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대한진단검사의학회지제 28 권제 5 호 2008 Korean J Lab Med 2008;28:353-61 DOI 10.3343/kjlm.2008.28.5.353 원저 진단면역학 전신자가면역질환에서 Line Immunoassay를이용한항 ENA 항체및항 dsdna항체의검출 김지명 1 임춘화 1 신동혁 2 임미경 2 심승철 2 을지대학병원진단검사의학과 1, 류마티스내과 2 Detection of Anti-ENA and anti-dsdna Antibodies Using Line Immunoassay in Systemic Autoimmune Diseases Ji Myung Kim, M.D. 1, Chun Hwa Ihm, M.D. 1, Dong Hyuk Sin, M.D. 2, Mi Kyung Ihm, M.D. 2, and Seung Chul Sim, M.D. 2 Departments of Laboratory Medicine 1 and Rheumatology 2, Eulji University Hospital, Daejeon, Korea Background : Detection of antibodies to extractable nuclear antigens (ENAs) and dsdna is needed for the diagnosis of and predicting prognosis in systemic autoimmune diseases. Recently introduced line immunoassay (LIA) has the advantage of detecting several autoantibodies simultaneously, and we evaluated its usefulness in the diagnosis of autoimmune diseases in comparison with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods : Samples were collected from 437 patients referred by rheumatologists. FANA (fluorescent antinuclear antibody) test and LIA for the detection of 13 different autoantibodies, including 6 ENAs and dsdna were performed. LIA-positive samples for ENA or dsdna antibodies were further tested with ELISA. Final diagnosis was made by rheumatologists according to the diagnostic criteria. Agreement of results between LIA and ELISA was analyzed in 53 selected patients with systemic autoimmune diseases. Results : The LIA detected antibodies to ENA and dsdna in 118 and 22 patients, respectively, and ELISA detected 70.3% (83/118) and 45.5% (10/22) of LIA positive samples. Especially, 60.2% (71/118) of patients with positive ENA antibody on LIA was diagnosed as systemic autoimmune diseases. Patients having strong FANA titer and homogenous/speckled pattern showed higher prevalence of autoantibodies, but a small proportion of FANA negative patients also showed positive reactivity (LIA 10.8%, ELISA 5.2%). LIA showed a good agreement with ELISA for the anti-ena antibodies ( 80%), and a lower agreement for the anti-dsdna antibody (67.9%). Conclusions : LIA detecting several autoantibodies simultaneously might replace ELISA for anti- ENA antibodies, but not for anti-dsdna antibodies. When LIA is performed considering clinical manifestations and FANA, it could contribute to the diagnosis of systemic autoimmune disease. (Korean J Lab Med 2008;28:353-61) Key Words : Autoimmune disease, Anti-ENA antibody, Anti-dsDNA antibody, Line immunoassay 접 수 : 2008년 2월 18일 접수번호 : KJLM2121 수정본접수 : 2008년 6월 30일 게재승인일 : 2008년 7월 21일 교신저자 : 김지명 우 302-120 대전광역시서구둔산동 1306 을지대학병원진단검사의학과 전화 : 042-611-3477, Fax: 042-611-3464 E-mail: jmkim@eulji.ac.kr 서론전신자가면역질환은핵, 세포질및핵막의특정항원을인지하는자가항체의존재를특징으로하는질환이다. 항핵항체 (anti-nuclear antibodies, ANA) 검사는전신자가면역질환에 353

354 김지명 임춘화 신동혁외 2 인 서자가항체의존재유무를검사하는선별검사로다양한검사법이있으나현재는 HEp-2 세포를이용하는간접면역형광법 (indirect immunofluorescent assay, IFA) 과효소면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 이주로활용되고있다. 그러나, ELISA법은상대적으로양성예측도가낮은단점이있어형광양상을통하여원인항원의추정이가능한 IFA 법의 FANA (fluorescent ANA) 가가장일반적으로이용되고있다 [1, 2]. 자가면역질환에서 FANA 양성이면특정질환을감별하기위해항 dsdna 항체및항추출성핵항원 (extractable nuclear antigen, ENA) 항체검사를추가적으로시행하며이러한검사의순서를따르는것은 HEp-2 세포를이용한 FANA가자가항체검출시비교적높은민감도를나타내므로적합한것으로받아들여져왔다 [3]. 그러나최근 FANA가일부핵항원, 특히, SSA/ Ro과 SSB/La에대한항체에대해위음성을나타내는경우도있으며 FANA 음성의경우에도항 ENA 항체가추가검사상증명됨이보고되기도하면서 [4, 5] 항 ENA 항체의검출에있어 FANA 검사의제한점이알려졌다. 이는 FANA의추가검사로한정되던항 ENA 항체검사의적용이보다확대되어야함을암시한것이나 [4] 항 ENA 항체검사의확대적용은방법적, 비용적측면에서제한점이있어왔다. 현재가장일반적인항 ENA 항체검사법은면역확산법, 역류면역전기영동, ELISA법이있는데면역확산법과역류면역전기영동은재연성이우수하고저렴하나소요시간이길고민감도가낮으며해석시경험을요하는단점이있어상대적으로민감도가높고소요시간이짧으며정량이가능한 ELISA법이도입되는추세이다 [6, 7]. 그러나, ELISA법의항-ENA 항체검사는각각의항체에대한동시검사가어렵고증상이유사한류마티스성질환의특성상임상증상을바탕으로하는임상의의적절한검사선택은제한적이므로검사비용의상승을초래할가능성이있다. 최근 ELISA법의이러한단점을보완하여여러항체를동시에검사하는 line immunoassay (LIA) 를이용한항 ENA 항체검사가개발되었는데이전보고에의하면 LIA법은민감도및특이도면에서기존의검사법인 ELISA법에뒤지지않으며비용효율적이었다 [7]. 그러나, 현재국내에는 LIA법을이용한항 ENA 항체검사의임상적인적용의유용성을평가한연구는없는실정이다. 이에저자들은류마티스성질환이의심되는환자군을대상으로진단시기존의선별검사인 FANA 검사외에 LIA법을이용한항 ENA 항체검사를추가로시행하여진단상의유용성을평가하고현재항 ENA 항체검사로널리쓰이는 ELISA법과 LIA법간의일치도를비교하여 LIA법이 ELISA법을대치할수있는지보았다. 대상및방법 1. 대상 2005년 4월부터 2006년 12 월까지류마티스내과를최초로방문한환자중 FANA 검사상형광양상이중심절양상인경우는배제하고 437명을대상군으로하였다. 대상군중남자는 75명, 여자는 362명이었으며평균연령은 43.8±13.1세였다. 대상군의임상진단은최초내원후최소 1년의추적관찰기간을두어증상및검사소견을바탕으로임상의에의해결정되었다. 전신자가면역질환은전신홍반루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE), 쇼그렌증후군, 피부경화증또는전신피부경화증, 중첩증후군, 다발근육염으로정의하였다. 2. IFA법을이용한 ANA 검사최초내원시전신자가면역질환의진단을위하여선별검사로 FANA 검사를실시하였다. 환자의혈청을 phosphate buffered saline (PBS) 으로 40배희석한후 HEp-2 세포가고정된슬라이드 (Bio-Rad Laboratories, Redmond, WA, USA) 에도포하고실온암소에서 20분간반응시켰다. 슬라이드는 PBS로세척후 FITC-labeled conjugate를도포하여실온암소에서 20분간반응시키고 PBS로다시세척후 coverslip으로덮어형광현미경하에서형광강도를관찰하였다. FANA 검사상양성인경우희석배수를추가하여정량검사를시행하였으며항체역가가 1:80 이상인경우양성, 1:40의경우는약양성, 1:40 미만의경우음성으로판정하였다. 모든대상군에대해최초검사후 6개월내 FANA 검사를추가로시행하여항체역가의변화가나타나는지추적관찰하였다. 3. LIA법의항 ENA 항체및항 dsdna 항체검사항 ENA 및항 dsdna 항체검사는최초내원시모든대상군에대해 LIA법 (Euroimmun, Oberlausitz, Germany) 으로시행하였다. LIA법을이용한항체검사는 6종의 ENA (RNP, Sm, SSA, SSB, Scl-70, Jo-1) 가분석가능하였고그외중심절, dsdna, histone, PM-Scl, PCNA, ribosomal P 단백, 미토콘드리아 M2 항원에대한항체분석도가능하였다. 그러나, 본연구에서는추가적인 ELISA법추가검사가가능한 6종의 ENA 및 dsdna에대한항체만을분석하였다. 검사과정은우선검사용스트립을 incubation tray의각채널안에넣은후완충액

Detection of Antibodies to ENA and dsdna Using LIA 355 을분주하고 shaker에올려놓고 5분간전처리하였다. 전처리후환자의혈청을분주하고 shaker에둔상태로 30분, 실온에서반응시키고 5분씩 3차례세척후 alkaline phosphatase labeled anti-human IgG를분주하여 30분, 실온에서반응시켰다. 5분씩 3차례세척후기질액를가하여갈색의대조선이나타나도록 10분, 실온에서반응시켰다. 10분후증류수를가하여반응을중지시키고 3차례세척한후결과는스캔닝프로그램을활용하여 0에서 4+ 까지반응강도로표시하였다. 제조사기준상양성의판정기준은 1+ 이상이었다. 4. ELISA법의항 ENA 항체및항 dsdna 항체검사 LIA법에서양성으로판정된해당항체에대해 ELISA법 (Bio- Rad Laboratories) 을이용한항체검사를추가로시행하여양성여부를재확인하였다. 희석액을이용하여 40배 ( 단, 항 dsdna 항체검사는 100배 ) 희석한혈청을해당되는자가항원이부착되어있는 well에분주한후실온에서 30분간반응시켰다. 각 well의혈청을제거한후세척액을가하여 well을 5차례세척하였으며마지막세척후에는물기가 well에남지않도록하였다. 세척후 conjugate (Goat anti-human IgG horseradish peroxidase) 를가하여실온에서 30분간반응시킨후 conjugate를제거하고 well을 5차례세척하였다. 기질액을가하여실온에서 30분간반응시켜 well의색상이변화하면반응정지액을가하였다. 450 nm에서 ELISA reader기로 well의 OD 값을측정한후 calibrator의 OD값과비교하여항체가를 Enzyme Units (EU) 혹은 International Units (IU) 로정량화하였다. ELISA법상양성을판정하는경계치는항 ENA 항체는 25 EU, 항 dsdna 항체는 30 IU이고보고가능범위는 0-200이었다. 5. 항 ENA 항체및항 dsdna 항체의 LIA법과 ELISA법의비교대상군중최종적으로전신자가면역질환으로진단된환자 53명 (20명의 SLE, 20명의쇼그렌증후군, 9명의피부경화증또는전신성경화증, 3명의중첩증후군, 1명의다발근육염 ) 을선택하여 7종의항체 (6종의항 ENA 항체와항 dsdna 항체 ) 에대하여 LIA법과 ELISA법을이용한검사를시행하여 ELISA법에대한 LIA법의각항체별일치도, 불일치양성률및불일치음성률을평가하였다. 각항체별일치도는두방법에서동일한결과를나타낸환자수의 % 로규정하였으며불일치양성률은 ELISA 음성중 LIA 양성인환자수의 % 로, 불일치음성률은 ELISA 양성중 LIA 음성인환자수의 % 로각각정의하였다. 결과 1. FANA 역가에따른항 ENA 항체의양성률분석 437명의 FANA 역가의분포는 268명 (61.3%) 은음성 (<1:40), 39명 (8.9%) 은약양성 (1:40), 130명 (29.7%) 은양성 ( 1:80) 이었다. FANA의역가에따른각분류군에서 1단계 LIA법과 2단계 437 FANA <1:40 N=268 (6) FANA 1:40 N=39 (5) FANA 1:80 N=31 (6) FANA 1:160 N=99 (60) LIA - + - + - + - + 239 (0) 27 (1) 22 (2) 31 (3) 29 (6) 12 (4) 9 (4) 68 (57) ELISA - + - + - + - + 15 (0) 8 (0) 4 (0) 8 (0) 14 (6) 4 (4) 5 (4) 60 (57) Fig. 1. Results of fluorescent ANA (FANA), line immunoassay (LIA) and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for anti-extractable nuclear antigen (ENA) antibodies in 437 patients. Numbers in parentheses represent the number of patients with systemic autoimmune diseases.

356 김지명 임춘화 신동혁외 2 인 ELISA법에의한항 ENA 항체의결과는 Fig. 1과같았다. FANA 역가가높을수록 1단계 LIA법에서관찰된자가항체가 2단계 ELISA법을통해양성으로최종확인되는빈도가보다높음을알수있었다. 임상진단에서 FANA 음성군 268명중 6명, FANA 양성군 169명중 71 명이전신자가면역질환으로진단되어 FANA의민감도는 92.2%, 특이도는 72.8% 이었으며양성예측도는 42.0%, 음성예측도는 97.8% 이었다. 또한, 항 ENA 항체 LIA법의경우항 ENA 항체 LIA 음성군 319명중 6명, 양성군 118명중 71명이전신자가면역질환으로진단되어항 ENA 항체 LIA 검사법의민감도는 92.2%, 특이도는 86.9%, 양성예측도는 60.2%, 음성예측도는 98.1% 이었다. 1) ANA 음성군내원시 ANA 음성을나타낸 268명중 239명 (89.2%) 은 LIA 법의항 ENA 항체검사상음성이었다. 이들은최초내원후추 적관찰기간내시행된 FANA 검사에서도두단계이상의의미있는역가의상승은관찰되지않았으며임상소견상전신자가면역질환의진단기준에부합되지않았다. 나머지 29명 (10.8%) 은 LIA법상항 ENA 항체양성반응을나타냈으며 24명은한종류의항체에, 5명은두종류의항체에양성반응을보여 34예의양성반응이관찰되었다. 34예의양성반응중 14예는 1+, 20예는 2+ 이상의반응강도를나타냈다. ELISA법에의한항체검사에서 14예의 LIA1+ 양성중에서는 1 예의 SSA(7.1%) 만양성을나타낸반면 20예의 LIA2+ 이상양성중에서는 16예 (80.0%) 가양성을보여 LIA법에서의반응강도가 2+ 이상인경우 ELISA법에서일치된양성반응을나타내는비율이높았다. ELISA법으로 14명 (5.2%) 에서 17 예의항체가최종확인되었는데항 SSA 항체 (76.5%, 13/17) 가가장많았고항 SSB 항체 (17.6%, 3/17) 와항 Jo 1 항체 (5.9%, 1/17) 가일부를차지하였으며 6명이전신자가면역질환으로진단되었다 (Table 1). Table 1. Clinical findings and test results of 29 patients with negative FANA and positive ENA antibodies by LIA No. Case LIA (grade) ELISA Clinical diagnosis 1 SSA(3+) Negative Behcet s disease 2 SSA(3+) Negative Inflammatory arthralgia 3 SSA(3+) Positive Sjogren syndrome 4 SSA(3+) Positive Sjogren syndrome 5 SSA(3+) Positive Sjogren syndrome 6 SSA(3+) Positive Raynaud s syndrome 7 SSA(3+)/SSB(3+) Positive/Positive Sjogren syndrome 8 SSA(3+)/SSB(3+) Positive/Positive SLE 9 SSA(3+)/SSB(3+) Positive/Positive SLE 10 SSA(3+)/SSB(1+) Positive/Negative Raynaud s syndrome 11 SSA(3+)/SSB(1+) Positive/Negative Raynaud s syndrome 12 SSA(2+) Negative Rheumatoid arthritis 13 SSA(2+) Positive Rheumatoid arthritis 14 SSA(2+) Positive Arthritis 15 SSA(2+) Positive Adult onset Still s disease 16 SSA(1+) Negative Fibromyalgia 17 SSA(1+) Negative Fibromyalgia 18 SSA(1+) Negative Inflammatory arthralgia 19 SSA(1+) Negative Synovitis 20 SSA(1+) Positive Behcet s disease 21 SSA(1+) Negative Stomatitis 22 SSA(1+) Negative Stomatitis 23 SSA(1+) Negative Synovitis 24 SSB(1+) Negative Fibromyalgia 25 RNP(2+) Negative Osteoarthritis 26 RNP(1+) Negative Synovitis 27 Scl-70(1+) Negative Osteoarthritis 28 Jo-1(3+) Positive Polymyositis 29 Jo-1(1+) Negative Fibromyalgia Abbreviations: FANA, fluorescent antinuclear antibodies; ENA, extractable nuclear antigen; LIA, line immunoassay; ELISA, enzyme linked immunosorbent assay; SLE, systemic lupus erythematosus.

Detection of Antibodies to ENA and dsdna Using LIA 357 2) ANA 약양성군 39명의 ANA 약양성군에서는 12명 (30.8%) 이 LIA법상항 ENA 항체양성반응을나타냈으며 9명은한종류의항체에, 3 명은두종류의항체에양성반응을보여 15예의양성반응이관찰되었다. 15예의양성반응중 LIA1+ 는 9예, LIA2+ 이상은 6예이었다. ELISA법상 6예의 LIA2+ 이상양성중 5예에서만양성을보였고가장빈도가높은것은항 SSA 항체 (80.0%, 4/5) 이었다. ELISA법에서도항체가확인된 4명 (10.3%) 은모두전신자가면역질환으로진단되었고 FANA 검사상모두 speckled 혹은 homogenous 양상을띄었다. LIA법상음성을보인 27명중 1명이전신자가면역질환이었으며 LIA법양성이나 ELISA법에서음성을보인 8명은전신자가면역질환이아니었다. 3) ANA 양성군 31명의 ANA 1:80 양성군에서는 9명 (29.0%) 이 LIA법상항 ENA 항체양성반응을나타냈으며 6명은한종류의항체에, 3 명은두종류의항체에양성반응을보여 12예의양성반응이관찰되었다. 12예의양성반응중 LIA1+ 는 3예, LIA2+ 이상은 9 예이었다. ELISA법에서는 LIA2+ 이상양성중 6예에서만양성을보였다. ELISA법에서도항체가확인된 5명 (16.1%) 중 4명은전신자가면역질환이었으며 FANA 검사상모두 speckled 양상을보였다. LIA법상음성을나타낸 22명중 2명이전신자 가면역질환이었으며 LIA법양성이나 ELISA법에서음성을보인 4명은전신자가면역질환이아니었다. 99명의 ANA 1:160 이상의양성군에서는 68명 (68.7%) 이 LIA 법상항 ENA 항체양성반응을나타냈으며 19명은한종류의항체에, 49명은두종류이상의항체에양성반응을보여 123예의양성반응이관찰되었다. 123예의양성반응중 LIA1+ 는 16 예, LIA2+ 이상은 107예였다. ELISA상 60 명 (60.6%) 에서 94예의항체가확인되었는데모두 LIA2+ 이상의양성이었다. 항체가확인된 60명의 FANA 양상은 speckled 양상 28명, homogenous 양상 23명, 기타형광양상 9명이었으며 57명이전신자가면역질환으로진단되었다. ELISA법에서항체음성을보인 8 명중임상적으로전신자가면역질환군에포함되는경우는없었다. ANA 1:160 이상의양성이며 LIA법의항 ENA 항체검사상음성을나타낸환자는 31명이었으며 3명이전신자가면역질환군이었다. FANA 역가별분포는 1:160 역가군이 27명으로가장많았으며 1:320 역가군이 3명, 1:640 역가군도 1명이었다. 2. 항 dsdna 항체분석 LIA법상항 dsdna 항체는대상군 437명중 22명 (5.0%) 에서만관찰되었다. FANA 음성군 7명은 LIA법상의반응강도와 Table 2. Clinical findings and ELISA results of 22 patients with positive dsdna antibody by LIA No. Case FANA titer LIA (grade) ELISA Clinical diagnosis 1 Negative dsdna(3+) Negative Reactive arthritis 2 Negative dsdna(2+) Negative Behcet s disease 3 Negative dsdna(2+) Negative Fibromyalgia 4 Negative dsdna(2+) Negative Behcet s disease 5 Negative dsdna(1+) Negative Osteoarthritis 6 Negative dsdna(1+) Negative Osteoarthritis 7 Negative dsdna(1+) Negative Gout 8 Homogenous 1:40 dsdna(1+) Negative Inflammatory polyarthropathy 9 Homogenous 1:40 dsdna(1+) Positive SLE 10 Speckled 1:80 dsdna(2+) Positive SLE 11 Homogenous 1:80 dsdna(1+) Negative Synovitis 12 Speckled 1:160 dsdna(2+) Negative Rheumatoid arthritis 13 Speckled 1:160 dsdna(1+) Negative Rheumatoid arthritis 14 Homogenous 1:160 dsdna(1+) Negative Stomatitis 15 Homogenous 1:640 dsdna(2+) Positive Overlap syndrome 16 Homogenous 1:640 dsdna(1+) Positive SLE 17 Homogenous 1:1,280 dsdna(2+) Positive SLE 18 Speckled 1:1,280 dsdna(1+) Positive SLE 19 Speckled >1:1,280 dsdna(2+) Positive SLE 20 Homogenous >1:1,280 dsdna(2+) Positive Overlap syndrome 21 Homogenous >1:1,280 dsdna(1+) Positive SLE 22 Homogenous >1:1,280 dsdna(1+) Positive SLE Abbreviations: See Table 1.

358 김지명 임춘화 신동혁외 2 인 Table 3. Agreement and discordances of LIA compared with ELISA in 53 patients with systemic autoimmune diseases Group (Cutoff of LIA=grade 1) No. of patients SSA SSB RNP Sm Scl-70 Jo-1 dsdna ELISA+/LIA+ 23 14 10 4 3 1 12 ELISA+/LIA- 0 0 1 0 0 0 8 ELISA-/LIA+ 11 9 10 9 8 5 9 ELISA-/LIA- 19 30 32 40 42 47 24 Agreement (%) 79.2 83.0 79.2 83.0 84.9 90.6 67.9 PD (%) 36.7 23.1 23.8 18.4 16.0 9.6 27.3 ND (%) 0 0 9.1 0 0 0 40.0 Group (Cutoff of LIA=grade 2) No. of patients SSA SSB RNP Sm Scl-70 Jo-1 dsdna ELISA+/LIA+ 22 14 10 4 3 1 9 ELISA+/LIA- 1 0 1 0 0 0 10 ELISA-/LIA+ 5 4 5 2 2 1 2 ELISA-/LIA- 25 35 37 47 48 51 31 Agreement (%) 88.7 92.5 88.7 96.2 96.2 98.1 75.5 PD (%) 16.7 10.3 11.9 4.1 4.0 1.9 6.1 ND (%) 4.3 0 9.1 0 0 0 52.6 Agreement is defined as the concordance of the LIA with the ELISA. Positive discordance (PD) is calculated as the number of ELISA-/LIA+, divided by the total number of ELISA-. Negative discordance (ND) is calculated as the number of ELISA+/LIA-, divided by the total number ELISA+. Abbreviations: ELISA, enzyme linked immunosorbent assay; LIA, line immunoassay; ND, negative discordance; PD, positive discordance. 무관하게 ELISA법에서모두음성이었으며임상소견상 SLE는배제되었다. FANA 약양성군 2명에서 LIA1+ 가관찰되었으며 SLE 1명만 ELISA법상양성반응을나타냈다. FANA 1:80 양성군 2명이 LIA법상각각 1+ 와 2+ 의양성반응을나타냈으며, 이중 2+ 를보인경우에만 ELISA법상양성을보였고임상진단은 SLE이었다. FANA 1:160 이상양성군에서는 6명은 1+, 5명은 2+ 를나타내었는데, 이중 4명의 1+, 4명의 2+ 만이 ELISA법상양성을보였고 6명은 SLE, 2명은중첩증후군으로최종진단되었다 (Table 2). 3. 항 ENA 항체및항 dsdna 항체의 ELISA법에대한 LIA법의일치도전신자가면역질환군 53명의 6종류의항 ENA 항체의 ELISA 법에대한 LIA법의일치도는제조사의양성기준을따를경우대부분 80% 이상이었으며 LIA 음성은대부분 ELISA에서도음성을나타내는반면 LIA 양성은 ELISA 음성으로판명되는불일치양성률이높았다. 양성기준을 2+ 이상으로조정할경우보다일치도가상승하며불일치양성률도감소하는소견을보였다. 그러나항 dsdna 항체의두방법간일치도는 67.9% 로다른항 ENA 항체에비해낮았으며불일치양성률뿐아니라 ELISA 양성임에도 LIA상음성을나타내는불일치음성률의빈도도높 았다 (Table 3). 고찰항 ENA 항체의분석은다양한전신자가면역질환의감별및예후에중요한작용을한다. 예를들어항 Sm 항체는 SLE, 항 SSA 및 SSB 항체는쇼그렌증후군의진단에유용하며항 Scl- 70 항체는전신피부경화증의불량한예후와관련되어있다 [8, 9]. 이러한항 ENA 항체동정의진단적및예후적가치는임상의에의한검사의요구도를증대시켜왔다. 항 ENA 항체는초기에는면역확산법으로주로검사되었으나 80 년대초반재조합기술에의한 ELISA법의개발로기존의검사법이 ELISA법으로많이대치되었다. 그리고최근에는단독항체검사만이가능한 ELISA법을보완하여서로다른항 ENA 항체들의동시검출이가능한 LIA법이나유세포분석법등의 multiplex 방법들이개발되었다 [10, 11]. 특히, LIA법은임상적적용이용이하여수년간여러연구자들에의해유용성이검토되어왔다 [7, 10] 항 ENA 항체의검출에있어 LIA법은기존의방법들과비교해우수한민감도와특이도를나타내는것으로보고되어왔으며특히민감도가가장우수하다고알려진 ELISA법과의일치도는각각의항체에따라 70-90% 이었다 [7, 10, 12]. 본연구에서도

Detection of Antibodies to ENA and dsdna Using LIA 359 53명의전신자가면역질환군에대한항 ENA 항체의 LIA법과 ELISA법간의일치도는대부분 80% 이상으로이전보고와유사하였다. 그러나, 항 dsdna 항체의 LIA법과 ELISA법간의일치도는항 ENA 항체와비교하여상대적으로낮았다. 그리고, ELISA상의양성을 LIA에서검출하지못하는불일치음성의빈도도항 ENA 항체는낮았으나항 dsdna 항체는높았다. 또한, 1차 LIA법과 2차 ELISA법을통한자가항체의확인결과에서도항 ENA 항체의경우 LIA 양성이 ELISA 양성으로확인되는비율은 70.3% 로높았으나항 dsdna 항체는 45.5% 로낮았다. 이는 LIA법의항 ENA 항체검사는 ELISA법을대치할수있으나항 dsdna 항체의 LIA법은적합하지않음을나타내는것이다. 한번의검사로동시에주요자가항체의유무를검토할수있는 LIA법의항 ENA 항체검사는전신자가면역질환의진단에있어 FANA 검사의비특이적양성반응, 일부항체에대한위음성과같은제한점을보완하는데도움이되었으며임상증상및 FANA 결과와함께판단될경우비교적초기에정확한진단이가능하였다. FANA에서 1:40 이상의양성이나 LIA법에서항 ENA 항체음성이었던 80명중 6명의 SLE를제외한 74명은최종적으로전신자가면역질환이아니었다. 이는 FANA 양성이나항 ENA 항체음성인경우일부 SLE의가능성도있으나많은경우 FANA의비특이적양성반응임을제시한것이며진단시유용할것으로사료되었다. 또한, 6명의 SLE는 ELISA의항 dsdna 항체에서는모두양성을나타낸반면 LIA에서는 3명만이양성을나타내어항 dsdna 항체 LIA법의한계를재확인할수있었다. FANA 음성이나항 ENA 항체가확인되어 FANA 위음성으로추측되는경우도빈도는낮으나관찰되었다. 이전에도 FANA 음성에서항 ENA 항체의빈도는 1-4% 로다양하게보고되었는데 [3, 4, 13] 본연구에서도 FANA 음성의 5.2% 에서항 ENA 항체가확인되었으며항 SSA 항체가가장흔하였다. 이전보고들과비교하여양성빈도가상대적으로높았는데이는대상군의선정상류마티스성질환이의심되는환자군이다수포함되었기때문으로추측하였으며항 SSA 항체는 IFA의기질세포의개선에도불구하고 FANA법으로발견되지않을가능성이높은항체중하나임을알수있었다. FANA 음성이지만항 ENA 항체가확인된환자중일부는전신자가면역질환으로진단되었으나임상진단이분명하지않은경우도있었는데 Arbuckle 등에의하면임상증상이분명해지기수년전부터항 ENA 항체가발현할수있다고하였으므로 [14] 이러한환자들에대해서는지속적인추적관찰이필요하리라사료되었다. 그러나, 대부분의 FANA 음성은항 ENA 항체검사상음성을나타냈으며이들은추적관 찰에서전신자가면역질환이배제되었다. 항 ENA 항체검사는 FANA 양성에서시행되는것이유효하나임상증상이의심되는경우에는 FANA 음성이더라도고려되어야함을알았으며이는 Hoffman 등의주장과일치하였다 [4]. 항 ENA 항체의존재는 SLE의진단시 ANA 양성과함께질환을강력히시사하는소견이되며 [15] SLE 외의다른자가면역질환과도밀접히연관되어있다. 본연구에서도 LIA상항 ENA 항체양성을나타낸 118명중 71 명 (60.2%) 이최종적으로전신자가면역질환으로진단되어항 ENA 항체와질환과의높은연관성을확인할수있었다. 또한, 본연구에서 LIA법의항 ENA 항체검사는전신자가면역질환의진단시 FANA와비교하여민감도는동일하나특이도및양성예측도가더우수하였다. 이는시간, 비용및방법의간편성등기존의제한점을개선한 [16] 항 ENA 항체의 LIA 검사법이전신자가면역질환의진단및감별진단에매우유용하게사용될수있음을나타낸것이다. 그러나, 항 ENA 항체 LIA법은 FANA보다고가의검사비용이소요되며항 ENA 항체를동반하지않는 SLE의진단에는제한점이있으므로선별검사보다는 FANA의추가검사로적절하리라사료되었다. 항 ENA 항체검사는추가적인비용이소요되므로비용적인측면을고려한효율적이용이필요한데특히, FANA의형광양상과역가는중요한역할을하였다. 이전연구에의하면형광양상은 homogenous 및 speckled 양상, 역가는 1:80을초과하는경우항 ENA 항체의양성률이높은것으로보고되었다 [13]. 본연구에서도 LIA법과 ELISA법을통해항 ENA 항체가확인된빈도는 FANA 1:80 이하의환자군 (6.8%, 23/338) 보다 FANA 1:160 이상의환자군 (60.6%, 60/99) 에서의미있게높았으며 FANA 1:40 이상의양성군중항 ENA 항체가확인된 69명중 homogenous 및 speckled 형광양상의비율은 86.9% (60/69) 로다른형광양상보다월등히많았다. 그러므로 FANA 검사상 1:160 이상역가를보이며 homogenous 및 speckled 양상을나타내는경우는전신자가면역질환의감별을위하여반드시추가적인항 ENA 항체검사가필요하고 FANA 역가는낮으나 homogenous 및 speckled 양상인경우는임상증상을고려하여선택적으로항 ENA 항체검사를고려해야한다. 그러나, FANA 역가가낮고 homogenous 및 speckled 양상외의형광양상을나타내는경우는상대적으로항-ENA 항체검사의효용성이낮으므로추가적인검사는불필요하다고여겨졌다. 결론적으로 LIA법의항 ENA 항체검사는기존의 ELISA법과의일치도가우수하므로이를대치하는검사로유용하였으나항 dsdna 항체검사는 ELISA법과비교시일치도가비교적낮

360 김지명 임춘화 신동혁외 2 인 아유용하지않았다. 또한, LIA법의항 ENA 항체검사는임상증상및 FANA 소견을고려하여시행된다면전신자가면역질환의진단및감별을위한자가항체의증명에도움이될것으로사료되었다. 요약배경 : 항 extractable nuclear antigen (ENA) 및항 dsdna 항체검사는전신자가면역질환의진단및예후예측에필요하다. 최근여러새로운검사법들이소개되었는데이중 line immunoassay (LIA) 법은여러항체를동시에검사하는장점을가지고있다. 본연구에서저자들은 LIA법이자가면역질환의진단시유용한지평가하고효소면역법과비교하고자하였다. 방법 : 류마티스내과를방문한 437명을대상으로간접면역형광법의항핵항체검사 (FANA) 와 LIA법을이용한 13종의자가항체 ( 항 ENA 항체 6종및항 dsdna 항체포함 ) 검사를실시하였다. LIA법상항 ENA 또는 dsdna 항체양성을나타낸경우에는효소면역법으로추가검사를시행하였다. 최종진단은진단기준에의거하여임상의에의해이루어졌다. LIA법과효소면역법간의일치도는 437명중선택된전신자가면역질환군 53 명에서분석되었다. 결과 : 항 ENA 및 dsdna 항체는 LIA법상각각 118명, 22 명에서관찰되었으며이중각각 83 명 (70.3%), 10명 (45.5%) 이효소면역법에서도양성을보였다. 특히, LIA법상항 ENA 항체양성인 118명중 60.2% 는전신자가면역질환으로진단되었다. 자가항체는강한 FANA 역가와 homogenous/speckled 양상을보이는환자군에서보다높은빈도로관찰되었으나 FANA 음성군에서도낮은빈도 (LIA법 10.8%, 효소면역법 5.2%) 로관찰되었다. 항 ENA 항체에대해 LIA법은효소면역법과 80% 이상의일치도를보였으나항 dsdna 항체는비교적낮은일치도 (67.9%) 를나타냈다. 결론 : 여러자가항체들을동시에검출할수있도록고안된 LIA법은항 ENA 항체의경우효소면역법을대체할수있는검사이나항 dsdna 항체대체에는부적합하였다. LIA법은임상증상과 FANA 소견을고려하여시행될때전신자가면역질환의진단에기여하리라사료된다. 참고문헌 1. Reisner BS, DiBlasi J, Goel N. Comparison of an enzyme immunoassay to an indirect fluorescent immunoassay for the detection of antinuclear antibodies. Am J Clin Pathol 1999;111:503-6. 2. Fenger M, Wiik A, Hoier-Madsen M, Lykkegaard JJ, Rozenfeld T, Hansen MS, et al. Detection of antinuclear antibodies by solid-phase immunoassays and immunofluorescence analysis. Clin Chem 2004; 50:2141-7. 3. Homburger HA. Cascade testing for autoantibodies in connective tissue disease. Mayo Clin Proc 1995;70:183-4. 4. Hoffman IE, Peene I, Veys EM, De Keyser F. Detection of specific antinuclear reactivities in patients with negative anti-nuclear antibody immunofluorescence screening tests. Clin Chem 2002;48: 2171-6. 5. Bossuyt X and Luyckx A. Antibodies to extractable nuclear antigens in antinuclear antibody-negative samples. Clin Chem 2005;51:2426-7. 6. Delpech A, Gilbert D, Daliphard S, Le Loet X, Godin M, Tron F. Antibodies to Sm, RNP and SSB detected by solid-phase ELISAs using recombinant antigens: a comparison study with counter immunoelectrophoresis and immunoblotting. J Clin Lab Anal 1993;7:197-202. 7. Lopez-Longo FJ, Rodriguez-Mahou M, Escalona-Monge M, Gonzalez CM, Monteagudo I, Carreno-Perez L. Simultaneous identification of various antinuclear antibodies using an automated multiparameter line immunoassay system. Lupus 2003;12:623-9. 8. Vitali C, Bombardieri S, Jonsson R, Moutsopoulos HM, Alexander EL, Carsons SE, et al. Classification criteria for Sjogren s syndrome: a revised version of the European criteria proposed by the American-European Consensus Group. Ann Rheum Dis 2002;61:554-8. 9. Hu PQ, Fertig N, Medsger TA Jr, Wright TM. Correlation of serum anti-dna topoisomerase I antibody levels with disease severity and activity in systemic sclerosis. Arthritis Rheum 2003;48:1363-73. 10. Damoiseaux J, Boesten K, Giesen J, Austen J, Tervaert JW. Evaluation of a novel line-blot immunoassay for the detection of antibodies to extractable nuclear antigens. Ann N Y Acad Sci 2005;1050: 340-7. 11. Rouquette AM, Desgruelles C, Laroche P. Evaluation of the new multiplexed immunoassay, FIDIS, for simultaneous quantitative determination of antinuclear antibodies and comparison with conventional methods. Am J Clin Pathol 2003;120:676-81. 12. Villalta D, Bizzaro N, Tonutti E, Visentin D, Manoni F, Piazza A, et al. Detection of anti-ena autoantibodies in patients with systemic connective tissue disease. Analytical variability and diagnostic sensitivity of 4 methods. Recenti Prog Med 1999;90:579-84.

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