강한 상관관계 (r=-0.80, -0.75) 가관찰되었다. 위암에서가장많이사용되는항암제에하나인 5-FU 의경우 thymidylate synthetase (TYMS) 의과발현은 5-FU 에서 5-fluoro-dUMP 로대사되는 과정을불활성화시켜 5-FU 항암약물치료시저항성을증가시키는것으로 4, 24, 25 알려져왔다. 그러나 본연구에서는 5-FU 항암제사용시저항성을 35
예측하는지표로서 5-FU와 TYMS의상관계수가 0.038로낮은수치였으며. 이는 13개의위암세포주에서모두비슷하게낮게관찰되었다. 이런상이한결과의이유로 1) 항암제를투여한후 TYMS의과발현이유도될가능성, 2) TYMS가단독으로과발현하지않고 5-FU와상관성이있는수개의유전자가같이영향을주어야만과발현하는경우, 3) 5-FU 단독이아닌 leucovorin과상관성이있는특정유전자와의상관관계를통하여과발현되는경우 4) TYMS 유전자에돌연변이가필요한경우등으로설명할수있어, 항암약물치료전 TYMS 유전자의단독상관성은낮다고판단되었다. 약제간비교의응용으로 Paclitaxel과 docetaxel의치료반응에영향을줄공통의유전자는없었으나 paclitaxel과 docetaxel에감수성을나타내는유전자를비교해보면기능면에서유사점을찾을수있는데, 예를들면두약제모두에서세포부착 (cell adhesion), 세포증식, 단백질분해와연관성이있다고알려져있는유전자가많이조사되었다. 각각의유전자는두약제별로차이가있었는데, proteolysis와관련된유전자로 paclitaxel에저항성을가진위암세포주에서과발현 (over-expressed) 되는유전자는 PSMB8, HERC6, PDE9인반면 docetaxel에저항성을가진위암세포주에서과발현 (over-expressed) 되는유전자는 ADAMTS18, ABHD4, SGK, PCSK5 등이었다. 흥미롭게도 phospholipase family인 PLD1과 PLA2G4A의경우 paclitaxel과 docetaxel에저항성을가진위암세포주에서공통적으로과발현 (over-expressed) 되었다. 이러한사실은비록 paclitaxel과 docetaxel이 tublin이라고하는같은구조물을공격목표로 36
개발된항암제이나유전자사이의상호관계는두항암제가서로상이하며결과적으로유전자측면에서볼때다른작용기전으로항암작용이있기때문에두약제에대한반응률이나독성 (toxicity) 이다르게나타나고있는것으로사료된다. 임상적으로위암환자를대상으로항암치료를할때표 3의 paclitaxel, docetaxel의감수성이있는유전자군을치료받을환자가가지고있는지는항암제선정에도움이될수있다. Paclitaxel의경우 PBX3, ADAMTS19, ABCG4, NDUFV3, ZNF564 유전자가과발현되었을경우감수성예상되어높은반응률을기대할수있는반면 INO80, INPP4B, TNFAIP9, BRE, MTHFD1L 유전자가과발현할경우저항성을고려해야한다. Docetaxel의경우도 MAP4K2, MED8, GBF1, ZNF258, IQCG 유전자가과발현할경우높은반응률을, MGST2, C14orf108, SLC6A13, IGSF8, DHRS1 유전자가과발현할경우낮은반응률을예측하는데도움을줄수있으리라생각한다. 본연구는현재사용되고있는위암치료항암제를대상으로유전자적인관점에서감수성에관심을두었다. 항암치료후저항성을이미얻었거나 26 항암치료후세포의특성에변화가있었던세포주 27 가아닌항암치료전의위암세포주를사용하여항암치료전의유전적인자가항암치료결과예측및가장적절한항암제를선택하는기준으로서의가치를연구하였다. 앞으로전향적비교연구를통하여효용가치가확인되면이처럼특정유전자의발현이미래에는항암제선택의기준이될수있으며맞춤치료, 신약개발이나임상시험에도중요한역할을하리라사료된다. 37
V. 결론 본연구는위암에대하여항암치료를시작하기전에환자의유전자 발현양상과항암제에대한감수성과의관계를조사하기위한연구였다. 연구의결과를종합하면 1. 위암세포주를대상으로항암치료전에항암치료의감수성을미리예측할수있는 database를구축하고 85개의공통유전자군을조사하였다. 2. 유전자와항암제와의상관성을표현하는 GC-matrix에서기존의항암제분류방법과다른유전자의기능을바탕으로한분류의가능성을관찰할수있었다. 3. 현재위암치료에가장많이사용되고있는항암제를대상으로항암제별감수성을예측할수있는특정유전자군을조사하였다. 4. Paclitaxel과 docetaxel 같이작용기전이유사한항암제사용시선택의기준으로환자의유전정보가중요한역할을하리라여겨진다. 상기의결과로항암치료전에항암치료의결과를미리예측할수있는유전자군을각항암제별로조사할수있었다. 이연구결과를바탕으로전향적비교연구를통하여이러한감수성예측유전자의연구가맞춤항암치료의길을열것이며항암제에개발및작용기전이해에도많은도움을줄것이다. 38
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Abstract Gene expression profiling for chemosensitivity prediction in gastric cancer cell lines using oligonucleotide microarray Yong Tai Kim Department of Medicine The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Hyun Cheol Chung) Gastric cancer is one of the most common malignancies in Korea, and many chemotherapeutic agents have been studied for cancer treatment. Recently, newly developed chemotherapeutic agents and combination chemotherapy helped in increasing treatment responses. However clinical application of standard predictive marker in gastric cancer has not been proved. To make a prediction of treatment response, I attempted to identify a set of chemotherapy-related genes that could influence chemo-sensitivity or chemo-resistance in gastric cancer 45
treatment. This study focused on intrinsic susceptibility of gastric cancer to various anticancer regimens. So untreated gastric cancer cell lines was used instead of acquired drug-resistant gastric cancer cell lines or immediately drug-treated cell lines. 1. I establish database (GC-matrix) that explains the correlation between gene expression and chemosensitivity 2. In this study, using by GC-matrix, we identified 85 genes which had high correlation with chemotherapy drugs. The correlation coefficients are over 0.40 in 11 of 16 anticancer drugs, and the selected 85 genes are supposed to common chemosensitivity genes in gastric cancer (37 positively correlated and 48 negatively correlated genes) 3. MAD2 has known to multi-drug resistant gene in gastric cancer cells. MAD2L1 gene was negatively correlated with etoposide, leucovorin, vinblastine, carboplatin, methotrexate, paclitaxel, vincristine, and cyclophosphamide (r=-0.75, -0.64, -0.52, -0.51, -0.42, -0.39, -0.37 and -0.36, respectively) 46
4. FAS has known to multi-drug resistant gene in gastric cancer cells. FAS gene was highly negative correlated with irinotecan, topotecan, mitomycin, cyclophosphamide and gemcitabine (r=-0.88, -0.80, -0.45 and -0.41, respectively) 5. Particular drugs were also found with similar correlation coefficient to previous study, KIAA0233 in 5-FU (r=0.42), HMGCL, HSD17B2 in cisplatin (r=-0.51, 0.49, respectively) 6. In case of irinotecan, some apoptosis-related and cell cycle arrestrelated genes were over-expressed in chemo-sensitive cell lines, while some protein catabolism-related genes were over-expressed in chemoresistant cell lines. 7. With paclitaxel, overexpressed PBX3, ADAMTS19, ABCG4, NDUFV3, ZNF564 genes which tend to have chemo-sensitivity can be candidate genes for good response, while overexpressed INO80, INPP4B, TNFAIP9, BRE, MTHFD1L genes which have chemo-resistance can be candidate genes for poor response. 47
8. With docetaxel, overexpressed MAP4K2, MED8, GBF1, ZNF258, IQCG genes which tend to have chemo-sensitivity can be candidate genes for good response, while overexpressed MGST2, C14orf108, SLC6A13, IGSF8, DHRS1 genes which have chemo-resistance can be candidate genes for poor response. Conclusion: Common sensitive or resistant genes and different sets of genes are identified for specific anticancer drugs to gastric cancer cell lines. After prospective randomized studies, these genes may act as predictive markers for chemosensitivity in untreated gastric cancer patients. Key Words: Gastric cancer, Oligonucleotide microarray, Chemosensitivity, Genes. 48