ISSN 0377-9556 (PRINT) ISSN 2383-9457 (ONLINE) 약학회지제 61 권제 3 호 195~202 (2017) Yakhak Hoeji Vol. 61, No. 3 DOI 10.17480/psk.2017.61.3.195 종설 Short Report 고지방식이마우스에서콩잎추출물의지방간억제효과 김소라 제지현 정준연 김현정 * 송영훈 ** 박기훈 ** 강상수 *** 박상원 # 경상대학교의과대학약리학교실, * 경상대학교의과대학경상대학교병원내과학교실 ** 경상대학교농업생명과학대학환경생명화학과, *** 경상대학교의과대학해부학교실 (Received May 30, 2017; Revised June 14, 2017; Accepted June 23, 2017) Effect of Soybean (glycine max) Leaf Extract against the Development of Non-alcoholic Fatty Liver in High Fat Diet-fed Mice So Ra Kim, Jihyun Je, Jun Yeon Jeong, Hyun-Jung Kim*, Yeong Hun Song**, Ki Hun Park**, Sang Soo Kang***, and Sang Won Park # Department of Pharmacology, Institute of Health Sciences, Gyeongsang National University School of Medicine, Jinju 52727, Republic of Korea *Department of Internal Medicine, Gyeongsang National University School of Medicine and Gyeongsang National University Hospital, Jinju 52727, Republic of Korea **Division of Applied Life Science, Gyeongsang National University, Jinju 52727, Republic of Korea ***Department of Anatomy, Institute of Health Sciences, Gyeongsang National University School of Medicine, Jinju 52727, Republic of Korea Abstract This study was designed to investigate the effect of soybean leaf extract on the development of hepatic steatosis in high fat diet-fed mice. Soybean plants were treated with ethephon to enhance the production of isoflavones in the leaves. The mice were fed with normal chow diet(nd), high fat diet(hfd) or HFD+Soybean leaf extract for 9 weeks. HFD feeding significantly increased the body weight gain and visceral and subcutaneous adipose tissue weights compared to ND group in the mice, but these increases were attenuated by Soybean leaf treatment. Soybean leaf also attenuated the increases in hepatic lipid droplet and hepatocellular triglyceride level at 64 days of HFD feeding. Finally, soybean leaf markedly increased the phosphorylation of AMPK and ACC and their protein expression in the liver at 64 days of HFD feeding, while inhibited the increase in fatty acid synthase protein expression. Our results indicate that soybean leaf extract has beneficial effects against hepatic steatosis in HFD-fed mice. Keywords High Fat diet, Isoflavone, Non-alcoholic Fatty Liver, Phytoestrogen, Soybean Leaf 지방간 (fatty liver) 은간세포의세포질내에 triglyceride(tg), cholesterol 및 lipid droplet 등의비정상적축적으로일어나며, 전세계적으로식생활이풍요해지고고지방식을섭취할기회가 # Corresponding Author Sang Won Park Department of Pharmacology, Institute of Health Sciences Gyeongsang National University School of Medicine Jinju 52727, Republic of Korea Tel.: 055-772-8073 Fax.: 055-772-8079 E-mail: parksw@gnu.ac.kr 김소라, 제지현, 정준연은공동 1 저자로서본논문에동일하게기여하였음. 많아지며성인병이증가함에따라지방간의발생빈도도급격히증가하고있다. 지방간의유병률은서구의여러국가뿐만아니라국내에서도최근지속적으로증가하고있으며, 이는성인과소아비만의증가와관련이있고, 국가마다차이가있지만선진국가에서전체인구의약 20~30% 로보고하고있다. 1) 대부분의지방간은특별한임상증상이없으며일부의경우가벼운피로감이나우상복부의불쾌감이있지만, 가역적변화로서원인을제거하면다시정상간으로비교적쉽게회복되므로임상에서는지방간자체를심각하게여기지않아왔다. 그러나비알코올성지방간 (nonalcoholic fatty liver) 은단순지방증 (simple steatosis) 에서간세포괴사와염증을동반하는비알코올성지방 195
196 김소라 제지현 정준연 김현정 송영훈 박기훈 강상수 박상원 간염 (nonalcoholic steatohepatitis), 섬유화에의한간경변증 (cirrhosis) 더나아가간암 (hepatic cancer) 으로이어지는일련의비알코올성지방간질환군에포함되어있다. 2) 따라서지방간을예방하고개선시킬수있는새로운물질개발의필요성이지속적으로강조되고있다. 식물은외부환경에적응하고생존하기위해다양한이차대사체을지속적으로생성할수있으며, 이러한대사체는식물을섭취하는인간의건강에도움이될수있다. 3) 식물에서에틸렌 (ethylene) 호르몬은다양한생리활성을나타내며, 식물의성장을조절하는물질이다. 에틸렌호르몬은식물대사체합성에관여하는다양한효소와이에대한전사인자의활성화를이끌수있다. 4) 본연구팀은선행연구에서에틸렌을처치할경우콩잎에서 isoflavone 함량이급격히증가는결과를확인하였다. Daidzin, genistein, malonyldaidzin 및 malonylgenistein의함량이모두증가하여총이소플라본함량은에틸렌처치에의해 0.2 mg/g 미만에서 24시간만에 7 mg/g 이상으로증가하였으며 120시간까지약 15 mg/g 이상으로증가하였다. 또한에틸렌을생성하기위해에테폰 (ethephon) 을처치하였을때도유사한결과를나타내었다. 5) 이소플라본은 17-β-estrogen과유사한구조의 phytoestrogen 물질로서 estrogen receptor에결합하여다양한생리활성을나타낼수있다. 6) 이소플라본은골다공증, 갱년기여성장애, 심혈관질환, 호르몬관련암등 estrogen과관련된질환을개선시킬수있는것으로보고되었다. 7) 따라서, 본연구에서는이소플라본유도체를고농도로함유하도록재배된콩잎의추출물이고지방식이동물모델에서체지방증가및지방간발병에개선효과가있는지알아보고자하였다. 지방식이군 (HFD+Soybean leaf) 등실험군당 8 마리씩으로분리하고 9주간고지방식이또는정상식이로사육하였다. 고지방식이는 60% high fat diet(dyets, Inc) 를식이하였다. 9주간사육하는동안매주 2회씩체중과사료섭취량을측정하였으며, 9주간사육한후 64일째에동물을치사시켜혈액을채취하고간조직및지방조직을채취하여무게를측정하고이후분석에사용하였다. 콩잎추출물의제조및처치콩잎추출물은선행연구의방법에따라수확한콩잎으로부터제조하였다. 5) 즉, 대원콩 종자를사용하여시설재배를통해약 60일동안까투리가맺히기전최대성장시기인 R3시기까지재배를하였다. 에테폰을 250 μg/ml 농도로약액이흐를정도로충분히 24시간간격으로 2회살포하였다. 첫살포후 96시간후에콩잎을수확하여물로간단히세척후식품건조기 (35 o C) 에서건조하였다. 건조시료를분쇄한후시료와정제수를 1:10 비율로 6시간동안 100 o C에서열수추출하였다. 총이소플라본농도약 1mg/mL의콩잎추출물은 5 ml/kg 용량으로 9주의사육기간동안매일 1회경구로투여하였다. 콩잎추출물의용량은식약처에서권장하는이소플라본일일섭취량 (25-28 mg) 을기준으로마우스의체표면적지수 (0.08) 로환산하였다. 조직학적분석 (Hematoxylin & Eosin 염색법 ) 간조직시료를 10% 포르말린에 24시간동안고정시킨후수세 -탈수 -투명 -파라핀침투 -포매의조직처리과정을거쳐 5μm의조직절편슬라이드를제작하고 hematoxylin and eosin (HE) (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO) 로염색한후광학현미경으로관찰하였다. 실험방법시약및재료 Phosphorylated AMP-activated protein kinase(ampk), total AMPK, phosphorylated Acetyl-CoA carboxylase(acc), total ACC, fatty acid synthase(fas) 에대응하는일차항체는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA) 에서구입하였으며, β-tubulin 에대응하는일차항체는 Thermo Fisher Scientific(Rockford, IL) 에서구입하였다. 별도표기되지않은시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO) 에서구입하였다. 고지방식이동물모델동물실험에대한프로토콜은경상대학교동물윤리위원회의승인 ( 승인번호 : GNU-151006-M0054) 을받아수행하였으며, 수컷 C57BL/6종마우스 (7주령) 를코아텍에서구입하고 1주간경상대학교의과대학동물실험실에서순화시켰다. 24마리의동물을각각정상식이군 (ND), 고지방식이군 (HFD) 및콩잎추출물투여고 간조직내중성지방분석간조직내중성지방함량은균질화된간에서 Triglyceride Colorimetric Assay kit(cayman, Ann Arbor, MI) 를사용하여측정하였다. 웨스턴블럿법 (Western blot) 간조직을 protease inhibitor와 phosphatase inhibitor를포함하는 PIRA buffer에서균질화한후원심분리 (12,000 rpm, 4 o C) 하여상층액을취하였다. Bicinchoninic acid(bca) 법으로총단백질을정량한후 sample buffer를넣고 100 o C에서 7분간 denaturation 하여웨스턴블럿시료를준비하였다. 정량된단백질을동일한농도로 10% SDS-PAGE 로전기영동한후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에옮기고 5% bovine serum albumin으로 1시간 blocking하였다. Phosphorylated AMP-activated protein kinase (AMPK), total AMPK, phosphorylated Acetyl-CoA carboxylase (ACC), total ACC, fatty acid synthase(fas) 및 β-actin 단백질에상응하는각각의 1차및 2차항체를순차적으로반응시켰다. 각 J. Pharm. Soc. Korea
콩잎추출물의지방간억제효과 197 각의표적단백질발현정도는 ECL 용액으로반응후 Chemidoc(Bio-rad) 으로분석하였다. 통계분석실험결과는 Mean±SEM으로나타내었으며, Dunnett s t-test 로실험군을비교하고 P 값이 0.05 이하인경우에만통계학적유의성이있는것으로간주하였다. 실험결과 사료섭취량및체중증가에대한콩잎추출물의효과 9주간고지방식이를투여하는동안콩잎추출물에별다른영향을나타내지않았다. 모든실험군은 22 g의무게에서사육을시작하였다. 고지방식이군에서 64일째체중은 43.5±0.7 g으로정상식이군 (28.8±0.3 g) 에비해낮은사료섭취량에도체중이현저히증가하였다. 콩잎추출물투여는고지방식이에의한체중증가를통계적으로유의하지않지만, 억제하는경향을나타내었다 (Fig. 1). 지방조직의무게에대한콩잎추출물의효과 9주간고지방식이또는정상식이투여후마우스를치사시키고내장지방 (visceral adipose tissue), 피하지방 (subcutaneous adipose tissue), 부고환지방 (epididymal adipose tissue) 및갈색지방 (brown adipose tissue) 을분리하여지방조직의무게를측정하였다. 고지방식이군은내장, 피하, 부고환및갈색지방조직의크기와무게가정상식이군에비해유의적으로증가하였으며, 고지방식이에의해증가된내장지방 (1.46±0.09 g) 및피하지방 (3.66±0.18 g) 의무게는콩잎추출물에의해모두통계적으로유의하게억제되었다 ( 내장지방 1.13±0.08 g, P<0.05; 피하지방 3.05±0.18 g, P<0.05) (Fig. 2). Fig. 1 Effect of soybean leaf extract on food intake and weight gain in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf (N=8 for each group). Food intake and body weight were measured twice a week. Data are presented as the mean±sem. *P<0.05 compared to the ND group; # P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group. 간조직무게에대한콩잎추출물의효과 9주간고지방식이또는정상식이투여후마우스를치사시키고간조직의무게를측정하고각각마우스의체중대비간무게를분석하였다. 고지방식이군은정상식이군 (1.21±0.04 g) 에비해유의적으로간조직의무게가증가하였으나 (1.60±0.10 g, P<0.01 vs ND), 이러한증가는콩잎추출물처치에의해유의적으로억제되었다 (1.32±0.06 g, P<0.05 vs HFD+Vehicle). 또한고지방식이군에서콩잎추출물은체중증가를억제하는경향에비해간조직무게의증가를더욱현저히억제하여체중대비간무게비율을통계적으로유의하게감소시켰다 ( 콩잎추출물 3.15± 0.08 vs 고지방식이군 3.66±0.19, P<0.05)(Fig. 3). 간조직내지질축적에대한콩잎추출물의효과 9주간고지방식이또는정상식이를투여한마우스의간조직 을 H&E 염색을통해조직을분석한결과고지방식이군은정상식이군에비해간실질세포내지질 (lipid droplet) 축적이증가하였으며, 콩잎추출물은고지방식이에의한간조직실질세포의지질축적을현저하게억제하였다 (Fig. 4). 또한지방간은간조직의실질세포에과도하게중성지방이축적된것으로정의된다. 따라서 9주간고지방식이또는정상식이를투여한마우스의간조직에서중성지방함량을측정하였다. 고지방식이군에서간조직내중성지방함량은 26.3±0.8 mg/g liver로서정상식이군의중성지방함량인 10.3±0.2 mg/g liver에비해약 2.6배높았다. 그러나, 고지방식이군에서콩잎추출물의투여는간세포내중성지방함량의증가를통계적으로유의하게억제하였다 (22.6±0.5 mg/g liver, P<0.05) (Fig. 4). Vol. 61, No. 3, 2017
198 김소라 제지현 정준연 김현정 송영훈 박기훈 강상수 박상원 Fig. 2 Effect of soybean leaf extract on fat accumulation in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf, and then the adipose tissues were weighed (N=8 for each group). Data are presented as the mean±sem. *P<0.05 compared to the ND group; #P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group. 간 조직 내 지질합성 및 대사 조절단백질 발현에 대한 콩잎추 출물의 효과 소인 FAS의 단백질 발현을 3.9배 증가시켰다. 이는 고지방식이 에 의해 지질대사 및 지질합성이 증가하는 것으로 볼 수 있다. 9주간 고지방식이 또는 정상식이를 투여한 마우스의 간 조직 고지방식이에서 콩잎추출물은 고지방식이에 의한 AMPK의 인산 에서 지질합성및 지질대사 조절단백질의 발현을 분석한 결과 고 화를 더욱 증가시켜 조제용매 투여군에 비해 통계적으로 유의하 지방식이군 투여는 정상식이군은 정상식이군에 비해 지질대사 게(2.8배) 높았다. 콩잎추출물은 또한 지방산 생합성 효소인 FAS 효소인 AMPK의 인산화를 증가시켰으며, 또한 지방산 생합성 효 의 단백질 발현을 정상식이군 수준으로 통계적으로 유의하게 억 J. Pharm. Soc. Korea
콩잎추출물의 지방간 억제 효과 199 Fig. 3 Effect of soybean leaf extract on liver weight in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf, and then body and liver weights were measured (N=8 for each group). Data are presented as the mean±sem. *P<0.05 compared to the ND group; #P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group. Fig. 4 Effect of soybean leaf extract on hepatic lipid droplet and triglyceride accumulation in high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf, and then liver sections were stained and hepatic TG levels were measured (N=6-8 for each group). Data are presented as the mean±sem. *P<0.05 compared to the ND group; #P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group. 제하였다. 또한 고지방식이에서 조제용매 투여군은 ACC의 인산 소의 발현을 억제하는 것을 알 수 있었다(Fig. 5). 화를 정상식이군에 비해 4.4배 증가시켰다. 콩잎추출물은 정상식 이군에 비해 ACC의 인산화를 8.1배 증가시켜 조제용매 투여군 고 찰 에 비해 1.9배 높은 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다. 따라 서, 본 결과에서 콩잎추출물은 고지방식이 동안 AMPK 및 ACC 본 연구에서는 비알코올성 지방간 개선에 효과가 있을 것으로 등 지질대사 효소의 활성화를 증가시키고, FAS 등 지질합성 효 생각되는 이소플라본 고함량 콩잎추출물에 대해 고지방식이 동 Vol. 61, No. 3, 2017
200 김소라 제지현 정준연 김현정 송영훈 박기훈 강상수 박상원 Fig. 5 Effect of soybean leaf extract on lipolytic and lipogenic enzymes in the liver from high-fat diet-fed mice. The mice were fed with normal diet or high-fat diet for 64 days with or without Soybean leaf, and then the changes in protein levels were determined by Western blot analysis (N=4 for each group). Data are presented as the mean±sem. *P<0.05 compared to the ND group; # P<0.05 compared to the HFD+Vehicle group. 물모델을이용하여체지방축적및비알코올성지방간억제효능을알아보았다. 비알코올성지방간질환은비만, 당뇨등대사성질환과밀접하게연관되어있으며, 단순지방간에서부터만성간염, 간경변 ( 간경화 ) 을거쳐간암으로까지발전할수있는광범위한영역을포함하는질환이다. 8) 단순지방간은임상적으로뚜렷한외부증상이나타나지않으므로지방간자체를심각하게여기지않고있다. 그러나, 단순지방간도중증질환인간염, 간경변등으로발전할수있는가능성이있다는면에서중요하게다루어야하며, 단순지방간은그원인을제거하면다시정상간으로회복될수있는가역적단계에있으므로비알코올성지방간질환의치료를위한중요한단계라고볼수있다. 비알코올성지방간의원인은매우복잡하고다양하나주로고칼로리식에의한비만, 인슐린저항성증가, 지방조직내대사조절호르몬인 adiponectin의감소, 고지방식으로인한혈중지질함량증가등이원인이되어간세포내지질함량을증가시킴으 로써나타나는것으로알려져있다. 9) 비알코올성지방간에서간세포내지질축적은고지방식이섭취, 혈중 FFA 의유입증가, 세포내지질합성증가및세포내지질대사감소가주된원인이다. 10) 따라서, 본연구에서는콩잎추출물의비알코올성지방간억제효능을알아보기위해비만, 당뇨등대사성질환의양상을나타내는고지방식이동물모델에서실험을진행하였으며, 체지방및간조직내지방의변화를중심으로결과를분석하였다. 또한간조직의지질대사및지질합성에관여하는효소의변동도함께분석하였다. 고지방식이는 9주에걸쳐정상식이에비해지속적으로체중을증가시켰으며, 내장, 피하, 부고환및갈색지방을현저히증가시켰다. 콩잎추출물의처치는특히내장지방및피하지방의증가를유의적으로억제하였으며, 이러한결과는콩잎추출물이고지방식이에의한체지방량증가를개선하는효능이있음을명확히보여준다. 비만에의한체지방증가는지방간을유발하는주요원인으로알려져있다. 지방조직의지질은지방산형태로혈중에유 J. Pharm. Soc. Korea
콩잎추출물의지방간억제효과 201 입되며, 혈중지방산은 cluster of differentiation 36 또는 fatty acid translocase에의해간세포로유입된다. β-oxidation에의한지질대사가원활하지않으면간세포에서지질로축적된다. 11) 본연구에서콩잎추출물은간조직에서지질및중성지방의축적을유의적으로억제하였으며, 콩잎추출물의지방간억제효능은비만및체지방증가억제에대한효능을통해서도나타나는것으로생각된다. 다음으로는간세포내콩잎추출물의작용기전을알아보기위해지질합성및지질대사효소의발현및활성화양상을분석하였다. AMPK는세포내대사기능의항상성유지와밀접하게관련되어있는효소로서간세포에서는주로콜레스테롤합성, 지질합성, 중성지방합성의억제및 fatty acid oxidation에관여하는것으로알려져있다. 12) AMPK의활성화는다양한지질합성효소전사인자인 SREBP-1c의활성화를억제하는것으로알려져있으며, ACC의인산화를일으키는상위신호전달인자이다. 13) ACC는 acetyl-coa의비가역적카르복시화로 malonyl-coa를생성하는효소로서 malonyl-coa는지방산의생합성을위한전구물질로사용된다. AMPK에의한인산화로 ACC는활성이억제되며, 이때지방산대사는증가하고지질생합성은감소한다. 14) 본연구에서콩잎추출물은간조직내 AMPK의단백질발현과인산화를증가시켰다. 콩잎추출물의투여는 ACC의발현을증가시켰으나인산화도증가시키는결과를나타내었다. 이러한결과는콩잎추출물에의한간조직내지질및중성지방축적억제효과와일관되는결과이며, 콩잎추출물이 AMPK 및 ACC의인산화를증가시킴으로써지질대사를높이고지질합성을억제하는것으로판단된다. FAS 는간세포에서지방산생합성의마지막과정을조절하는효소로서 malonyl-coa로부터 fatty acid를생성한다. 본연구에서콩잎추출물은 FAS의발현을억제하는결과를나타내었다. 최근연구에서 genistein과 daidzein이당뇨병동물모델에서 FAS 활성을억제하고 β-oxidation을증가시켜간장내중성지방의축적을억제하는것으로보고되었으며, 15) 본연구에서이소플라본유도체가다량함유된콩잎추출물이간에서지질합성및지질대사효소를조절할수있다는본연구결과와일관성이있다. 이러한결과로볼때본연구에사용된콩잎추출물은이소플라본고함량물질로서이소플라본에의한에스트로겐수용체자극이주요작용기전중하나로생각되나콩잎추출물은또한다량의필수아미노산 (essential amino acid) 을함유하고있으므로아미노산에의한효과도함께나타날수있다. 콩잎추출물의작용기전에대해서는향후더많은연구가필요할것으로판단된다. 결론본논문에서는에테폰처리를통해재배된콩잎열수추출물의 비알코올성지방간억제효능을고지방식이동물모델에서평가하였다. 콩잎추출물은고지방식이동물모델에서내장지방및피하지방의축적을억제하였으며, 간조직의무게증가, 지질축적및중성지방의축적을억제하였다. 콩잎추출물은지질대사관련효소인 AMPK와 ACC의발현및인산화를증가시켰으며, 지방산합성효소인 FAS의발현을억제하였다. 따라서, 이소플라본유도체를함유하는콩잎추출물은대사성질환으로일어나는체지방증가및비알코올성지방간의발병을억제하는효과가있는것을알수있다. 감사의말씀본연구는한국연구재단선도연구센터지원사업 ( 바이오항노화의과학연구센터, NRF-2015R1A-5A2-008833) 에의해이루어진것임. References 1) Bellentani, S. : The epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int. 37, 81 (2017). 2) Calzadilla Bertot, L. and Adams, L. A. : The Natural Course of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. Int. J. Mol. Sci. 17, E774 (2016). 3) Van Loon, L. C., Geraats, B. P. and Linthorst, H.J. : Ethylene as a modulator of disease resistance in plants. Trends Plant. Sci. 11, 184 (2006). 4) Lin, Z., Zhong, S. and Grierson, D. : Recent advances in ethylene research. J. Exp. Bot. 60, 3311 (2009). 5) Yuk, H. J., Song, Y. H., Curtis-Long, M. J., Kim, D. W., Woo, S. G., Lee, Y. B., Uddin, Z., Kim, C.Y. and Park, K. H. : Ethylene Induced a High Accumulation of Dietary Isoflavones and Expression of Isoflavonoid Biosynthetic Genes in Soybean (Glycine max) Leaves. J. Agric. Food Chem. 64, 7315 (2016). 6) Yu, O., Jung, W., Shi, J., Croes, R. A., Fader, G. M., McGonigle, B. and Odell, J. T. : Production of the isoflavones genistein and daidzein in non-legume dicot and monocot tissues. Plant Physiol. 124, 781 (2000). 7) Pilš α kov α, L., Riečansky, I. and Jagla, F. : The physiological actions of isoflavone phytoestrogens. Physiol. Res. 59, 651 (2010). 8) Preiss, D. and Sattar, N. : Non-alcoholic fatty liver disease: an overview of prevalence, diagnosis, pathogenesis and treatment considerations. Clin. Sci. (Lond). 115, 141 (2008). 9) Liu, Q., Bengmark, S. and Qu, S. : The role of hepatic fat accumulation in pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). Lipids Health. Dis. 9, 42 (2010). 10) Koo, S. H. : Nonalcoholic fatty liver disease: molecular Vol. 61, No. 3, 2017
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