한국인에서만성폐쇄성폐질환과인체폐표면활성제단백 -A 유전자대립형질의상관관계 순천향대학교의과대학내과학교실, 소아과학교실 1 나주옥, 오명호 1, 최재성, 서기현, 김용훈. Association between the Human Surfactant Protein-A(SP-A) Gene Locus and Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Korean Population Joo Ock Na, M.D., Myung Ho Oh, M.D. 1, Jae Sung Choi, M.D., Ki Hyun Seo, M.D., Yong Hoon Kim, M.D. Department of Internal Medicine, Pediatrics 1 Soonchunhyang University Collage of Medicine, Cheonan, Korea Backgrounds: This study investigated whether or not a polymorphism in the gene encoding the surfactant protein A(SP-A) has any bearing on the individual susceptibility to the development of chronic obstructive pulmonary disease() in a genetically homogenous Korean population. Methods: The genotypes of 19 patients and 20 healthy neonates as controls were tested using a polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism analysis for the SP-A gene. Results: The specific frequencies of the 6A2 and 6A18 alleles of SP-A1 and the 1A2 allele of SP-A2 were much higher in the group than control group (p<0.05). However, the frequencies of the 6A3 and 6A4 alleles of SP-A1 and the 1A0 allele of SP-A2 in the group were significantly lower than the control group. In the group, the frequencies of the +50 locus genotypes GG of SP-A1 and the +9 locus genotypes CC of SP-A2 were 85.0% and 60.6%, respectively, and 19.7% and 24.8% in the control group, respectively. The frequencies of the polymorphic genotypes or alleles showed a statistically significant difference between the group and the control group (P<0.05). Conclusion: A genetic polymorphism in SP-A is associated with the development of in the Korean population. (Tuberc Respir Dis 2006; 60: 638-644) Key words: Surfactant, SP-A, SP-A alleles, Genotype of SP-A,, Genetic polymorphism. 서 만성폐쇄성폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, ) 은흡연등유해한외부가스에의한비정상적인염증반응에의해발생한만성기관지염또는폐기종으로인해서서히진행하는비가역적인기도폐쇄를특징으로하는질환이다 1. 특히최근에유병률과사망률이증가하여관심이높아지고있는질병이지만그발병과정에대하여는흡연이중요한위 론 본연구는 2004 년순천향대학교연구비지원으로이루어졌음. Address for correspondence : Joo Ock Na, M.D. Department of Internal Medicine, Cheonan Hospital, Soonchunhyang University Collage of Medicine 23-20 Bongmyeong-dong, Cheonan, 330-721 Korea Phone : 041-570-3666 Fax : 041-570-5762 E-mail : juokna@schch.co.kr Received : Apr. 18. 2006 Accepted : Jun. 16. 2006 험인자라는것외에는아직까지확실하게알려진것이없다. 그러나, 의확실한위험인자로알려진중증흡연자의약 10-20% 에서만 가발병하는것으로보아 의발생에흡연외에도다른환경적또는유전적인인자가관여할것으로추측되고있다 1-2. 폐표면활성제단백은정상폐기능을유지하는데필수적이며기관지의안정이나숙주의타고난면역반응및염증반응을조절하는기능을가지고있다 3. 폐표면활성제단백이 의발생에어떠한역할을할것으로추측되고있지만아직까지 와폐표면활성제단백사이의관련성에대하여는드물게외국에서연구가되어져왔다 3-7. 폐표면활성제는기도의허탈을예방하며특히폐표면활성제단백중 SP-A와 SP-D는폐의면역반응에관여하는것으로알려져있다 3,8. 소수의연구에따르면이러한폐계면활성단백의일부대립형질이만성폐쇄성폐질환환자에서증가되어있다고한다 9-12. 638
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 60. No.6, Jun. 2006 따라서본연구에서는폐염증반응에중요한역할을하는폐표면활성제단백중 SP-A의유전자대립형질을밝혀만성폐쇄성폐질환발생의위험인자를예측할수있는지를알아보고자하였고, 기존의보고들을통해다른나라와한국인사이의 SP-A 유전자대립형질의분포및빈도를비교하여한국인에만있을수있는새로운 SP-A 유전자대립형질을발견하고자하였다. 대상및방법 1. 대상 2004년 10월부터 2004년 12월까지순천향대학교천안병원호흡기내과외래에서진료받은 환자 19명과정상대조군신생아 20명을대상으로하였다. 만성폐쇄성폐질환진단기준은호흡기증상여부에관계없이흡연력이있고, 폐기능검사에서 1초시강제호기량 (FEV1) 이 70% 미만이거나 1초시강제호기량 (FEV1) 대강제폐활량 (FVC) 의비 (FEV1/FVC) 가 70% 만이고, 기관지확장제검사상변화율이 15% 이하인경우로하였다 13. 폐기능검사는 Spirometry (Medgraphics 1085 DX. USA) 를이용하였다. 정상대조군은 20명의정상신생아를대상으로하였다. 2. DNA 추출전혈 0.5-3ml를신생아대조군에서는제대혈로채취하였고환자군에서는전혈로채취하여 EDTA 용기에넣고 -70도에보관하였다. Genomic DNA는 Puregene DNA Isolation Kit(Gentra Systems, Minneapolis, MN, USA) 를사용하여전혈에서추출하였다. 이를간단히기술하면, 전혈액 2mL를 EDTA 용기에담고 -70 에서냉동보관후 200μl에 1 X SSC 버퍼 160μl를첨가하여 12,000 rpm에서 5분간원심분리하였다. 상층액을제거후 1X SSC 버퍼 300μl를첨가하고원심분리한후, 각침전물에 1.2M NaOAc 75μl, 10% SDS 5μl와 Proteinase K(20mg / ml H 2 O) 1μl를섞었다. 55 항온수조에서 1시간동안방치한후, phenol/ chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1) 100μl를첨가하여 30초동안섞고, 12,000 rpm에서 5분간원심분리하였다. 새로운 1.5ml미세원심분리관의상층부를조심스럽게옮기고, chloroform 100μl첨가후 30초간잘흔들어 12,000 rpm에서 5분간원심분리하였다. 새로운 1.5ml미세원심분리관에상층부를조심스럽게옮기고, 차가운 100% Ethanol(-20 보관 ) 500μl를첨가하여 -20 에 20분간방치하였다. 12,000 rpm 에서 2분간원심분리후상층액을버리고침전된침전물에 80% ethanol(4 보관 ) 1ml첨가후 12,000 rpm에서 5분간원심분리하였다. 상층액을버리고 Speed-Vac 에서 10분간침전물을건조한다음, 증류수 50μl에침전물을녹이고 Genomic DNA를 55 항온수조에서 1시간동안용해한후 -20 에보관하였다. 추출된 DNA는 PCR 반응을위하여 50ng/uL로희석시켰다. 3. SP-A 유전자의유전자분석 (Genotyping of SP-A Genes) SP-A1의유전자분석은 DiAngelo 등이 14 사용한 PCR-cRFLP 방법을이용하였다. 1) 중합효소연쇄반응 (polymerase-chain reaction, PCR) 증폭 SP-A1과 SP-A2 유전자는 3.3kb의크기로서전혈로부터추출하였다. SP-A1 은 Gene specific sense primer인 326과 antisense primer인 68A로, SP-A2는 Gene specific sense primer인 327과 antisense primer 인 68A로증폭시켰다. PCR 증폭이끝난후 1% agarose gel에서 SP-A1 과 SP-A2 유전자를확인하였다. 2) 제한효소분석 (restriction endonuclease analysis) (1) SP-A1 유전자의대립형질을위해증폭된 SP-A1 PCR 생성물을 primer 765/787, 767/768, 788/21를이용하여 2차로증폭시킨후 19, 50, 62, 133, 219위치의 nucleotide를자르는 restriction enzyme을 639
JO Na et al. : Human surfactant protein-a(sp-a) gene locus and chronic obstructive pulmonary disease 이용하여 (PCR-cRFLP-based methodology) 각위치를자른후전기영동하여염기서열의차이를확인하였다. (2) SP-A2 유전자의대립형질을위해증폭된 SP-A2 PCR 생성물을 primer 726/96, 727/21, 799/28A, 805/494를이용하여 2차로증폭시킨후 9, 91, 140, 223위치의 nucleotide를선택적으로자르는제한효소를이용하여 (PCR-cRFLP-based methodology) 각위치를자른후전기영동하여염기서열의차이를확인하였다. 3. 통계분석유전자대립형질의빈도의비교에는 Chi-square test를사용하였고, 폐렴군과대조군간의비교는 Fisher 의정확검증을시행하였으며, odds ratio와 95% confidence interval 은 Woolf(logit) 방법에의하여계산하였다. 통계처리는 SPSS(version 12.0) 를이용하였고, 통계학적유의수준은 p value <0.05로하였다. 결과 1. 대상환자의특성 환자는총 19명이었으며모두남자였고, 평균나이는 66.8 ± 8.4세이었다. 이중현재까지흡연을하고있는환자는 7명이었고이전에흡연을하였으나 Table 1. Clinical features of 19 patients sith * Characteristics number Total patients 19 Male : female 19:0 Age 66.8±8.4 yrs Smoker : ex-smoker 7:12 Smoking amount 51.9±12.6py FEV1 1.4±1.2L (59.1±23.4%) FVC 3.0±0.8L (98.6±19.4%) FEV/FVC 51.9±12.6% * : chronic obstructive pulmonary disease Table 2. Frequencies of SP-A genotypes in and control SP-A1 genotype frequencies(%) OR (95%CI ) p-value Control 6A 0 1.1 6A2 62.5 28.7 4.13(1.92-6.41) 0.00001 6A3 10.0 44.5 0.14(0.06-0.44) 0.00002 6A4 2.0 21.8 0.19(0.05-0.85) 0.01 6A18 17.5 0.3 73.6(6.63-15.3) 0.00001 others 5.0 3.6 SP-A2 genotype frequencies(%) OR (95%CI ) p-value Control 1A 0 13.1 1A0 27.5 40.7 0.55(0.31-1.14) 0.01 1A1 0 9.3 1A2 70.0 10.0 21.0(6.05-20.63) 0.00001 1A9 2.5 2.4 1.04(0.16-6.61) 0.97 others 0 24.5 0(0-0.49) 0.004 OR : Odd ratios CI : Confidence intervals 640
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 60. No.6, Jun. 2006 70 60 50 40 30 20 10 0 Normal 6A 6A2 6A3 6A4 6A18 others 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Normal 1A 1A0 1A1 1A2 1A9 others Figure 2. Distribution of the SP-A2 alleles in the and control Figure 1. Distribution of the SP-A1 alleles in the and control 현재는금연하고있는환자가 12명이었다. 대상환자들의평균흡연양은 51.9 ± 12.6 갑년이었다. 모든환자들이활동시호흡곤란을호소하였다. 폐기능검사에서기관지확장제사용전각각평균 FEV 1 은 1.4 ± 1.2 L, FEV 1 59.1 ± 23.4 %, FVC 3.0 ± 0.8 L, FVC 98.6 ± 19.4 %, FEV 1 /FVC 51.9 ± 12.6 % 이었다. (Table 1) 2. 유전자분석 1) 대조군에서 SP-A1의대립형질은 6A 3 44.5%, 6A 2 28.7%, 6A 4 21.8%, 6A 1.1% 의분포를보였고, SP-A2 중 1A 0 40.7%, 1A 13.1%, 1A 5 11.4%, 1A 2 10%, 1A 1 9.3% 의분포를보였다 (Table 2). 2) 군의 SP-A1 유전자대립형질은대조군에비해 6A 2, 와 6A 18 이통계적으로유의하게높은빈도를보였고, 6A 3, 6A 4 는낮은빈도를보였다 (Figure 1, Table 2). 3) 군의 SA-A2 유전자대립형질중 1A 0 는대조군에비해통계적으로낮은빈도를보였고, 1A 2 는대조군에비해유의하게높은빈도를보였다 (Figure 2, Table 2). 4) SP-A1의 50번째 nucleotide가 GG인경우가대조군에비해 군에서의미있게높았고, SP-A2 의 9번째 nucleotide가 CC인경우 군에서의미있게높았다 (Table 3). Table 3. Analysis of SP-A nucleotides in and control SP-A1 aa19 aa50 aa62 aa133 aa219 1=T, 2=C 1=G, 2=C 1=A, 2=G 1=A, 2=G 1=C, 2=T Con Con Con Con Con 11 95.0 93.2 85.0* 19.7 45.0 55.4 100 98.0 55.0 59.8 12 5.0 6.4 0 35.7 55.0 39.0 0 2.0 45.0 35.4 22 0 0.4 15.0 44.6 5.6 5.6 0 0 0 4.8 SP-A2 aa9 aa91 aa140 aa223 1=A, 2=C 1=G, 2=C 1=C, 2=T 1=C, 2=A Con Con Con Con 11 15.0 24.9 100 61.6 95.0 72.3 100 74.6 12 25.0 50.3 0 32.2 5.0 27.7 0 19.2 22 60.6* 24.8 0 6.2 0 0 0 6.2 * p Value < 0.0.5 641
JO Na et al. : Human surfactant protein-a(sp-a) gene locus and chronic obstructive pulmonary disease 고찰 는전세계적으로사망률및이환율이증가되고있는질병으로최근발표된연구에의하면우리나라의 45세이상의성인에서 유병률이 17% 나되는것으로밝혀졌다 15. 그러나, 이러한 의병인은아직까지흡연이외에잘알려져있지않으며흡연을하지않는성인에서도 가발병할수있고또한중증흡연자의 10-20% 에서만 가발병하는것으로보아다른여러가지환경적, 유전적요인들이 발병에작용할것으로추측되고있다 16. 폐표면활성제단백 A(human surfactant protein- A, SP-A) 는폐표면활성제 (pulmonary surfactant, PS) 의구성중단지 1% 만을차지하는아주적은양의단백질이지만, SP-D와함께폐의면역과숙주방어기능에아주중요하게작용하며폐의염증반응을조절하는데중요한역할을하는것으로알려져있다 3. 폐표면활성제는인지질과폐표면활성제단백으로이루어져있고흡연자의기관지세척액에서는이러한인지질과폐표면활성제단백이모두감소되어있다. 인지질의감소는중성구로부터분비된 elastase에의해세기관지의손상을일으켜기관지허탈을일으키며, SP-A와 SP-D의감소는말초기도에서세균과바이러스에대한방어력을약화시켜염증을잘호발하게하는것으로밝혀져있다 8. 또한실제로쥐에게폐기종을유발시키는 elastase 를투여후폐표면활성제를투여시폐기종의발생을예방하는효과가있음을보고하였다 6. 폐표면활성제는이처럼소기도의허탈을막을뿐만아니라기도에서점막섬모운동 (mucociliary clearance) 을항진시키고염증성사이토카인의분비와전사인자 (transcription factor) 의활성을억제하여기도의염증세포의기능을조절하는것으로밝혀져폐표면활성제가 의병인에중요한역할을할것으로추측되고있으나아직까지그기전은명확하게는밝혀져있지않다 3. Guo등은멕시코사람들을대상으로 SP-A, B, D의대립형질을연구한결과 환자에서정상인에비해특정대립형질의차이를보인다고하였고 (4), Xie 등도중국인을대상으로한연구에서 환자의 SP-A 대립형질의분포가정상인에비해의미있는차이를보였다고보고하였다 9. 본연구에서도 SP-A1 유전자대립형질은 군에서대조군에비해 6A 2, 와 6A 18 이유의하게높은빈도를보였고, 6A 3, 6A 4 는낮은빈도를보였으며, SA-A2 유전자대립형질중 1A 0 는대조군에비해낮은빈도를보였고, 1A 2 는높은빈도를보였다. 또한염기서열분석결과 군에서 SP-A1의 50번째염기서열이 GG인경우와, SP-A2의 9번째염기서열이 CC인경우가대조군에비해의미있게높은분포를보임을알수있었다. 의경우복잡한병발기전들과원인들을가지고있어연구를위해임상적으로특정균일한그룹을파악하기가어렵다. 따라서, SP-A의대립형질과염기서열을분석함으로써특정대립형질 (inducer : 6A 2, 6A 18, 1A 2 & protector : 6A 3, 6A 4,1A 0 ) 에차이를보이는경우 가발생될가능성에대한단서를제공할수있으며, 이러한대립형질의차이를보이는특정 그룹을찾아내어이러한환자군을대상으로약물의효과라든지다른치료들에대한반응들을연구하는데사용되어질수있을것으로보인다. Guo 등은 SP-A, B 그리고 D의대립형질을분석한결과대조군에서흡연군과비흡연군사이에폐표면활성단백유전인자의차이는보이지않았고, 군에서 SP-D의대립형질은 (D2S388_5 marker allele) 흡연과연관이없이독립적인 발생인자이지만, SP-A와 SP-B의대립형질은 (AA62_A, B1580_C) 흡연과연관되어 의발생을증가시키는위험인자로보고하였다 11. 이처럼폐표면활성단백의대립형질을분석함으로써흡연자중 가잘발생될수있는고위험군을구별하는데도움을줄수있을것으로생각된다. 그러나, 본연구에서는대상 환자의수가작고모두흡연자였던관계로흡연과 SP-A 대립형질과의관계를분석할수가없었다. Guo등은특정대립형질의경우중증 와의연관성을보고하였는데추후한국인에서도더많은 환자를대상으로폐표면단백의대립형질을분석시중증도와연관성이있는대립형질이있는지 642
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 60. No.6, Jun. 2006 를분석하고흡연과의상관관계를분석하는것이필요할것으로보인다. 그외에도본연구에서는대상환자의수가작아 발병에영향을줄수있는나이나성별, 흡연양또그외의다른여러요인들과대립형질들분포와의독립적상관관계를알수없다는것이제한점으로생각되며, 추후대규모의 환자들을대상으로폐표면단백의유전자와 발생위험인자들과의연관성을조사하고, SP-A뿐만아니라다른연구에서 와연관성이있다고알려진 SP-B, D의대립형질도같이분석하여서로상관관계가있는지를분석하는것이도움이될것으로보인다. Hubert 등은 의급성악화로인한중증호흡부전으로기계호흡을하고있는환자에서외부에서폐표면활성단백을투여하여기계호흡이탈에성공한예를보고하였다 17. 따라서, 대립형질을분석시대상환자의혈청과기관지세척액에서폐표면활성단백을측정하여대립형질과상관관계가있는지를알아보아추후중증 의치료에폐표면활성단백을선택적으로이용할수있는지여부를연구하는것이필요하다. 본연구의단점으로는환자군과비교하여역학조건을만족시키는대조군을사용하는대신정상신생아의유전자를분석하였다는점인데, 본연구에사용된신생아대조군 20명의대립형질의분포는이제까지발표된한국정상신생아의폐표면활성제단백의대립형질분포와유사하여 18-19 대조군으로사용하였지만추후연구에서는더많은수의환자와함께나이, 성별, 흡연여부등의역학조건을일치시킨대조군을선정하여연구를진행하는것이필요할것으로생각된다. 결론적으로, 우리나라에서는 SP-A의특정대립형질 (inducer : 6A 2, 6A 18, 1A 2 & protector : 6A 3, 6A 4,1A 0 ) 에차이를보이는경우 가발생될가능성이높은것을알수있었고, 특히 SP-A1의 50번째염기서열이 GG인경우와, SP-A2의 9번째염기서열이 CC인경우에 발생가능성이높을것으로예측된다. 요약연구배경 : 만성폐쇄성폐질환 ( 이하 ) 은기도의만성적인염증이특징인질환이다. 의발생에는흡연외에도환경적, 유전적인인자가복합적으로작용한다. 폐표면활성제단백-A( 이하 SP-A) 는급성기반응물질 (acute phase reactant molecule) 과유사한구조및기능을가진것으로연구되어져폐의숙주방어와염증반응에중요하게관여하는것으로알려졌다. 이에저자들은폐에서염증반응및면역에관여하는 SP-A와 군과의유전자대립형질을비교분석하여 SP-A가 의병인에관여하는지를밝히고자본연구를시행하였다. 방법 : 2004년 10월부터 2004년 12월까지순천향대학교천안병원호흡기내과에서 로진단되어치료받고있는환자 19명과, 순천향대학교천안병원신생아실에입원한정상신생아 20명을대조군으로하여 PCR-cRFLP 방법을사용하여아미노산염기서열의차이에의해 SP-A의유전자형을연구하였다. 결과 : 1) 군의 SP-A1 유전자대립형질은대조군에비해 6A 2, 와 6A 18 이통계적으로유의하게높은빈도를보였고, 6A 3, 6A 4 는낮은빈도를보였다. 2) 군의 SA-A2 유전자대립형질중 1A 0 는대조군에비해통계적으로낮은빈도를보였고, 1A 2 는대조군에비해유의하게높은빈도를보였다. 3) SP-A1의 50번째 nucleotide가 GG인경우 군에서통계적으로의미있게높았고, SP-A2 의 9번째 nucleotide가 CC인경우 군에서통계적으로의미있게높았다. 결론 : 우리나라에서는 SP-A의특정대립형질 (inducer : 6A 2, 6A 18, 1A 2 & protector : 6A 3, 6A 4,1A 0 ) 에차이를보이는경우 가발생될가능성이높은것을알수있었고, 특히 SP-A1 의 50번째염기서열이 GG인경우와, SP-A2의 9번째염기서열이 CC인경우에 발생가능성이높을것으로예측된다. 643
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