난소절제한백서의방광과요도에서 Neuronal 및 Endothelial Nitric Oxide Synthase 의발현과조직학적변화 The Effect of Estrogen on Expression of Neuronal and Endothelial Nitric Oxide Synthase and on Histologic Composition in Rat Bladder and Urethra 대한비뇨기과학회지제 49 권제 6 호 2008 Sung Woo Park, Jeong Zoo Lee From the Department of Urology, College of Medicine, Pusan National University, Busan, Korea Purpose: We investigated the effects of estrogen on the expression of neuronal nitric oxide synthase (nnos) and on endothelial nitric oxide synthase (enos), and furthermore elucidated its effect on the histologic composition of the rat bladder and urethra. Materials and Methods: Forty-five mature female Sprague-Dawley rats (10-11 weeks, 235-250g) were randomly assigned to one of three groups: control group (C), oophorectomy group (O), or hormone (estradiol) replacement group (H). The degree of expression of nnos and enos in bladder and urethral tissues was investigated using immunohistochemical staining, and tissue was described as mucosa, smooth muscle, or vessel. We also investigated changes in histologic composition using Masson's trichrome stain. Results: In bladder and urethra, the expression rates of nnos and enos significantly increased in the O group, but decreased in the H group (p< 0.05), except for nnos in the mucosa and smooth muscle of the bladder. The relative collagen ratios significantly increased in bladder and urethra in the O group, to 121.2±12.7% and 135.5±25.2%, respectively, but decreased to 95.6±15.2% and 93.7±12.8% in the H group, respectively (p<0.05). Conclusions: These data suggest that estrogen replacement therapy decreases nnos and enos expression and the collagen component in the urethra. (Korean J Urol 2008;49:533-539) Key Words: Nitric oxide synthase, Collagen, Incontinence 부산대학교의과대학비뇨기과학교실 박성우ㆍ이정주 접수일자 :2007년 12월 10일채택일자 :2008년 4월 21일 교신저자 : 이정주부산대학교병원비뇨기과부산광역시서구아미동 1 가 10 번지 602-739 TEL: 051-240-7350 FAX: 051-255-7133 E-mail: toohotman@ pusan.ac.kr 서론고령의여성에서요실금의가장중요한원인이폐경이라는것은이전의여러연구에서증명되었다. 1 그리고폐경기여성에서에스트로겐을보충하였을경우, 요실금을호전시키는기전으로는요도내압을증가시키고, 복압의근위부요도로의전달을증가시키고방광의감각역치를올리는것으로알려져있다. 2 근래연구에의하면비아드레날린성비콜린성 (non-adrenergic non-cholinergic; NANC) 신경에서 nitric oxide (NO) 가분비되는것이여러포유류연구들에서밝혀졌으며, 3-5 에스 트로겐이 NO를생성시키는 nitric oxide synthase (NOS) 의활동성을조절한다는것이여러조직에서증명되었다. 6 이에저자들은에스트로겐보충요법이방광과요도등의하부요로에서 NO를어떻게조절하고어떠한조직학적변화를일으키는지알아보기위해난소절제한백서에서호르몬보충요법을시행하여방광과요도조직에서 neuronal NOS (nnos) 와 endothelial NOS (enos) 에대한면역조직화학적연구를시행하고, 더불어조직학적변화를관찰하였다. 533
534 대한비뇨기과학회지 : 제 49 권제 6 호 2008 1. 실험동물및실험군 Table 1. Study design 대상및방법 실험동물로는생후 10-11주된 235-250g의성숙한암컷백서 (Sprague Dawley) 45마리를이용하였다. 이들은대조군 ( 이하 C군, 가장수술만시행, n=15), 난소절제군 ( 이하 O 군, n=15), 난소절제후호르몬보충군 ( 이하 H군, n=15) 으로나누었으며모두동일한조건으로사육되어졌다. 2. 방법 1) 난소절제와호르몬보충 : 모든실험동물은 ketamine (25mg/kg) 과 xylazine (5mg/kg) 를복강내주입하여마취시킨뒤 midline incision을이용하여개복하였으며 O군은양측난소절제술시행, C군은가장수술만시행및 H군은난소절제후 2주경과후 estradiol cypionate (0.25mg/1week, Miro-depot inj., 한일약품 ) 를근주하였으며 O군은 sessame oil (0.25cc) 만을같은방법으로주사하였다 (Table 1). 2) 조직채취및혈류량측정 : 조직은 O군의경우난소절제 2주후, H군은난소절제 2주경과뒤호르몬보충 2주후 ketamine (25mg/kg) 과 xylazine (5mg/kg) 를복강내주입하여마취시킨뒤조직을채취하였다 (Table 1). 모든조직은주위의지방조직과결체조직을제거하고생리식염수에세척후 10% 포르말린에고정하였다. 난소절제와가장수술시에 doppler를이용하여신정맥, 대정맥, 대동맥및장골정맥의혈류량을각각 3회씩측정하였으며조직채취시에측정한혈류량에대한비를구하였다. 3) 혈중호르몬의측정 : 혈액채취는조직채취시에대정맥을통해 5cc 정도채취하여 DPC's Coat-A-Count RIA kit (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, USA) 를이용하여혈중 17-베타에스트라디올 (17β-estradiol) 을측정하였다. 4) 면역조직화학적검사 : 파라핀포매되어진백서의방광및요도조직을 4μm 두께로잘라서면역조직화학염색을 Weeks 0 2 4 Control group (n=15) Sham operation K* Oophorectomy group (n=15) Ox K Hormone replace group (n=15) Ox HRT K *: killing time, : oophorectomy, : hormone replace (estradiol cypionate) 하였다. 탈수과정을거친조직중 enos 염색을위한조직은 citrate buffer에담근채 autoclave를이용하여 15분간끓인후고정하였으며, nnos 염색을위한조직은바로고정하였다. 그후일차항체를반응시켰는데, 일차항체로 nnos 는 rabbit polyclonal anti-nnos 항체 (Zymed laboratories, Inc., USA) 를 1:250으로, enos는 rabbit polyclonal anti-enos 항체 (Lab vision, Inc., USA) 를 1:200으로희석하여 4 o C에서하룻밤을반응시킨후 biotin이부착된이차항체에 30분간반응시키고 PBS에 5분간 3번씩세척후, streptavidin에 30분간반응시키고 5분간 3번씩세척을반복한뒤 AEC로발색하였다. 면역조직화학적염색결과의판정은무작위로선정된 400배확대시야열군데에서대안격자안에보이는전체세포수에대한세포질과핵막이적색으로염색되는양성세포수의비율을방광과요도각조직의점막, 평활근및혈관부위로나누어측정하였다. 5) 평활근과콜라겐함량의변화관찰 : 방광과요도의평활근성분과콜라겐성분의상대적인구성비의변화를보기위해파라핀포매조직을 4μm의절편으로만들어 masson's trichrome 염색을하여무작위로 400배확대시야열군데를선정하여격자안에보이는콜라겐세포의수를백분율로환산하여평균하였다. 6) 통계분석 : 혈중에스트로겐의농도의변화는 Mann- Whitney U test로, 세군에서 NOS의발현도변화와조직학적변화는 Kruskall-Wallis test를이용하여비교분석하였으며, p값이 0.05 미만일경우통계적으로유의하다고하였다. 결과 1. 혈류량변화술중대정맥및장골정맥에서측정한혈류량은각군에서의미있는변화를나타내지않았다 (p>0.05). 2. 혈중호르몬변화 17β-estradiol은 O군에서 3.47±2.42pg/ml로 16.27±15.49 pg/ml인 C군에비하여유의하게감소하였으며, H군에서는 28.68±10.51pg/ml로유의하게증가하였다 (p<0.05). 3. 면역조직화학염색소견 1) nnos의면역조직화학염색소견 : C, O 및 H군에서 nnos의발현율이방광의점막및평활근에서는의미있는차이를보이지않았으나 (p>0.05), 혈관에서는 C군에비해 O군에서의미있게증가하였으며, O군에비해 H군에서의미있게감소하였다 (p<0.05) (Fig. 1A, 2). 요도의점막, 평활
박성우ㆍ이정주 난소 절제한 백서의 방광과 요도에서 nnos 및 enos의 발현과 조직학적 변화 535 Fig. 1. The mean expression percentage of neuronal nitric oxide synthase (nnos). A: bladder, B: urethra. Control: control group, Ox: oophorectomy group, HRT: hormone replacement group, *: p 0.05 vs control group, : p 0.05 vs oophorectomy group. Fig. 2. Immunoreactivity pattern for neuronal nitric oxide synthase (nnos) in rat bladder and urethra. (A) control group, (B) oophorectomy group, (C) hormone replacement group (x200). 근 및 혈관 모두에서는 C군에 비해 O군에서 의미있게 증가 하였으며, O군에 비해 H군에서 의미있게 감소하였다 (p 0.05) (Fig. 1B, 2). 4. 평활근과 콜라겐 성분 함량의 변화 조직학적 검사에서 O군은 방광 및 요도의 혈관 분포의 2) enos의 면역조직화학염색 소견: 방광에서의 enos의 감소, 상피세포의 위축 및 근육층 감소 등이 관찰되었으며, 발현은 점막, 평활근 및 혈관 모두에서 C군에 비해 O군에 H군은 방광 및 요도의 혈관 분포 증가, 상피세포의 증식 및 서 의미있게 증가하였으며, O군에 비해 H군에서 의미있게 근육층 증가 등이 관찰되었다 (Fig. 5). Masson's trichrome 감소하였다 (p 0.05) (Fig. 3A, 4). 요도의 점막, 평활근 및 염색으로 조직 내 평활근 성분과 콜라겐 성분의 변화를 알 혈관에서도 enos의 발현은 C군에 비해 O군에서 의미있게 아보면, O군에서 상대적 콜라겐 성분비의 변화는 방광 및 증가하였으며, O군에 비해 H군에서 의미있게 감소하였다 요도에서 각각 121.2±12.7% 및 135.5±25.2%로 의미있게 증 (p 0.05) (Fig. 3B, 4). 가하였으며, H군에서는 95.6±15.2% 및 93.7±12.8%로 O군
536 대한비뇨기과학회지 제 49 권 제 6 호 2008 Fig. 3. Mean expression percentage of endothelial nitric oxide synthase (enos). A: bladder, B: urethra, Control: control group, Ox: oophorectomy group, HRT: hormone replacement group, *: p 0.05 vs control group, : p 0.05 vs oophorectomy group. Fig. 4. Immunoreactivity pattern for endothelial nitric oxide synthase (enos) in rat bladder and urethra. (A) control group, (B) oophorectomy group, (C) hormone replacement group (x200). 에 비해 유의한 감소를 보였으며 C군과는 차이가 없었다. 에스트로겐 수용체는 하부요로, 특히 요도 점막 및 방광 삼각부 (trigone)에 높은 농도로 존재하고, 골반저를 구성하 고 찰 는 치골미골근 (pubococcygeous muscle)에도 존재하여 다른 여러 분자 수준의 기전을 매개하여 요저장 (continence)에 복압성요실금에서 에스트로겐의 역할에 대해서는 논란 중요한 역할을 한다.1,8 Hextall과 Cardozo9는 에스트로겐의 이 있으나, 월경 중이나 임신 시에 에스트로겐과 프로겐스 하부요로에 대한 역할을 네 가지 정도로 요약하였을 때, 첫 테론의 혈중농도는 매우 유동적이며 이런 현상은 배뇨증상 번째 방광과 요도에서 세포주기를 활성화시키고, 둘째로 의 발현에 영향을 미칠 수 있으며 더 나아가 불가역적 변화 요도 점막과 괄약근에 혈류량을 증가시키고, 셋째로 요도 인 폐경에 따른 에스트로겐의 결핍도 요실금의 발현에 원 괄약근의 α-아드레날린성 수용체를 감작 (sensitization)시 인적인 요소가 된다고 하였다.7 키며, 마지막으로 요도 주위 결체조직의 대사를 자극하여
박성우ㆍ이정주 난소 절제한 백서의 방광과 요도에서 nnos 및 enos의 발현과 조직학적 변화 537 Fig. 5. Masson's trichrome staining of rat bladder and urethra (x200). (A) control group, (B) oophorectomy group, (C) hormone replacement group (x200). 는 것을 증명하였다. 노화방지를 시킬 수 있다고 하였다. 그러나 에스트로겐이 수용체를 통해 직접적인 작용으로 또한 에스트로겐은 여성 요자제에 중요한 부분인 요도벽 효과를 나타내기보다는 하부요로에서 여러 호르몬 및 신경 의 혈관 및 평활근을 증식시키고 점막의 두께 역시 증가시 전달물질 수용체들의 농도와 민감도, 그리고 신경전달물질 키며 이런 변화들이 요도내압을 유지시키는 데 중요한 역 의 대사와 같은 약리학적 상호반응에 간접적인 작용에 의 할을 한다고 하였다.2 이와 관련된 몇몇 임상연구들이 시행 해 효과를 나타낸다. 그러한 매개 기전으로 첫 번째로 되었는데, 그 결과 에스트로겐은 위약군과 비교하여 객관 NANC 신경 자극에 의한 요도이완 반응이 있는데, Rand와 적인 효과는 없었고 단지 주관적인 증상의 완화를 가져왔 10 Li 는 NANC 신경에서 NO가 분비된다고 하였으며, Bennett 11 등 은 NO가 백서의 요도이완을 일으킨다고 하였으며, 이 5 으며 이는 에스트로겐이 전체적인 삶의 질의 향상을 가져 오기 때문인 것으로 보고되고 있다.15,16 2 런 기전을 Leone 등 은 인체에서 증명하였다. Takahashi 등 이처럼 임상에서 폐경기 여성의 요실금에 에스트로겐 단 은 가토의 요도에서 호르몬보충요법시에 NOS의 감소를 증 독요법은 크게 효과를 보지 못했으나, 몇몇 연구에서 α-아 명하고 이로 인해 NO를 감소시켜 NANC 자극에 의한 요도 드레날린성 효현제인 phenylpropanolamine 등과 병용요법 이완을 억제한다고 하여 본저자들과 같은 결과를 얻었다. 시에는 효과가 인정되어 수술에 적응이 되지 않는 경한 복 12 그밖에 Al-Hijji와 Batra 는 가토에서 하부요로뿐 아니라 상 압성요실금 환자의 치료에 유용하게 쓰일 수 있다고 하였 부요로인 신장, 신우 및 요관에서도 NOS의 농도를 조사하 는데 실제로 뇌혈관 등에 대한 부작용으로 실제 사용엔 한 였는데, 방광 및 요도 등 하부요로에서만 에스트로겐 농도 계가 있어 보이고 현재 ephedrine 또는 pseudoephedrine 등의 에 따라 유의한 변화를 보였다. 약물을 이런 목적으로 사용할 수 있다.17 13 그 외 다른 기전으로 Shapiro 는 가토에서 호르몬보충요 NOS의 분획 중에 enos, nnos 및 inos가 있으며 염증이 법 시 하부요로에서 무스카린성 신경수용체가 감소한다고 없는 하부요로 조직에서 요도수축을 조절하는 데 NO의 농 하였으며, Larsson 등14은 가토의 요도에서 후신경접합부 α2- 도는 주로 enos 및 nnos가 주역할을 한다.18 본 연구에서 아드레날린성 수용체의 수를 증가시켜 가토의 요도에서 α nnos는 방광 및 요도의 평활근에 가장 많이 분포하였으며 2-아드레날린성 신경자극에 의한 요도수축을 증가시킨다 enos는 혈관 외에 방광의 점막에 높은 농도를 보였다. 그
538 대한비뇨기과학회지 : 제 49 권제 6 호 2008 리고, 난소절제한백서의요도조직내에서는 nnos 및 enos의발현이유의하게증가되고호르몬보충시에는감소되었다. 즉, 요도조직내 NO는난소절제시증가되고에스트로겐보충시에감소하여요도이완을감소시키게될것이다. 방광입구폐색모델에서증명되었듯이감염이나염증등의스트레스를방광에주었을때가장먼저증가하는것은 inducible NOS (inos) 이며, 이후 nnos 및 enos가동반되어변화하여조직내의 NO의분포를변화시키게된다. Chertin 등 19 에의하면방광입구폐색동물모델에서초기에 inos의증가를보여혈류의증가를조장하고 12주가지난후에는 nnos 및 enos가증가하여이형성된세포의고사를조장한다고하였다. 즉, 저자들의실험모델은약 2주간의비교적짧은실험기간과 inos 및세포고사를측정하지않아이러한연관성을증명하기에는미흡하지만방광의점막과평활근에서는각군별로의미있는변화를관찰하지못했으나, 혈관에만은의미있는변화를보인것은일차적인혈류량의증가를위해나타난변화라고생각되며, 기존의가설가같은맥락이라고볼수있을것이다. 특히체내 estrogen 의변화에따른혈류량의변화에있어 NO가중요한역할을한다는것은증명되어져있으며, 나아가방광의수축력이나방광내압에도변화를시킬수있다고하였다. 20 요도에서는 α1 수용체를통한아드레날린성자극및콜린성자극을통한요도의수축이일어나며, 반대로 NO를통한이완이일어난다. 즉, 난소절제후요도의점막및평활근에증가하는 NO는요도의이완을증가시키며, 나아가 nnos와 enos의증가로세포고사의증가를도모하여요도의위축이발생하게될것이다. 즉, 수축력및탄력성이감소하는요도의위축이발생하여요실금이발생할수있는조건을만들게되는것이다. 결론난소절제한백서모델에서증가하였던요도조직내 nnos 및 enos의발현율은에스트로겐보충요법으로감소하였으나, 방광조직내에서는혈관에서만이러한변화가관찰되었다. 그리고, 난소절제후에스트로겐보충요법으로방광및요도조직내증가하였던콜라겐은감소, 감소하였던평활근은다시증가하였다. 폐경으로인해요도의조직은위축되는양상을보이고, 수축력은감소하여, 요실금발생을증가시키는조건으로변화하게된다고할수있을것이다. 그러나이러한변화는호르몬요법으로인해감소시킬수있을것이라생각한다. REFERENCES 1. Iosif CS, Bekassy Z, Rydhstrom H. Prevalence of urinary incontinence in middle-aged women. Int J Gynaecol Obstet 1988;26:255-9 2. Takahashi W, Yoshida M, Wada Y, Goto S, Inadome A, Yono M, et al. Effect of estrogen on nitric oxide-induced relaxation of the rabbit urethra. Eur J Pharmacol 1997;339:165-71 3. Dokita S, Morgan WR, Wheeler MA, Yoshida M, Latifpour J, Weiss RM. NG-nitro-L-arginine inhibits non-adrenergic, non-cholinergic relaxation in rabbit urethral smooth muscle. Life Sci 1991;48:2429-36 4. Hashimoto S, Kigoshi S, Muramatsu I. Nitric oxide-dependent and -independent neurogenic relaxation of isolated dog urethra. Eur J Pharmacol 1993;231:209-14 5. Leone AM, Wiklund NP, Hokfelt T, Brundin L, Moncada S. Release of nitric oxide by nerve stimulation in the human urogenital tract. Neuroreport 1994;5:733-6 6. Yallampalli C, Byam-Smith M, Nelson SO, Garfield RE. Steroid hormones modulate the production of nitric oxide and cgmp in the rat uterus. Endocrinology 1994;134:1971-4 7. Hextall A. Oestrogens and lower urinary tract function. Maturitas 2000;36:83-92 8. Ingelman-Sundberg A, Rosen J, Gustafsson SA, Carlstrom K. Cytosol estrogen receptors in the urogenital tissues in stressincontinent women. Acta Obstet Gynecol Scand 1981;60:585-6 9. Hextall A, Cardozo L. The role of estrogen supplementation in lower urinary tract dysfunction. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct 2001;12:258-61 10. Rand MJ, Li CG. Discrimination by the NO-trapping agent, carboxy-ptio, between NO and the nitrergic transmitter but not between NO and EDRF. Br J Pharmacol 1995;116:1906-10 11. Bennett BC, Kruse MN, Roppolo JR, Flood HD, Fraser M, de Groat WC. Neural control of urethral outlet activity in vivo: role of nitric oxide. J Urol 1995;153:2004-9 12. Al-Hijji J, Batra S. Downregulation by estrogen of nitric oxide synthase activity in the female rabbit lower urinary tract. Urology 1999;53:637-41 13. Shapiro E. Effect of estrogens on the weight and muscarinic cholinergic receptor density of the rabbit bladder and urethra. J Urol 1986;135:1084-7 14. Larsson B, Andersson KE, Batra S, Mattiasson A, Sjogren C. Effects of estradiol on norepinephrine-induced contraction, alpha adrenoceptor number and norepinephrine content in the female rabbit urethra. J Pharmacol Exp Ther 1984;229:557-63 15. Fantl JA, Wyman JF, Anderson RL, Matt DW, Bump RC. Postmenopausal urinary incontinence: comparison between non-estrogen-supplemented and estrogen-supplemented women. Obstet Gynecol 1988;71:823-8 16. Jackson S, Shepherd A, Brookes S, Abrams P. The effect of
박성우ㆍ이정주 : 난소절제한백서의방광과요도에서 nnos 및 enos 의발현과조직학적변화 539 oestrogen supplementation on post-menopausal urinary stress incontinence: a double-blind placebo-controlled trial. Br J Obstet Gynaecol 1999;106:711-8 17. Beisland HO, Fossberg E, Moer A, Sander S. Urethral sphincteric insufficiency in postmenopausal females: treatment with phenylpropanolamine and estriol separately and in combination. A urodynamic and clinical evaluation. Urol Int 1984;39:211-6 18. Ho MH, Bhatia NN, Khorram O. Physiologic role of nitric oxide and nitric oxide synthase in female lower urinary tract. Curr Opin Obstet Gynecol 2004;16:423-9 19. Chertin B, Rolle U, Solari V, Cascio S, Puri P. The role of nitric oxide in bladder urothelial injury after bladder outlet obstruction. BJU Int 2004;94:392-9 20. Aikawa K, Chichester P, Whitbeck C, Levin RM. Effect of nitric oxide synthase inhibition on changes induced by estradiol in bladders from ovariectomized rabbits. Urol Int 2005;75:133-8