만성기침환자에서혈청클라미디아항체에대한 ELISA 와 microimmunofluorescence 검사의비교 강원대학교의과대학내과학교실, 강원대학교병원임상의학연구소이희영, 김우진 Enzyme-linked Immunosorbent Assays for Antibodies against Chlamydia Pneumoniae Compared with Microimmunofluorescence Test with Patients with Chronic Cough Hui Young Lee, M.D., Woo Jin Kim, M.D. Department of Internal Medicine, College of Medicine, Kangwon National University and Clinical Research Institute, Kangwon National University Hospital Background : Chlamydia pneumoniae is a clinically important pathogen, the diagnosis of such infection being based mainly on serology. Microimmunofluorescence (MIF) is the current standard diagnostic method, but is subjective and time-consuming, so the authors tested the serology of chronic cough patients using an EILSA method for the Chlamydial antibody, which is a more objective method, and compared the results with those of the standard method. Method : Thirty-five patients, who visited Kangwon National University Hospital between August 2003 and July 2004, were evaluated. A MIF and ELISA tests were used to determine C. pneumoniae antibody titers. Nasopharyngeal aspirates were examined by polymerase chain reaction (PCR). The Spearman rank correlation test was used for data analysis. Results : Sensitivities of ELISA for IgG, IgA and IgM, as judged by MIF, were 84.0, 84.0 and 40.0% and the specificities were 60.0, 60.0 and 96.7%, respectively. Three patients were Chlamydia PCR positive. Conclusion : ELISA can be a useful tool for studying the seroprevalence of Chlamydia pneumoniae. However, further studies will be required prior to its clinical use. (Tuberc Respir Dis 2005; 59: 47-52) Key words : Chlamydophila pneumoniae, Enzyme Linked Immunosorbent assay 서 클라미디아폐렴균은지역사회폐렴의약 10% 에서원인균이며 1 성인의 70% 까지혈청양성소견을보여 2 이전에클라미디아폐렴균에감염되었거나만성감염으로유지되는경우가많은것으로사료된다. 특히최근클라미디아폐렴균에대한혈청양성이동맥경화와관련된다는보고가있고 3, 만성호흡기증상과관련된다는보고와 4 폐암의위험요인이된다는보고도있어 5, 앞으로도클라미디아폐렴균의, 동맥경화와폐 2004년도강원대학교학술연구조성비로연구하였음 Address for correspondence : Woo Jin Kim, M.D. Department of Internal Medicine, Kangwon National University Hospital, 17-1 Hyoja-3 Dong, Chunchon-Si, Kangwon-Do, 200-947, Korea Phone : +82-33-258-2377 Fax : +82-33-258-2455 E-mail : pulmo2@knuh.or.kr Received : Jan. 26. 2005 Accepted : Jun. 28. 2005 론 질환에대한역할에대해많은임상적, 역학적연구가요구되고있다. 클라미디아폐렴의진단에있어, 클라미디아폐렴균의배양이매우어렵고, polymerase chain reaction (PCR) 은좀더민감하지만아직진단적으로인정받지는못하고있어, 현재까지혈청검사가진단에가장중요하게이용된다. 그중에서 microimmunofluore scence(mif) 검사법이표준으로되어있다 6. 그러나, 이검사는시간이많이소요되며, 주관적이며많은경험이요구된다는단점이있다. 특정질환과클라미디아폐렴균과의관계를연구하기위해특정질환에서의혈청학적유병률을연구하게되는데, 이경우많은환자를대상으로하게되고이경우좀더객관적이며한번에많은수의검사를시행할수있는 Enzyme-Linked Immunosorbent assay (ELISA) 가더유리할수있다. 그러나, 클라미디아폐렴의진단에서는 MIF 이외에는표준진단으로인정받지못하고있다 6. 47
HY Lee et al.: Comparison of ELISA and microimmunofluorescence for Chlamydia antibody MIF와 ELISA 를비교한최근연구는정상인은대상으로하거나 7,8, 호흡기감염이있는환자들을대상으로 9 시행되었다. 클라미디아혈청검사의경우, 호흡기감염을가진환자이외에도동맥경화, 만성호흡기질환과의관련성을알기위해시행되는데, 이런대상에서 MIF와 ELISA를비교한연구는거의없다. 만성기침과클라미디아폐렴균과의관계는아직논란이있는상태로, 만성기침을호소하는환자들에서두가지검사법으로검사를진행하여 ELISA 검사법이표준검사법과비교하여정확도가어떤지를평가하기위하여연구를진행하였다. 서반응시킨후, PBS로세척하고, 다시 FITC-con jugated anti-ig G, A, M 으로 1시간동안반응하고, 세척한후형광현미경으로 200배시야에서관찰하였다. IgM 검사에는비특이적반응을없애기위해 RF absorbent(dade Behringer, Marburg, Germany) 를처리하여 15분간미리반응시켰다. 정성적인비교를위해 Ig G, A, M 모두 이상을양성으로판정하였다. 정량적인비교를위해서는 MIF 역가를구하였다. 4. PCR 방법 1. 혈청 3주이상지속되는만성기침을주소로 2003년 8월부터 2004년 7월까지강원대학교병원을방문한 35명의성인환자에서얻은혈청으로검사를시행하였다. 흉부방사선사진에서이상소견이발견된환자는제외하였다. 혈청은검사에사용하기까지 -70 에서보관하였다. 본연구는강원대학교병원임상연구위원회의승인을얻었다. 2. ELISA 환자의비인두에서스왑으로얻은검체를원심분리하여원침에서 DNA를추출하였고, Gaydos 등 11 에의한방법으로 PCR을시행하였다. PCR 조건은 primer CPN90 5' GGTCTCAACCCCATCCGTGTCGG 3', CPN91 5'TGCGGAAAGCTGTATTTCTACAGTT 3' 을첨가하여, denaturation은 94 에서 15분, annealing 62 에서 52 로 touchdown 법으로시행하였고, ex tension은 72 에서 1분간시행하였다. 5. 통계 Spss(ver. 10.0) 으로 ELISA I.D 수치와 MIF의역가에대하여비모수상관계수분석 (Spearman) 을하였다. 준비된혈청을클라미디아폐렴균에대한 IgG, IgA, IgM 항체에대하여 Hitazyme Cpn kit(hitachi chemical, Tokyo, Japan) 을이용하여정량적으로 3회측정하여평균을구하였다. 측정치가 IgG, IgA는 1.10 이상이면양성으로, IgM은 1.60 이상이면양성으로판정하였다 10. 3. MIF 결과 1. 대상환자총환자수는 35명 ( 남자13, 여자22) 평균나이는 50.0 ± 18.7 세이었고, 흡연력은평균 3.2 ± 6.0 갑년이었다. 병력으로고혈압이 5명, 당뇨가 2명, 결핵이 1명이었다. 순수분리하여 0.03% 포르말린으로고정한 C. pne umoniae(ar-39), C. trachomatis(l2), C. psittaci 의 elementary body(eb) 를유리슬라이드에항원으로올리고, 순차적으로희석한혈청을 1시간동안 37 에 2. IgG ELISA 로양성인환자가 24명, MIF로양성인환자가 33명이었다 (Table 1). MIF 결과를 gold standard 48
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 59. No. 1, Jul. 2005 Table 1. Results of C. mneumoniae serology by microimmunofluorescence and ELISA Number IgG IgA IgM ELISA MIF ELISA MIF ELISA MIF 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 0.73 3.23 1.96 1.52 0.49 0.81 3.15 3.08 2.64 0.20 1.42 1.74 0.89 1.43 3.43 0.80 3.04 1.38 1.54 1.04 1.85 0.74 0.84 1.38 0.02 1.13 1.31 1.84 2.02 0.62 2.56 1.89 2.10 0.14 1.39 1:128 1:1024 < 1:128 1.72 2.61 2.85 0.86 0.70 0.82 1.02 1.78 2.24 2.88 0.48 1.09 0.81 0.42 1.25 1.76 1.47 2.71 0.92 1.27 1.60 0.67 1.04 2.46 0.09 0.67 1.93 1.30 3.59 0.65 1.85 1.30 0.98 1.65 1.99 < < < < < < < < < < 1.01 0.78 0.63 1.18 1.47 0.91 1.82 1.55 3.18 0.56 0.77 0.43 0.87 0.90 1.00 0.78 0.64 1.19 0.67 0.59 0.70 1.15 1.23 0.87 0.94 0.89 0.55 0.61 0.60 0.80 0.69 1.29 0.97 1.62 1.44 < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < < 로하였을때, ELISA 검사의위양성은없었고, 위음성이 9명있어 74.3% 의일치율을보였다. 민감도는 72.7%, 특이도는 100% 이었다. 상관계수는 0.846(p< 0.05) 이었다. 3. IgA 4. IgM ELISA 로양성인환자가 3명, MIF로양성인환자가 5명이었다. 위양성이 1명, 위음성이 3명이었다. 민감도는 40.0%, 특이도는 96.7% 이었다. 일치율은 88.6% 이었다. 상관계수는 0.300(p=0.08) 이었다. ELISA로양성인환자가 25명, MIF로양성인환자가 25명이었다. 위양성이 4명, 위음성이 4명이었고일치율은 77.1% 이었다. 민감도는 84.0%, 특이도는 60.0% 이었다. 상관계수는 0.433(p<0.05) 이었다. 5. PCR 3명의환자에서 PCR 양성소견을보였다 (Fig. 1). 이들의혈청은 IgG는두명이 1:128에서, 한명이 에서양성이었고 IgA는모두 에서양성이었고, 49
HY Lee et al.: Comparison of ELISA and microimmunofluorescence for Chlamydia antibody Figure 1. PCR for C. pneumoniae from nasopharyngeal swabs. Lane 1, 2 and 4 are positive samples for C. pneumoniae, lane 3 is negative sample and lanes 5 and 6 are negative and positive controls, respectively. IgM 역가는모두음성이었다. 고 본연구에서는 ELISA로시행한만성기침환자의클라미디아폐렴균에대한항체가를기존의표준검사인 MIF법과비교하여 IgG는민감도 84.0%, 특이도 60.0%, IgA는민감도 84.0%, 특이도 60.0%, IgM은민감도 40.0%, 특이도 96.7% 의결과를보였다. 이전의연구에서는 Numazaki 등이소아를대상으로 ELISA 를 MIF와비교한연구에서 IgG는 90.4% 의민감도와 89.9% 의특이도를보였고, IgA는 84.6% 의민감도와 86.7% 의특이도를보였다 7. 또한, 유럽에서건강인을대상으로한이전의연구에서는 ELISA kit 의종류에따라 58-100% 의민감도와 95-100% 의특이도를보였다 8. 같은그룹에서호흡기감염환자를대상으로시행한연구에서는역시 ELISA의종류에따라차이가있지만 90% 이상의일치율을보였다 9. 본연구는만성기침환자들을대상으로한연구였고, 이들을대상으로혈청역학적연구를 ELISA로시행할때참고가될수있을것이나, 정상대조군이나다른대상군에적용하는경우는추가연구가필요할것으로사료된다. MIF법은순수분리하여포르말린으로고정한 EB 를슬라이드에부착시켜항원항체반응을측정하는것이고, ELISA는일부특이항원을이용한다는점에서방법상의근본적인차이가있다. 본연구에서이용한 ELISA kit는 complex outer membrane complex 를항원으로이용한것으로순수분리한클라미디아폐렴균의 EB로부터 Sarkosyl buffer를이용하여제조하였 찰 다 10,12. 유럽에서제조한 ELISA kit는전체항원또는 recombinant lipopolysaccharide(lps) 등을항원으로이용하였고, LPS의경우에는민감도, 특이도가떨어진다는결과를보였다 9. 본연구에서 IgG의위음성은 (+) 에서 2예, (+) 에서 2예, (+) 에서 5예였다. 1:128이상의높은역가에서위음성을보인예는없었다. 이전의연구에서도대부분낮은역가에서만불일치를보이고있다. IgM의경우는위양성이문제가되는경우가많다. MIF의경우 RF absorbent를처리하여 IgG와 IgG 면역복합체와반응하는 IgM을제거하고, ELISA kit 역시비슷한원리로비특이적인항체를제거하는단계를거친다. 본연구의결과에서 IgM에대한 ELISA 의민감도가낮게나왔다고해석할수도있지만, 대상환자들이흉부방사선상정상인만성기침환자임을감안하면일부환자의 MIF가위양성일가능성이높음을시사한다. 또한, 상관관계가통계적으로의미없는수치로나온것이비특이적항체를제거하는방법의차이가영향을주었을가능성이있다. 본연구는만성기침환자를대상으로항체역가를비교하였다. 혈청학적기준으로이들환자들의 25% 가급성감염, 54% 가만성감염으로판단된다. 혈청학적양성의빈도는지역에따른차이를보이고있다. 이전의연구에서만성기침을대상으로클라미디아혈청검사를하여일본에서는 6.5% 가급성감염이라는보고가있었고, 미국의응급실에서시행한연구에서는 20% 가급성감염이었다. 유럽에서는 4% 가급성감염이고, 46% 가만성감염이었다는보고가있다 13-15. 본연구에서는 3명 (8.6%) 의환자에서 PCR 양성을보였다. 이들의항체가는 IgG가, 에서양성이고 IgM은모두 미만이었다. 회복기의혈청검사가없다는한계가있으나, PCR 양성으로나온환자에서혈청학적으로급성감염의증거는없었다. 이전보고에서일본에서의만성기침환자에서는 5.5% 가 PCR 양성이었고 14, 유럽의연구에서는 1.5% 가 PCR 양성이었다 15. 클라미디아폐렴의진단에서 PCR은아직표준화된방법이정립되지는않았다. 외국의가이드라인에따르면 4가지가비교적신뢰성있는방법으로평가되고있고 6, 본연구에서도이중의한방법을이용 50
Tuberculosis and Respiratory Diseases Vol. 59. No. 1, Jul. 2005 하였다. PCR을이용한폐렴원인균의진단은아직은정확도가떨어지고, 임상에서의이용은제한되고있다 1. 또한, 클라미디아폐렴균은이전의감염이있었던환자에서도검출될수있다는연구보고도있어 16, 해석상의주의를요한다. 결론적으로, 항원성의차이가있을수있음에도불구하고 MIF법과 ELISA 법은혈청 IgG와 IgA 양성이비교적일치하였다. 좀더객관적인 ELISA 검사로많은환자들을대상으로하는혈청역학적연구에서는좀더유용하게이용될수있을것으로사료된다. 하지만임상적인폐렴의진단에이용되기위해서는 IgM의결과가좀더나아져야할것이고, 항체역가의 4배증가를 ELISA의수치변화에적용할수있을지는좀더연구가필요할것으로사료된다. 요약연구배경 : 클라미디아폐렴균은임상적으로중요한균으로혈청검사가진단에중요하다. 현재이용되는 micro immunofluorescence 법은주관적이고시간이많이소요되므로좀더객관적으로진단할수있는 ELISA 법을이용하여만성기침을주소로내원한환자들의혈청을대상으로검사하고표준방법과결과를비교하였다. 방법 : 2003년 8월부터 2004년 7월까지강원대학교병원을방문한 35명의성인환자에서얻은혈청을 ELISA 법과 micoimmunofluorescence 법으로시행하였다. 비인두스왑에서 PCR을시행하였다. 두방법의비교는비모수상관계수분석 (Spearman) 을하였다. 결과 : ELISA 검사결과 IgG는민감도 84.0%, 특이도 60.0%, IgA는민감도 84.0%, 특이도 60.0%, IgM은민감도 40.0%, 특이도 96.7% 의결과를보였다. PCR은 3 명의환자에서양성이었다. 결론 : ELISA법이많은환자들을대상으로하는역학적연구에서는좀더유용하게이용될수있을것으로사료된다. 임상적으로적용되기위해서는좀더연구가 필요할것으로사료된다. 참고문헌 1. File TM. Community-acquired pneumonia. Lancet 2003;362:1991-2001. 2. File TM, Tan JS, Plouffe JF. The role of atypical pa thogens: Mycoplasma pneumonia, Chlamydia pne umoniae and Legionella pneumophila in respiratory infection. Infect Dis Clin North Am 1998;12:569-92. 3. Saikku P, Leinonen M, Mattila KJ, Ekman MR, Nieman MS, Makela PH, et al. Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet 1988;2:983-6. 4. Falck G, Gnarpe J, Hansson LO, Svardsudd K, Gnarpe H. Comparison of individuals with and with out specific IgA antibodies to Chlamydia pneumoniae. Chest 2002;122:1587-93. 5. Kocazeybek B. Chronic Chlamydophila pneumoniae infection in lung cancer, a risk factor: a case-control study. J Med Microbiol 2003;52:721-6. 6. Dowell SF, Peeling RW, Boman J, Carlone GM, Fields BS, Guarner J, et al. Standardizing Chlamydia pne umoniae assays: recommendations from the centers for disease control and prevention and the labor atory centre for disease control. Clin Infect Dis 2001; 33:492-503. 7. Numazaki K, Ikebe T, Chiba S. Detection of serum antibodies against by Chlamydia pneumoniae ELISA. FEMS Imunol Med Microbiol 1996;14:179-83. 8. Hermann C, Graf K, Groh A, Straube E, Hartung T. Comparison of eleven commercial tests for Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin G in asympto matic healthy individuals. J Clin Microbiol 2002;40: 1603-9. 9. Hermann C, Gueinzius K, OehmeA, von Aulock S, Straube E, Hartung T. Comparison of quantitative and semiquantitative enzyme-linked immunosorbent assays for immunoglobulin G against Chlamydia pne umoniae to a microimmunofluoresence test for use with patients with respiratory tract infections. J Clin Microbiol 2004;42:2476-9. 10. Kishimoto T, Matsushima T, Morikawa T, Kawagoe K. Assay of specific anti-chlamydia pneumoniae antibodes by ELISA method: 3. setting of serological criteria. Kansenshogaku Zasshi 1999;73:457-66. 11. Gaydos CA, Quin TC, Eiden JJ. Identification of Chlamydia pneumonia by DNA amplification of the 16S rrna gene. J Clin Microbiol 1992;30:796-800. 12. Caldwell HD, Kromhout J, Schachter J. Purification 51
HY Lee et al.: Comparison of ELISA and microimmunofluorescence for Chlamydia antibody and partial characterization of the major outer mem brane of Chlamydia trachomatis. Infect Immun 1981; 31:1161-76. 13. Wright SW, Edwards KM, decker MD, Grayston JT, Wang S. Prevalence of positive serology for acute Chlamydia pneumonia infection in emergency de partment patients with persistent cough. Acad Emerg Med 1997;4:179-83. 14. Birkebaek NH, Jensen JS, Seefeldt T, Degn J, Hu niche B, Andersen PL, et al. Chlamydia pneumonia infection in adults with chronic cough compared with healthy blood donors. Eur Respir J 2000;16:108-11. 15. Miyashita N, Fukano H, Yoshida K, Niki Y, Matsu shima T. Chlamydia pneumonia infection in adult patients with persistent cough. J Med Microbiol 2003; 52:265-9. 16. Menendez R, Cordoba J, Cuadra P, Cremades MJ, Lopez-hontagas JL, Slavert M, et al. Value of the polymerase chain reaction assay in noninvasive res piratory samples for diagnosis of community-acqu ired pneumonia. Am J Respir Crit Care Med 1999; 159:1868-73. 52