ORIGINAL ARTICLE pissn: 2384-3799 eissn: 2466-1899 Int J Thyroidol 2018 November 11(2): 160-166 https://doi.org/10.11106/ijt.2018.11.2.160 타액선도관세포의관류배양기술개발 인하대학교의과대학이비인후과학교실 김지원, 김정미, 최정석 Development of the Three-Dimensional Perfusion Culture Technology for the Salivary Ductal Cells Ji Won Kim, Jeong Mi Kim and Jeong-Seok Choi Department of Otolaryngology, Inha University School of Medicine, Incheon, Korea Background and objectives: Salivary hypofunction is one of the common side effects after radioiodine therapy, and its pathophysiology is salivary ductal stenosis resulting from ductal cell injury. This study aimed to develop the functional culture environment of human parotid gland ductal cells in in vitro three-dimensional perfusion culture system. Materials and Methods: We compared plastic dish culture method and three-dimensional culture system containing Matrigel and nanofiber. Morphogenesis of reconstituted salivary structures was assessed by histomorphometry. Functional characteristics were assessed by immunohistochemistry and reverse transcription polymerase chain reaction (aquaporin 5, CK7, CK18, connexin 43, and p21). In addition, we designed the media perfusion culture system and identified higher rate of cell proliferation and expression of connexin 43 in perfusion system comparing to dish. Results: Human parotid ductal cells were well proliferated with the ductal cell characters under environment with Matrigel. In the presence of Matrigel, aquaporin 5, CK18 and connexin 43 were more expressed than 2D dish and 3D nanofiber setting. In the media perfusion culture system, ductal cells in 3D culture media showed higher cells count and connexin 43 expression compared to 2D dish. Conclusion: This in vitro ductal cell perfusion culture system using Matrigel could be used to study for radioiodine induced sialadenitis model in vivo. Key Words: Thyroid cancer, Perfusion, Culture, Salivary gland 서론 갑상선암환자에서방사성요오드치료후나타나는구강건조, 침샘동통및부종, 미각변화등타액선염및타액선기능장애는방사성요오드치료를받은전체환자의 20-70% 환자에서나타난다고보고된다. 1) 이런부작용은일시적이지만많게는약 15% 의환자에서증상이지속되어방사성요오드치료를받은환자의삶의질에영향을미친다. 2) 방사성요오드에의한타액선손 상은주로도관세포에서일어나게되므로도관세포배양기술확립은방사성요오드손상기전연구및치료제개발에매우중요한연구라사료된다. 타액선조직은타액을생성하는선포 (acinar unit) 와타액이배출되는도관 (ductal component) 으로구성되어있다. 3) 선포에서는끊임없이타액을만들며, 도관세포는타액의흐름에자극을받기때문에관류시스템을이용한배양이타액선도관의환경을잘반영할수있다. 기존의세포배양기술은이차원에서타액선세포의모든세포타입을포함한연구가주였으며, 조직 Received April 17, 2018 / Revised May 23, 2018 / Accepted May 24, 2018 Correspondence: Jeong-Seok Choi, MD, PhD, Department of Otolaryngology, Inha University School of Medicine, 27 Inhang-ro, Jung-gu, Incheon 22332, Korea Tel: 82-32-890-3570, Fax: 82-32-890-3580, E-mail: jschoi@inha.ac.kr Copyright c 2018, the Korean Thyroid Association. All rights reserved. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/), which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 160
Perfusion Culture System of the Salivary Ductal Cells 공학적으로 타액선 세포를 배양하여 이식하였을 때 선 사람(60세, 남자)에게 채취한 정상 이하선 도관세포를 포세포의 특성을 유지하거나 도관 구조의 성격을 유지 분리하였으며, 이는 환자의 동의(informed consent)를 4) 받고, 채취 절차 프로토콜을 본 기관에서의 임상시험 하기 힘든 단점이 있었다. 간극연접(Gap junction)은 인접한 세포 사이의 이온 윤리위원회(Institutional Review Board approval) 승인 및 저분자량 대사 산물의 직접적인 세포질 교환을 가 을 받은 후 진행하였다(승인번호: 110707 02). 타액선 능하게 하는 완전한 막 단백질이며, 심장, 혈관, 대장, 도관세포 분리 과정과 배양 조건을 요약하면, 이하선 췌장, 신경 등 다양한 조직세포에서 다양한 connexin 조직에서 정상 도관세포를 분리하여 1% 항생제가 섞 5) isomer가 발현된다고 알려져 있다. 타액선 선포세포 인 PBS에 세 번 세척하고 잘게 자른 후 0.25% collagenase 에서는 connexin 26과 connexin 32가 발현되며 이는 선 type B, 0.1% DNase I (Sigma Aldrich, USA)을 37 C에 6-8) o 선포세포의 서 30분간 처리하고 70 um cell strainer로 거른 후, 5분 주변 조직인 상피세포에서는 connexin 43이 발현되며 간 1500 rpm으로 원심 분리한다. 분리한 도관세포를 세포의 수축기능 조절과 관련되어 있음이 보고되었으 배양접시, Matrigel (50%; BD Bioscience, USA), Nanofiber 7) (Sigma Aldrich, USA) 디쉬의 세 가지 조건으로 10% 본 연구에서는 다양한 3차원 배양기술을 이용하여 FBS (ATCC, USA), 1% antibiotics (Gibco, USA)이 함 타액선 도관세포의 형태 및 유전적 특성을 비교 확인 유된 D/F12 (Gibco, USA) 배지 조성으로 배양하였다. 포세포의 분비 기능과 관련되어 있고, 나, 타액선 도관세포에서의 연구는 전무한 실정이다. 하고, 3차원 배양기술을 관류 배양시스템에 적용하여 향후 방사성요오드 치료에 기인한 타액선 기능저하 기 전연구 및 치료제 개발 연구의 새로운 배양법으로써의 가능성을 확인하고자 한다. 도관세포의 형태 변화 및 Quantitative Real-Time PCR (qrt-pcr) 분석 2차원(dish culture) 및 3차원(Nanofiber, Matrigel culture) 배양 조건에 따른 타액선 도관세포의 성장 및 대상 및 방법 형태를 배양기간(day 1, day 3, day 6)에 따라 비교 확인 하였다. 도관세포 증식은 광학 현미경(Olympus CKX41, 타액선 도관세포 분리 및 배양조건에 따른 배양 본원에서 양성 종양으로 이하선 절제술을 시행 받은 Olympus, 200 magnification)으로 관찰하였다. 선포 특 이 마커(aquaporin 5; AQP 5), 도관 특이 마커(cytokeratin 8, 17; CK8, 17), 간극 연접 단백질(connexin 43)의 mrna Fig. 1. A schematic diagram of a three-dimensional culture model of ductal cells (A), photographs of ductal cell perfusion devices (B), and optical microscopic photograph of ductal cell culture (C). 161 Int J Thyroidol
Ji Won Kim, et al 발현을 qrt-pcr (ABI PRISM sequence detection system, CK7 [Forward 5`-CAG GAT GTG GTG GAG GAC-3`, USA)을 이용하여 확인하였다. qrt-pcr은 1 um cdna, Reverse 5`-AAC TTG GCACGC TGG TTC T-3`], 10 um SYBR Green PCR master mix (Roche Diagnostics, CK18 [Forward 5`- GGA GGC TGG AGA GCA AAA Canada)와 10 pm의 다음에 해당하는 특이 sense/ TC-3`, Reverse 5`-AGT CAT CAG CAG CAA antisense 실험하였다(AQP5 GACGG-3`]과 connexin 43 [Forward 5`-AGT TCA [Forward 5`-ACT GGG TTT TCT GGG TAG GG-3`, ATC ACT TGG CGT GAC TT-3`, Reverse 5 -GCA Reverse 5`-GTG GTC AGC TCC ATG GTC TT-3`], GTT GAG TAG GCT TGA ACC TT-3`]). 실험은 독립 primers와 혼합하여 Fig. 2. (A) The morphology of salivary ductal cells according to 2-D and 3-D culture conditions, (B) The mrna expression of acinar cell marker (AQP5), ductal cell markers (CK7,18) and cell junctional protein (connexin 43) (*p 0.05, ** p 0.01, ***p 0.001). Vol. 11, No. 2, 2018 162
Perfusion Culture System of the Salivary Ductal Cells 적으로 3번시행되었으며 house-keeping gene인 GAPDH (Forward 5`-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3`, Reverse 5`-TAA AAG CAG CCC TGG TGA CC-3`) 를기준으로상대적발현정도를측정하였다. 관류배양시스템적용및세포간극연접단백질발현확인관류식세포배양장치는공과대학실험실에서제공받아사용하였으며, CO 2 chamber 내에서세포배양액을저장하는배양기포트에서유출포트로세포배양액이 1 ul/min의일정한유속으로흐를수있도록 syringe pump를연결하여제작하였다 (Fig. 1). 관류식세포배양장치에 hydrogel을코팅한후, 1000개의도관세포를도포하여 10% FBS, 1% antibiotics 함유된 D/F12 배지로 7일간배양한후, 광학현미경으로세포의형태를관찰하였다. 2차원 dish로배양된세포와관류배양된세포에서 anti-connexin 43 mouse monoclonal antibody (Santa Cruz, USA) 를면역형광염색법으로염색하였으며공초점현미경 (Olympus, USA) 을사용하여발현을확인하였다. 배양된도관세포의방사성요오드치료후생존및세포간극단백질발현확인배양한도관세포에방사성요오드 (50 μci/ml) 를처리하고광학현미경으로시간에따른 (day 0, day 1, day 2, day 4) 세포의생존율 (viability) 을측정하였다. 방사성요오드노출시간에따른 cell death 마커 (P21; Forward 5`-GCA GAC CAG CAT GAC AG-3`, Reverse 5`-TAG GGC TTC CTC TTG GA-3`) 와 connexin 43 의발현을 qrt-pcr을이용하여확인하였다. 통계분석통계분석은 Graph Pad Prism 5 package (GraphPad Software Inc. USA) 를사용하였다. 그룹간차이를보기위해 Mann-Whitney test 및 ANOVA test를사용하였고, p value는 0.05 이하를통계적으로유의하다고판단하였다. 결과 2차원및 3차원배양조건에서의타액선도관세포의형태및유전자변화배양시간이늘어남에따라 2차원 dish에서배양된 세포보다 3차원 Matrigel 및 Nanofiber dish에서배양된세포의모양성숙도가더큰것을확인할수있었다. 도관세포와비슷한모양은오직 3차원세포배양에서만나타났으며 Nanofiber보다 Matrigel을이용한 3차세포배양에서속도가더빠르고, 빈손가락같은돌기 (hollow finger like processes) 모습의세포형태를보였다 (Fig. 2A). 선포세포마커 (AQP5), 도관세포마커 (CK18), 세포간극단백질 (connexin 43) 의 mrna 발현이 dish에비해 Matrigel에서높게나타났고, 도관세포마커중하나인 CK7의 mrna 발현은 dish에서높고, Matrigel에서는낮게나타났다. Nanofiber에서는검사한모든유전자의발현이낮게나타났다 (Table 1, Fig. 2B). 타액선도관세포 Hydrogel 탑재 3차원관류배양및 Connexin 43 발현변화확인 Matrigel과비슷한성상을가진 hydrogel을탑재한 3 차원관류배양시스템에서도관세포를배양했을때도관세포가길게뻗어나가는형태로증식됨을확인하였다 (Fig. 3A). 또한, 2차원 dish에서배양된도관세포에서보다 hydrogel 탑재 3차원관류배양시스템내에서배양된도관세포에서 connexin 43의발현이더잘되는것을확인할수있었다 (Fig. 3B). 방사성요오드처리에따른도관세포생존율및관련유전자확인 배양한도관세포에방사성요오드 (50 μci/ml) 를처리하였을때시간 (day 0, 1, 2 그리고 4) 이경과함에따라점차세포생존율이감소하며 2일째에 50% 이상사멸하며, 4일째에대부분세포가생존하지못함을확인하였으며, p21 유전자의발현도시간이경과함에따라증가됨을확인하였다 (Fig. 4, p<0.05). Table 1. Relative mrna expression Variable 2D Dish 3D Nanofiber 3D Matrigel AQP 5 1 3.03±0.06 64.54±14.15*** CK7 1 0.24±0.01** 0.74±0.04* CK18 1 0.49±0.06** 1.31±0.08* Connexin 43 1 1.17±0.04 7.24±0.24*** Relative mrna levels were expressed as mean±sd (relative to 2D dish). AQP 5: aquaporin 5, CK8, 17: cytokeratin 8, 17 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 163 Int J Thyroidol
Ji Won Kim, et al Fig. 3. Conformational change of salivary ductal cells under perfusion culture system of ductal cells (A), confirmation of cell gap junctional protein (connexin 43) expression in two-dimensional culture and perfusion culture (B). 고 찰 연구를 위한 이하선 도관세포의 특성을 유지하는 관류 배양 3차원 세포 배양법을 연구하고자 하였다. 방사성요오드 치료 후 나타나는 흔한 부작용인 타액 인공 타액선을 만드는데 조직공학적으로 많은 제한 선의 기능 저하는 방사성요오드 용량에 비례하며, 이 점이 있는 이유는 타액을 분비하는 선포세포의 성상 는 타액선 세포의 손상에 기인하고, 특히 이하선 도관 및 분비물을 분비하는 transporter 단백질 및 세포간극 세포는 악하선보다 타액선염에 더 취약하다고 알려져 등을 모사하지 못하며, 세포 외 조직의 여러 성분 및 1-3) 있다. 기존 타액선 세포의 연구는 대부분 오직 선포 9) 여러 줄기세포에서 분비되는 사이토카인(cytokine) 등 10-13) 세포의 분리 및 배양에 초점을 맞추어 이루어져 있다. 을 고려한 프로토콜을 만들기 어렵기 때문이다. 그뿐만 아니라 재현성이 없고, 비용적인 면 등에서 많 2005년 Tran 등 이 정상 악하선 조직을 2차원 배양(플 은 제한점을 갖고 있다. 따라서 본 연구는 향후 방사성 라스틱 접시에 일주일에 2번씩 배양액[DMEM/F-12]을 요오드 치료를 받은 갑상선암 환자에서 침샘 기능저하 바꿔 오염된 섬유아세포를 세척해주면서 세포 배양)한 14) Vol. 11, No. 2, 2018 164
Perfusion Culture System of the Salivary Ductal Cells Fig. 4. (A, B) Viability of salivary duct cells over time after radioiodine treatment. (C) Expression of p21 over time after radioiodine treatment (*p 0.05). 결과, 세포 간극 단백질인 ZO-1, claudin-1, E-cadherin 유지하면서 세포를 배양할 수 있는 적당한 배양액의 이 과발현되고 세포 형태상 극상의 단일층의 세포로 종류와 조건을 확립하고자 하였다. 본 연구 결과, 분비관의 형태를 많이 띄어, 이는 타액선 조직 중 도관 Nanofiber보다 Matrigel에서 세포 배양 속도가 더 빠르 성분 중심으로 개재관(intercaliated duct) 또는 줄무늬 고, 빈 손가락 같은 돌기(hollow finger like processes) 관(striated duct)을 잘 반영하는 배양 방법으로 여겨졌 모습의 세포 형태를 보였고, 이는 Joraku 등 의 연구 었다. 그러나 이 실험 방법은 2차원 배양으로 선포세포 결과와 비슷한 경향을 보였다. 의 특성을 반영하지 못하는 단점이 있었다. 2008년 15) 4) 또한, 관류배양(perfusion culture)이란 의미는 관을 Szlavik 등 은 기저막 추출물(basement membrane extract) 통해 새로운 배양액(media)을 계속 공급하고 또 다른 인 Matrigel을 이용하여 선포세포로 분화하는 배양법을 관을 통해서는 일정 시간이 지난 배양액을 계속 빼주 개발하였다. 하지만 이는 동물의 혈장을 이용하여 오 는 방식이다. 배양액이 지속적으로 흐르는 것은, 선포 16) 염의 위험이 있어, 2011년 Maria 등 은 Matrigel과 세포에서 타액을 생산하고 주변 근상피세포가 선포세 serum free 배양액을 사용하여 이하선과 악하선의 타액 포를 자극하여 도관으로 타액이 분비되는 흐름을 모사 선세포 배양에 성공하였고 이는 선포세포의 특성을 잘 한 것이라 할 수 있다. 따라서 저자는 제작된 관류배양 보존할 수 있는 기법으로 제시되었다. 반면, Nanofiber 기구에 이하선의 도관세포를 넣어 시간에 따라 도관세 역시 타액선 상피세포의 배양 시 세포의 기능적 측면 포의 증식을 확인하여 가능성을 확인하였다. 그뿐만 을 잘 보존할 수 있는 물질로 연구되어 왔으며, 아니라 일반 2차원 배양에서보다 3차원 관류배양에서 nanofibrous microwell 조건에서 기능적 타액선세포가 배양된 도관세포에서의 세포간극 단백질 connexin 43 spheroid 구성을 더 잘하는 것으로 알려져 있다. 17) 본 연구는 도관세포만 분리하여 도관세포의 특성을 165 Int J Thyroidol 이 높게 발현됨을 확인하여, 3차원 관류배양법이 도관 세포의 형태와 기능을 유지할 수 있는 새로운 배양법
Ji Won Kim, et al 으로써의가능성을제시한다고하겠다. 하지만, 본연구에서는 3차원관류배양시스템에 Matrigel이아닌비슷한성상의 hydrogel을탑재하여연구가진행되었기에, 향후 Matrigel을코팅하여도관세포의형태와기능을유지하면서배양이가능한지추가실험이필요할것이라사료된다. 또한, 배양한도관세포주가방사성요오드처리시세포손상을받는지를확인함으로써향후 Matrigel을이용한도관세포배양후방사성요오드치료의용량설정등도관세포주의배양모델로의가능성을제시한다고할수있을것이다. 결론 Matrigel을이용한 3차원세포배양법으로서일정속력의배양액이흐르는관류배양모델은방사성요오드치료를받은갑상선암환자에서타액선기능저하연구를위한타액선도관세포배양에도움이되는방법이될것이라사료된다. 중심단어 : 갑상선암, 관류, 배양, 타액선. Acknowledgments This work was supported by the Korean Thyroid Association Outstanding Investigator Award 2016. References 1) Grewal RK, Larson SM, Pentlow CE, Pentlow KS, Gonen M, Qualey R, et al. Salivary gland side effects commonly develop several weeks after initial radioactive iodine ablation. J Nucl Med 2009;50(10):1605-10. 2) Choi JS, Park IS, Kim SK, Lim JY, Kim YM. Morphometric and functional changes of salivary gland dysfunction after radioactive iodine ablation in a murine model. Thyroid 2013;23(11):1445-51. 3) La Perle KM, Kim DC, Hall NC, Bobbey A, Shen DH, Nagy RS, et al. Modulation of sodium/iodide symporter expression in the salivary gland. Thyroid 2013;23(8):1029-36. 4) Joraku A, Sullivan CA, Yoo J, Atala A. In-vitro reconstitution of three-dimensional human salivary gland tissue structures. Differentiation 2007;75(4):318-24. 5) Nielsen MS, Axelsen LN, Sorgen PL, Verma V, Delmar M, Holstein-Rathlou NH. Gap junctions. Compr Physiol 2012; 2(3):1981-2035. 6) Kuraoka A, Yamanaka I, Miyahara A, Shibata Y, Uemura T. Immunocytochemical studies of major gap junction proteins in rat salivary glands. Eur Arch Otorhinolaryngol 1994;251 Suppl 1:S95-9. 7) Muramatsu T, Hashimoto S, Shimono M. Differential expression of gap junction proteins connexin32 and 43 in rat submandibular and sublingual glands. J Histochem Cytochem 1996;44(1):49-56. 8) Shimono M, Young Lee C, Matsuzaki H, Ishikawa H, Inoue T, Hashimoto S, et al. Connexins in salivary glands. Eur J Morphol 2000;38(4):257-61. 9) Chan YH, Huang TW, Young TH, Lou PJ. Selective culture of different types of human parotid gland cells. Head Neck 2011;33(3):407-14. 10) Feng J, van der Zwaag M, Stokman MA, van Os R, Coppes RP. Isolation and characterization of human salivary gland cells for stem cell transplantation to reduce radiation-induced hyposalivation. Radiother Oncol 2009;92(3):466-71. 11) Hardman P, Spooner BS. Localization of extracellular matrix components in developing mouse salivary glands by confocal microscopy. Anat Rec 1992;234(3):452-9. 12) Wang S, Cukierman E, Swaim WD, Yamada KM, Baum BJ. Extracellular matrix protein-induced changes in human salivary epithelial cell organization and proliferation on a model biological substratum. Biomaterials 1999;20(11):1043-9. 13) Bing SJ, Kim MJ, Ahn G, Im J, Kim DS, Ha D, et al. Acidic polysaccharide of Panax ginseng regulates the mitochondria/caspasedependent apoptotic pathway in radiation-induced damage to the jejunum in mice. Acta Histochem 2014;116(3):514-21. 14) Tran SD, Wang J, Bandyopadhyay BC, Redman RS, Dutra A, Pak E, et al. Primary culture of polarized human salivary epithelial cells for use in developing an artificial salivary gland. Tissue Eng 2005;11(1-2):172-81. 15) Szlavik V, Szabo B, Vicsek T, Barabas J, Bogdan S, Gresz V, et al. Differentiation of primary human submandibular gland cells cultured on basement membrane extract. Tissue Eng Part A 2008;14(11):1915-26. 16) Maria OM, Zeitouni A, Gologan O, Tran SD. Matrigel improves functional properties of primary human salivary gland cells. Tissue Eng Part A 2011;17(9-10):1229-38. 17) Shin HS, Kook YM, Hong HJ, Kim YM, Koh WG, Lim JY. Functional spheroid organization of human salivary gland cells cultured on hydrogel-micropatterned nanofibrous microwells. Acta Biomater 2016;45:121-32. Vol. 11, No. 2, 2018 166