질산화단백질의질량분석 김광표 http://dx.doi.org/10.7599/hmr.2013.33.2.110 pissn 1738-429X eissn 2234-4446 건국대학교분자생명공학과 Mass Spectrometry Analysis for Nitration of Proteins Kwang Pyo Kim Department of Molecular Biotechnology, Konkuk University, Seoul, Korea Various proteomics and immunological methods including mass spectrometry combined with both liquid and 2-D PAGE, and immunodetection have been employed to identify and characterize nitrated proteins from pathological samples. Nitrosative modifications regulate cellular signal transduction and pathogenesis of inflammatory responses and neurodegenerative diseases. Nitric oxide generates reactive nitrosative species, such as peroxynitrite (ONOO - ) that may be involved in a number of diseases. ONOO - can mediate protein tyrosine nitration which causes structural changes of affected proteins and leads to their inactivation. Protein tyrosine nitration is a biomarker of oxidative stress and also influences protein structure and function. Recent advances in mass spectrometry have made it possible to identify modified proteins and specific modified amino acid residues. This review focuses on the significance of protein tyrosine nitration and the progress achieved in analytical methods. Although mass spectrometry of nitrated peptides has become a powerful tool for the analysis of nitrated peptides, the low stoichiometry of protein tyrosine nitration clearly demands the use of affinity chromatography to enrich modified proteins (or peptides). Key Words: Proteomics; Mass Spectrometry; Nitric Oxide; Nitration; Chromatography, Affinity Correspondence to: Kwang Pyo Kim 우 143-701, 서울시광진구능동로 120, 건국대학교생명환경과학대학 520 호 520-ho, College of Life and Environmental Sciences, Konkuk University, 120 Neungdong-ro, Gwangjin-gu, Seoul 143-701, Korea Tel: +82-2-458-7682 Fax: +82-2-2049-6051 E-mail: kpkim@konkuk.ac.kr Received 18 March 2013 Revised 20 April 2013 Accepted 24 April 2013 This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 서론단백질의질산화 (protein tyrosine nitration) 는생체내의활성질소에의해단백질에일어나는번역후수식 (post-translational modification) 과정중하나로단백질의구조, 활성, 친수성, 단백질간결합력등을변화시키면서단백질의기능을조절하는중요한역할을한다 [1,2]. 단백질의질산화는단백질의타이로신잔기에선택적으로수식되며, 산화적스트레스와염증반응에의해생성되는활성산소와질산화시약 (peroxinitrite; tetranitromethane, TNM) 에의해생성된과산화아질산염에의해서발생한다고알려져있다. 이러한단백질의질산화와관련하여서사람에게서는암, 치매, 파킨슨병을비롯한 60개가넘는질병과연관되어있다는것이질산화특이 (NO 2-Tyr specific) 항체를이용한항체기반분석법을통하여연구되어밝혀졌다. 대부분이러한연구들은용해된단백질, 혈액단백질로부터의단백질의질산화를정량, 관찰을통해이루어졌지만, 단백질의질산화가특정환경에노출된타이로신에서만제한적으로일어나는번역후수식과정인지, 무작위로발생하는이벤트인지에대한연구는이루어지지못했다. 이것은단백질의번역후수식의연구에서항체를이용한방법이항상부딪히는한계점이기때문에수식이일어난특정한아미노산을손쉽게밝혀낼수있는새로운분석방법이필요했다. 질량분석법 (mass spectrometry, MS) 은단백질의번역후수식 110 2013 Hanyang University College of Medicine http://www.e-hmr.org
김광표 질산화단백질의질량분석 Antibody based approach Western blot Dot-blot Immunohistochemistry Immunoprecipitation 분석에서전통적방법이가지는한계점을해결해줄것이라생각되 는중요한기술이다. 크게두가지 1) matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI), 2) electronspray ionization (ESI) 의이 온화방식을가지며 MALDI 는주로 time-of-flight (TOF) 방식의 분석기와 ESI 방식은다양한종류의분석기와결합하여사용된다. 특히액체크로마토그라피법 (LC) 과결합된 ESI-tandem MS (MS/ MS) 방법은단백질에서얻어진펩티드 (peptide) 혼합물의분리와 펩티드의아미노산서열결정에최적화된방법으로단백질의번역 후수식분석을위해널리사용되고있는방법이다. 여기에서는 MS 를이용한다양한단백질의질산화분석방법들과결과에대하여 설명하고최근의연구동향에대하여기술하였다 (Fig. 1). 1. 단백질의질산화 OH NO2 Analysis of protein tyrosine nitration (PTN) Fig. 1. This paper describes the analysis of PTN. Typical methods for the analysis are divided into antibody based approach and massspectrometry based approach. MALDI, Matrix-assisted laser desorption/ionization; LC-MS/MS, Liquid chromatography-tandem mass spectrometry. 본론 단백질의질산화는생체내에서의활성질소종 (reactive nitrogen species, RNS) 과활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 의 결합반응에의해생긴다. RNS 에는일산화질소 (nitrogen monoxide, NO), 이산화질소 (nitrogen dioxide, NO 2), 사산화이질소 (dinitrogen tetroxide, N 2O 4), 그리고과산화아질산염 (peroxinitrite, ONOO - ) 등이존재한다. 이중에서 NO 는생체내에서심혈관계에 서의중요한신호전달분자이면서동시에세포자멸사 (apoptosis), 면역반응등에관여한다 [3]. NO 는 L- 아르지닌 (L-arginine) 이 nitric oxide synthase (NOS) 효소에의해 L- 시트룰린 (L-citrulline) 으 로변환하는과정중에형성되며, 이때주위에존재하는산소와의 결합으로 NO 2, 과산화아질산염등의질소화합물을만들어낸다. NO 로부터생성된이차질소화합물은 super oxide radical (O 2 ), 과산화수소 (H 2O 2) 에의해반응성이높은유리기형태의이산화질 소 (NO 2 ) 로존재하게되며이것들이단백질의타이로신잔기에화 학적으로결합하여단백질의질산화를촉진한다. Mass-spectrometry based approach MALDI-MS LC-MS/MS +Advanced enrichment method 2 전통적방법에서의단백질의질산화연구 1) 면역탁본법 (immunoblotting) 항체를이용한면역탁본법의경우높은수준의민감도를가지는방법으로단백질의질산화의연구에널리사용된방법으로점블럿 (dot-blot), 웨스턴블럿 (western-blot) 등이면역침전 (immunoprecipitation, IP) 과함께사용되어왔다. 점블럿을사용하여세포, 조직에서생성된전체단백질의질산화의양을비교할수있으며, 동일한조건에서동일한양의단백질을멤브레인에부착한후질산화특이항체를이용하여밴드의강도를측정하여비교한다. 그이후동일한멤브레인에대하여강력한환원제인 dithionite (DTT) 를처리한후다시한번점블럿을하여항체에대한샘플의배경신호를통해보정을하는방법이주로사용된다. 웨스턴블럿기법은주로면역침전과같이사용되며, 샘플에서질산화특이항체를이용하여면역침전을수행한다. 또한단백질의질산화를포함하는단백질을높은수준으로분리하여 SDS-PAGE 젤에분리한후질산화특이항체와타겟단백질항체에대하여각각웨스턴블럿하며, 타겟단백질위치의밴드강도를통하여발현양을확인한다 [4]. 실험에따라서타겟단백질에대하여먼저면역침전을수행하고그이후에질산화특이항체에대하여웨스턴블럿을수행하기도한다. 2) 면역조직화학 (immunohistochemistry) 질산화단백질의위치를확인하기위한방법으로사용되는면역조직화학방법은항원-항체를이용한염색방법으로, 보고자하는신선한조직을분리한후포르말린 (formalin) 등을이용하여고정시킨후파라핀에고정된조직시료위에질산화특이항체를직접붙여확인한다. 면역조직염색법에의해염색된부분역시항체에의한배경신호에의한간섭이심하므로, 같은조직에서의다른부위에서 DTT를이용하여 NH 2-Tyr 형태로바꾼후동일하게질산화특이항체로배경신호를확인하여야한다. 3. 질량분석기를이용한단백질질산화연구 1) Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) 은 ESI와함께단백질의분석에널리사용되고있는이온화방법의하나이다 [5]. 시료를벤젠 (benzene) 고리를가진매트릭스 (matrix) 와일정비율로혼합한뒤레이져를방출하면매트릭스가레이져의광자를흡수하는안테나역할을하여레이져를맞은부분의온도가급격히상승해이온화되며탈착되어이온이분석관으로진입하게된다 [6]. MALDI는일반적으로 time-of-flight (TOF) 분석관과함께사용하게되는데, 이는분자의크기 ( 질량 ) 에따라비행시간이차이가나는점을이용한것이다. MALDI-TOF 질량분석기를이용한단백질의질산화분석은 http://www.e-hmr.org 111
Kwang Pyo Kim Mass Spectrometry Analysis for Nitration of Proteins ESI 방법을사용한분석에비해그횟수가비교적적은편이다. 그이유는복잡한시료로부터단백질의단백질의번역후수식을연구하는데있어서 MALDI 이온화방법이비효율적인것에기인하는데, ESI 방법에비해서 MS/MS를통한펩티드의서열분석이쉽지않고, 다양한중성소실신호 (neutral loss peak) 들이생성되며, 매트릭스에의한편차가생기는등의문제점이발생하게된다. 예를들어, MALDI-TOF 질량분석기를사용하여단백질의질산화를분석하게되면, nitrotyrosine (M + H + NO 2) 이외에도 nitrosotyrosine (M + H + NO), aminotyrosine (M + H + NH 2), nitrenetyrosine (M + H + N) 과같은다양한중성소실에해당하는신호들로보이게된다 [7]. 위에서언급한것과같은중성소실신호들은 MAL- DI-TOF 질량분석기를사용한대부분의연구들에서찾아볼수있는데 [8,9], Sarver는액체크로마토그라피로분리한질산화된 bovine serum albumin (BSA) 으로부터단백질의다양한중성소실신호들을 MALDI-TOF 질량분석기를사용하여동정하였고, 이를토대로합성된펩티드를사용해중성소실이발생하는전체적인구조를제시하였다. 특이한점은시료의농도가낮아짐에따라 nitrotyrosine을포함하는신호의상대적크기는감소하지만, aminotyrosine, nitrosotyrosine 을포함하는신호들의상대적크기는비교적일정하게유지되는것을보여주었다 [10]. 또한 MALDI 이온화방법에서는반드시매트릭스를사용하게되는데, 질산화된단백질이 MALDI-TOF 질량분석기에서광분해될때는매트릭스들의 pka 값에의존하게된다. 예를들어, α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 나 dihydroxybenzoic acid (DHB) 와같은산성을띠고있는매트릭스를사용하게매트릭스분자들이파편화되면서매트릭스분자들의파편과분자량영역이겹치는 nitrotyrosine (M + H + NO 2) 신호는정확하게볼수없게되는경우가발생하게된다 [11]. 반면, 중성을띄고있는 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) 를사용하게되면산성인매트릭스를사용했을때보다더적은수의파편화가일어나게된다 [12]. MALDI-TOF 질량분석기를사용해단백질의질산화를분석하는연구에서는거의모든경우에 CHCA를매트릭스로사용하고있다. 이외에도 500 이하의 m/z를갖는펩티드의경우매트릭스신호와겹치는문제점이발생하게되는데, Salavej의연구에서는매트릭스신호와겹치는부분들을배제하고자 400 이상의 m/z를갖는신호들만분석에포함하였다 [13]. 이런다양한문제점들을해결하기위해최근에는 IR-MALDI, UV- MALDI, PD-MAL DI와같은다른방법들을사용하여단백질의질산화분석을시도하고자하는연구도진행되고있다 [14]. 위에서언급한단점들에도불구하고 MALDI-TOF 질량분석기를사용한단백질의질산화연구는계속해서증가하고있는데, 이는 MALDI-TOF 질량분석기가 ESI 방식의질량분석기에비해서시간과비용적인측면에서큰강점을가지기때문이다. MALDI- TOF 질량분석기는단시간에많은질량분석스펙트럼 (MS spectrum) 을얻게되고, 한번준비된시료는반복해서분석이가능하기때문에시간을절약할수있게된다. 최근에도많은연구팀들이앞서언급했던문제점들을피하고빠른분석을수행하기위해서다양한연구들을진행하고있다. Butt는 MALDI-TOF 를사용한단백질의질산화분석에서주의해야할점들을제시하였다. 먼저, MALDI-TOF 질량분석기의분석한계가 50 fmole 정도이기때문에, 분리과정이선행되어야하며케라틴 (keratin) 과같은단백질의오염을극도로주의해야하고, 이를위해시료는물론이고시약과버퍼등실험에사용하는모든것들의순도를최고수준으로유지해야한다고주장하였다. 또한, 단백질의질산화분석에있어 MAL- DI-TOF 를사용할때는분자량의범위가 1,000-3,000 (Da) 정도가적당하다고제시하였다 [15]. 최근에는 MALDI-TOF 질량분석기를사용한단백질의질산화분석에있어거의모든연구에서액체크로마토그라피, 혹은면역침전과같은방법으로분석하고자하는시료의분리가선행되고있다. 이는다음장에서언급하게될단백질의질산화농축 (enrichment) 방법개발과도같은맥락에서이해할수있는데, 단백질의질산화는생체내에서약 1/10,000-1/50,000 정도로매우적은양으로존재하기때문에이를복잡한시료내에서그대로찾아내기란쉬운일이아니다 [16]. 따라서많은연구자들이이를극복할수있는방법을개발하거나혹은질량분석기를사용한분석에들어가기에앞서다양한방법들로시료를분리해내어분석하고있다. 단백질의질산화분석에서 MALDI-TOF 질량분석기는주로펩티드화하지않은단백질의동정혹은 in vitro nitration 과같은실험결과의확인에중점적으로이용되고있다. 많은연구에서단백질을펩티드화하지않고동정하였는데, Yoon 의연구에서는 HT22 세포를 2D 전기영동방법으로분리한뒤 MALDI-TOF 질량분석기로단백질만을동정하였다 [17]. 또한, Cappelletti 의연구에서는 PC12 세포를사용해 MALDI-TOF 질량분석기로단백질을동정한뒤에, 동정된단백질을이용하여생물학적인분석을수행하였다 [18]. 마찬가지로, Reed와 Castegna의연구에서도대뇌피질두정엽 (inferior parietal lobule brain) 을사용하여 MALDI-TOF 질량분석기로각각 8개, 6개의단백질을동정하여생물학적인분석에사용하였다 [19,20]. 비록그횟수는적지만, MALDI-TOF 질량분석기와 ESI 방식의질량분석기를모두사용하여단백질의질산화를분석한연구들도보고되고있는데, Kanski의연구에서는마우스의골격근 (skeletal muscle) 을 2D 전기영동방법으로분리한뒤 MALDI-TOF 질량분석기로단백질을동정하였으며, 이후단백질을펩티드화하여 ESI 방식의질량분석기로펩티드를분석하였다 [21]. 이외에도 Salzano 는 BSA를인공적으로나이트레이션 (in vitro nitration) 시킨뒤에 MALDI-TOF 질량분석기로동정하고, ESI 방식의질량분석기로펩티드지문추적법 (peptide finger printing) 을수행하였다 [22]. 112 http://www.e-hmr.org
김광표 질산화단백질의질량분석 위와같이, MALDI-TOF 질량분석기를사용한분석들에힘입어최근에는이들을응용하여복잡한시료로부터질산화된단백질을분석하는연구들도증가하고있다. Fiore 와 Sultana는각각신경교종 (gliomas) 뇌와해마로부터질산화단백질을동정하였다 [23, 24]. 또한, Zhan의연구에서는흡연자들의기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid) 으로부터질산화단백질을동정하였고, 이를통하여흡연과연관된염증폐질환 (inflamatory pulmonary disease) 의생물학적인경로를예측하여제시하였다 [25]. 이외에도질산화가진행된펩티드에대한삼중탠덤매스 (MS/ MS/MS) 실험 [26], 질산화그룹의환원과관련된검증실험 [27], 미토콘드리아단백질의탈질산화실험 [28], 그리고질산화위치의 mapping 실험 [29] 등다양한단백질의질산화연구에서 MALDI- TOF 질량분석기가사용되고있다. 2) 액체크로마토그라피-탠덤매스분석 (LC-MS/MS) 질량분석기와액체크로마토그라피를결합하여사용하는액체크로마토그라피 -탠덤매스분석은단백체학 (proteomics) 과대사체학 (metabolomics) 등의여러연구분야에널리사용되는방법이다. 액체크로마토그라피분석법에서는분석하는물질의크기 (size exclusion), 극성 (ion exchange), 소수성 (reversed phase) 등의성질로분리가가능한컬럼 (column) 을이용하여분석물질을순수하게분리하며, 이것은세포, 조직, 기관에서유래한단백체, 펩티드분자들의복잡성을감소시킴으로써더많은단백체, 펩티드의동정을가능하게한다. LC를결합한 MS의경우 ESI 방식의이온화방식과도쉽게결합할수있다는장점이있는데, ESI는단백질의번역후수식의분석에서 MALDI 방식에비해중성소실이더적게나타나며탠덤매스분석 (tandem mass, MS/MS) 이용이하다. 그렇기때문에액체크로마토그라피 -탠덤매스분석을이용한단백질의번역후수식분석은펩티드단위에서의단백질의번역후수식위치를동정하는데유리하며, MALDI에비해높은재현성으로다양한정량방법을적용할수있어인산화, 당쇄화등의분석에적용되고있다. 단백질의질산화분석에서의경우생체내에서의적은양때문에질산화시약의처리후단백질의질산화가일어나는아미노산자리를확인하는경우가많다. Ducrocq의경우액체크로마토그라피 -탠덤매스분석을이용하여다양한종류의 nitration agent (peroxinitrite, HNO 2) 를처리한안지오텐신 II (angiotensinii) 의질산화자리를분석, 안지오텐신 II의활성변화와질산화사이의관계를설명하였다 [30]. Retention time (RT) 은액체크로마토그라피의분리후분자에대한스펙트럼신호가나타나는시간을의미하며, 각펩티드분자들의성질에따라고유의 RT를갖는다. 단백질의번역후수식을분석하는단백질체학의실험에서는일반적으로역상 (reverse-phase) 크로마토그래피방식의 C-18 column을이용하여펩티드분석을 수행하며, 이때질산화단백질이포함된펩티드의경우일반적으로나이트로그룹 (-NO 2 group) 의화학적성질때문에친수성 (hydrophilicity) 이감소하기때문에수식이일어나지않은펩티드에비해 0.5-2 min 정도늦게 RT이형성되는특징을보인다.. 3) 탠덤매스분석 (tandem mass spectrometry) 질량분석기를이용한단백질의번역후수식분석이가장강력한분석방법으로떠오르는이유중하나는단백질에서단백질의번역후수식이발생하는아미노산을특정 (mapping) 할수있다는점이다. 질량분석기에서의탠덤매스분석방법은펩티드이온을특정기체상태 (gas-phase) 에서절편화하는방식을말하며, 여기에서절편화되어나오는신호피크간의질량차를각아미노산의질량값과또는특정아미노산에대한수식이포함된아미노산질량값과비교하여이미가지고있는단백질의아미노산서열데이터베이스와비교함으로써펩티드의아미노산서열과수식화된위치를알수있다. 여기에서펩티드가절편화되는방식은사용되는방법에따라 collision-induced dissociation (CID), electron-capture dissociation (ECD), electron-transfer dissociation (ETD) 등으로구분이될수있다. 일반적으로사용되는절편화방식은 CID 방식으로절편화하기위한펩티드이온을비활성기체 (argon, helium, nitrogen gas) 와함께가둔후강력한에너지로펩티드이온을들뜬상태로만들면이온간의충돌로절편화가진행된다. 하지만 CID 방식의절편화에서는펩티드골격보다는수식화된작용기를더잘절편화시키는경향을보인다. 이러한경향은결국펩티드의아미노산서열을유추하는데약점을가지게된다 [31]. 1998년 Mc Lafferty가처음소개한 ECD 방식의절편화방법은 FT-ICR-MS 에서펩티드골격을더효율적으로절편화시킨다는것을증명하였다 [32]. ECD 는전자총 (electron gun) 으로부터생성되는전자에너지를통해펩티드의 N-Cα 골격을자르며그결과로 c-/z- type의이온들을형성한다. Hunt에의해소개된 ETD는 ECD와마찬가지로펩티드골격을자르는경향을보이지만 C-N 골격을자르며 b-/y- type의 ions을형성하는절편화방식이다. 그러나단백질의번역후수식분석에서질산화단백질의경우 ECD를통한절편화생성이잘안된다는결과들이있다 [33,34]. 4. 최근의단백질의질산화연구동향 1) 질산화된펩티드농축 (enrichment) 방법을사용한단백질의질산화분석앞서언급한바와같이, 단백질의질산화는생체내에서매우극소량으로일어나기때문에, 이를분리혹은농축하지않고는질산화된펩티드의분석은사실상불가능하다. 그렇기때문에많은연구진들이질산화된펩티드만을선택적으로획득할수있는방법을개발하고있다. 질산화된펩티드의선택적인획득에는면역침전과 http://www.e-hmr.org 113
Kwang Pyo Kim Mass Spectrometry Analysis for Nitration of Proteins 같이항체를사용하여질산화된펩티드만을선택적으로잡아내는방법과질산화된펩티드에친화표지를부착한뒤친화표지가부착된시료만을선택적으로잡아내는친화크로마토그라피 (affinity chromatography) 방법이일반적으로사용되고있다. Murad는당뇨마우스심장으로부터분리한미토콘드리아에과산화아질산염을처리한후질산화특이항체를이용하여면역침전을수행하였다. 전체단백체를 2DE gel을통해분리한후질산화특이항체를이용하여웨스턴블럿을수행하여질산화가일어난단백질을검출한후, 그부분만을잘라내서 in-gel digestion 하여펩티드화시켰다. MALDI-TOF 를이용하여결국 10종의활성질소단백질을동정하였다 [35]. Desiderio 의실험에서는사람의뇌하수체종양조직 (human pituitary adenoma tissue) 에서의단백질로부터질산화특이항체를이용한질산화타이로신친화컬럼 (nitrotyrosine affinity column, NTAC) 을개발하여생체내의질산화단백질을선택적으로농축한후, MALDI-LTQ 를이용하여분석하여, 총 9개의활성질소단백질을동정하였고, 탠덤매스분석을통하여 NO 2 잔기가결합된타이로신자리를확인하여모두단백질의활성화부위에존재한다는것을확인하였다. 그리고질산화가일어난것으로밝혀진 3개의단백질을추가로동정하였다 [36]. 질량분석기를이용한단백질의번역후수식의연구에는다양한농축방법들이사용되는데, 아세틸화, 인산화그리고당화등의분석을위해다양한농축방법이개발되고, 실제생체시료내의단백질의번역후수식연구에유용하게사용되고있다. 하지만, 이에비해서단백질의질산화에대한선택적인농축방법은많은연구가되고있지만실제로생체시료에서활용되고있는방법은거의없는것이현실이다. 이는다른단백질의번역후수식들에비해서단백질의질산화에의한변형이특이적으로더욱극소량으로존재하기때문이기도하지만, 일반적으로사용되는화학적변형에의한농축방법을적용하기에는 -NO 2 잔기가매우좋지못한화학적반응성을갖기때문이다. 따라서단백질의질산화를분석하기위한농축방법에는 -NO 2 잔기를아민으로환원시키는과정이대부분포함되며이는시료의손실을증가시켜분석을어렵게하는요인의하나로작용하게된다. 단백질에친화적인친화표지를사용하는선택적인농축방법은생체내에서소량으로존재하는단백질의번역후수식들의분석에가장일반적으로사용되는방법이다. 이방법은단백질의질산화에친화적인친화표지를붙여줌으로써이후질량분석기등으로분석할때, 친화표지가붙은단백질만을선택적으로잡아내어분석이수월하게해준다. 현재까지개발된방법은모두동일한방법으로접근하고있으며, 다만최종적으로반응시키게되는친화표지만서로다른종류를사용하고있다. 이종류의농축방법은 -NO 2 잔기의화학적반응성이낮기때문에 -NO 2 잔기를아민으로환원시켜주는과정이모두포함되어있으며, 이과정에서는 sodium dithionite (Na 2S 2O 4) 가주로사용된다. 또한, -NO 2 잔기를아민으로환원시키기에앞서기존의펩티드에존재하고있는아민, 즉, lysine 과 N-말단에있는아민을아세틸화혹은메틸화과정을통하여막아주게된다. 이는이후반응시키는친화표지들이모두아민과반응하기때문에, 순수하게단백질의질산화로부터의변형으로환원된아민들에만친화표지를붙여주기위해서기존에존재하는아민들의반응성을모두제거하는데그의미가있다. 2003년 Nikov는 biotin-avidin 상호작용을응용하여, sulfo-nhs-ss-biotin 을사용해질산화가일어난단백질들을특이적으로잡아내는농축방법을개발하였다 [37]. 이방법은 ph 5 환경에서정상적으로반응할수있게되며, biotin-avidin 상호작용을통해선택적으로단백질을추출한이후에는 dithiothreitol (DTT) 을사용하여이중황결합 (disulfide bond) 을끊어줌으로써순수한질산화단백질만을얻을수있다. Nikov는이방법을인간혈청알부민 (human serum albumin, HSA) 에적용하였으며, 1개의질산화단백질을동정하였다. 이와동일한방법으로 Abello는소혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA) 과안지오텐신 II에서질산화단백질을분석하였다 [38]. 또한, Smith 연구팀에서는 N-succinimidyl S-acetylthioacetate (SATA) 를사용하여질산화단백질을농축하는방법을개발하였는데, 아민으로환원된부분에 SATA 친화표지를부착한뒤, thiopropylsepharose 비드와반응시켜친화표지가붙은단백질만을선택적으로추출해내었다. 이후추출된단백질들은 DTT를사용하여이중황결합을끊어줌으로써비드와분리되고, 알킬레이션 (alkylation) 과정을거쳐최종적으로추출되게된다. 이방법은 BSA에서시험을거친뒤히스톤과마우스의뇌에서활용되었으며, 각각 3개와 102개의질산화단백질을동정하였다 [39]. Prokai-Tatrai는 solid-phase active ester reagent (SPAER) 라고명명한질산화단백질의농축방법을보고하였는데, 이는 succinimidyl-4-formylbenzoate와반응시킨고체상태의하이드라자이드비드를환원된아민에붙이고, trifluoro acetic acid (TFA) 와같이수소이온을발생시키는시약을통해가수분해하여비드를떨어뜨려질산화단백질만을선택적으로추출해내는방법이다 [40]. Prokai-Tatrai 는이방법을혈장에적용하였으며, 총 12개의질산화단백질을동정해내었다. 이외에도 Kim의연구팀에서는 2009년과 2011 년 2개의농축방법을각각보고하였는데, 쉬프베이스 (schiff base) 를사용한방법과 [41] 불화탄소 (fluorinated carbon) 친화표지를사용한방법이다 [42]. 두방법모두질산화단백질로부터환원된아민에친화표지를붙이게되는데, 쉬프베이스방법은시료를 pyridine-2-carboxaldehyde 와반응시켜 bispyridinylated 형태로만들어준뒤 Ni 2+ - NTA magnetic agarose bead를사용하여잡아내는것이다. 반면, 불화탄소친화표지를사용한방법은시료를 N-succinimidyl 3- perfluorobutyl propionate 와반응시킨뒤불소화 (fluorous) 비드에통과시켜불소-불소 (fluorine-fluorine) 상호작용을통해친화표지 114 http://www.e-hmr.org
김광표 질산화단백질의질량분석 가붙은단백질만을선택적으로추출해내는방법이다. 두방법은각각 BSA와 huh7세포에적용되어서 1개와 28개의질산화단백질을동정하였다. 특이적으로, 쉬프베이스방법만이위에서언급한모든방법들중에유일하게 MALDI-TOF 질량분석기로분석되었는데, 쉬프베이스형태의친화표지가 ESI 방식의질량분석기에서이온화가잘되지않는문제로인하여 MALDI-TOF 질량분석기를사용하였다. 질산화가일어난단백질에화학적변형을일으켜이들을추출하는방법은또한정량분석에강점을가지고있다. 현재까지의질산화정도에대한정량은항체를이용한면역반응이대부분을차지하고있다. 이들은일반적으로사용되는정량방법이지만, 그정확한양을알수없고두개의정량성이비슷한경우판별이쉽지않으며, 비특이적인단백질의결합에대해배경신호 (background signal) 가발생할수있다는단점이있다. 반면에화학적인변형을사용하여질산화단백질을분석하게되면, 그들각각의화학적인성질에따라서선택적인분석이가능해지는장점이있다. 이방법은과거부터종종보고되어왔는데, Crowley는 1998년질산화단백질의 -NO 2 잔기를 n-propyl carboxylic acid ester와 heptafluorobutyric anhydride 용액에서반응시켜 fluoroacylated 형태로바꾸어주고이를기체크로마토그라피 -MS로분석, 정량곡선을작성하여정량성이나타남을발표하였다 [43]. Gevaert는단백질에변형이일어나면액체크로마토그라피에서방출되는시간에차이가생기는점을이용하여 combined fractional diagonal chromatography (CO- FRADIC) 로명명된방법을개발하였다 [44]. 이방법은시료를여러개의분획으로나눠준다음특정한화학적변형을일으켜변형이되지않은시료와변형된시료를서로다른 RT에나누어받음으로써두종류의시료를분리한뒤에분석하는방법으로, 이후 Ghesquiere와 Larsen의연구에서도동일한방법으로응용되었다 [44, 45]. 특히, Ghesquiere 는 peroxynitrite 를사용하여강제로질산화시킨 jurkat세포에서총 267개의질산화단백질을동정함으로써가장많은수의단백질을동정하였다. 위와같이최근까지도다양한질산화단백질의농축기술은개발되고있지만생체내에서의워낙적은양으로인해생체시료에서는적용하기가어려워아직도많은경우질산화시약을처리하여실험을진행하거나 nitrotyrosine 모델시스템을만들어확인을하는것이대부분이다. 2) 질산화단백질의정량잘알려져있는인산화와같은단백질의전사후수식은우리생체내에서중요한신호전달물질로서작용을하며인산화의양에따라생체내단백질의활성을결정짓는중요한요소이다. 그렇기때문에단백질의번역후수식의정량또한분석에서매우중요한요소를차지한다. 질산화단백질의정량법은전통적분석방법인항체기반분석법으로질산화특이항체를이용하여밴드의세기를측정하는것에서부터발전하였으며, 주로 NO 2 에특이적으로결합할수있는친화표지등을이용하여정량을하였다. Sharov는 4-aminomethylbenzene sulfonic acid (ABS) 와 potassium ferricyanide (K 3Fe[CN] 6) 를반복시켜 NO 2 잔기에반응시킴으로써형광을나타내는친화표지를붙여주고, 형광스펙트로스코피 (fluorescent spectroscopy) 를사용하여정량하는실험을발표하였다 [46]. 이방법은복잡한혼합물에서적용되었고, 10 pmol 까지의정량한계를결과로보여주었다. 이와비슷한방법으로, Wisastra는 salicylaldehyde 와 aluminum chrolide 를시료에함께처리하여 NO 2 잔기를형광에반응하는물질로변형시켜준뒤 359 nm와 475 nm의형광에서정량비교를실험하였다 [47]. 계속해서언급되지만질산화단백질의정량은생체내의적은양때문에직접적인정량이매우힘들다. 이전의많은연구에서질산화단백질의정량은항체기반단백질검출방법 (dot-blot, western blot, ELISA 등 ) 을이용하여수행하였고, 민감도가높은항체기반실험방법의특성상전체질산화단백질의양적차이에관한충분한정보는제공할수있다. 그러나단백질의질산화에의하여발생하는여러신호전달, 반응기전이어떠한단백질, 어느위치에서그리고얼마만큼의빈도로일어나는가에관한상관관계는확인을할수없기때문에사실상획득가능한정보가극히제한적이라할수있다. 그에반해질량분석기를이용한분석의경우질산화가일어난정확한아미노산에대한정량비교가가능하기때문에단순히전체질산화단백질의정량차이만을확인하는것이아니라단백질의기능과질산화단백질정도와의상관관계를유추해볼수있다. 질량분석기의정량에서 MALDI는장비의특성상시료에따른재현성이확보되기힘들기때문에주로액체크로마토그라피를이용한정량을수행한다. 이때액체크로마토그라피상에서펩티드의광범위한물리화학적특성 ( 크기, 전하, 소수성 ) 에따른질량분석반응의차이때문에, 대부분펩티드기반의정량에서는각펩티드의비교를통해정확성을높인다. 질산화단백질의정량분석은주로화학표지화 (chemical labling) 방법을사용한다. 펩티드에서로다른질량값을갖는화학표지 (itraq, TMT) 를붙인후동량의혼합펩티드를액체크로마토그라피- 탠덤매스분석하여서로다른질량값을갖는화학표지이온의세기를이용하여상대적으로정량을하는방법을사용한다. Evans의실험에서는 itraq, TMTM라는화학표지를이용한정량방법을이전에발표가되었던농축방법과같이활용하였다. BSA 단백질에과산화아질산염을처리한 NO 2-BSA에앞의농축방법에서소개되었던것처럼반응성이좋지않은 NO 2 잔기를아민으로치환을하는과정이있으며, 그전에이미있던아민잔기에화학표지가붙는것을막기위해 lysine과 N-말단을아세틸화를수행하 http://www.e-hmr.org 115
Kwang Pyo Kim Mass Spectrometry Analysis for Nitration of Proteins 였다. 그이후 NO 2 가치환된아민기에 TMT, itraq 시약을반응시킨후액체크로마토그라피 -탠덤매스분석을이용하여분석하였고, 동일한펩티드에서유래된탠덤매스분석스펙트럼에서화학표지이온에해당하는피크들의세기를비교함으로써정량을수행하였다 [48]. Zhang 등의연구에서의경우는화학표지를사용하지않는방법을이용하여정량을수행하였다. 이때의전제는서로다른분석에서의재현성이가장중요하므로 microfluidic HPLC chip system와 Q-TOF 질량분석기를사용하여서로다른질산화시약과환경에서얻어진 BSA, OVA 시료를분석하였다. 활성질소단백질의정량을위해서 NO 2 잔기를포함한펩티드 (P nitrotyrosine) 와동일한아미노산서열을가지지만 NO 2 잔기가없는펩티드 (P native) 에상응하는스펙트럼의피크의면적값을사용하여아래와같은식에대입하여질산화단백질의정량을수행한다. 질산화단백질 rate = P nitrotyrosine/(p nitrotyrosine+p native), *P = Peptide 그결과전체질산화단백질의양이단순히질산화가일어난아미노산의서열에의한질산화단백질의양을의미하지는않는다는것을실험적으로밝혀냈으며, 그것은질산화단백질의발생기전이독립적으로존재한다고생각할수있다 [49]. 이외에도 Tsumoto 는질산화단백질에중수소로치환된메탄과치환되지않은메탄이있는두종류의아민에반응하는시약 (aminereactive reagent) 을사용하여두개의서로다른시료에각각을처리해차이가나는 3 Da을이용하여두시료를정량비교하고자하였다 [50]. 이와같이화학적인변형을이용한질산화단백질의정량분석은향후질산화단백질과질병, 신호전달과의상관관계를규명하는데중요한역할을할것으로기대된다. 결론단백질의질산화는노화와연관된다. 다양한신경질환과관련되어있을것이라고생각되는중요한단백질의번역후수식으로최근에도다양한연구결과들이발표되고있는분야이다. 이분야에서질량분석기를이용한단백질의질산화분석은화학적친화표지를이용한농축방법이발전하고있다. 하지만이러한농축방법이아직까지는실제질병모델에서단백질의질산화기능을밝힐정도의효율을갖지는못하는현실이다. 이것은생체내에단백질의질산화가워낙소량으로존재하기때문인데, 앞으로의연구에서는실제질병모델에서적용가능한농축방법이개발될것으로기대되며, 그이후에는질병모델에서의단백질질산화자리 (site) 의동정과정량을통해질병과단백질질산화간의상관관계가밝혀질것이라고생각된다. REFERENCES 1. Reynolds MR, Berry RW, Binder LI. Site-specific nitration and oxidative dityrosine bridging of the tau protein by peroxynitrite: implications for Alzheimer s disease. Biochemistry 2005;44:1690-700. 2. Yeo WS, Lee SJ, Lee JR, Kim KP. Nitrosative protein tyrosine modifications: biochemistry and functional significance. BMB Rep 2008;41:194-203. 3. Muntane J, la Mata MD. Nitric oxide and cancer. World J Hepatol 2010;2: 337-44. 4. MacMillan-Crow LA, Cruthirds DL, Ahki KM, Sanders PW, Thompson JA. Mitochondrial tyrosine nitration precedes chronic allograft nephropathy. Free Radic Biol Med 2001;31:1603-8. 5. Mann M, Hendrickson RC, Pandey A. Analysis of proteins and proteomes by mass spectrometry. Annu Rev Biochem 2001;70:437-73. 6. Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal Chem 1988;60:2299-301. 7. Abello N, Kerstjens HA, Postma DS, Bischoff R. Protein tyrosine nitration: selectivity, physicochemical and biological consequences, denitration, and proteomics methods for the identification of tyrosine-nitrated proteins. J Proteome Res 2009;8:3222-38. 8. Turko IV, Murad F. Mapping sites of tyrosine nitration by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Methods Enzymol 2005; 396:266-75. 9. Tedeschi G, Cappelletti G, Negri A, Pagliato L, Maggioni MG, Maci R, et al. Characterization of nitroproteome in neuron-like PC12 cells differentiated with nerve growth factor: identification of two nitration sites in alpha-tubulin. Proteomics 2005;5:2422-32. 10. Sarver A, Scheffler NK, Shetlar MD, Gibson BW. Analysis of peptides and proteins containing nitrotyrosine by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 2001;12: 439-48. 11. Sheeley SA, Rubakhin SS, Sweedler JV. The detection of nitrated tyrosine in neuropeptides: a MALDI matrix-dependent response. Anal Bioanal Chem 2005;382:22-7. 12. Petersson AS, Steen H, Kalume DE, Caidahl K, Roepstorff P. Investigation of tyrosine nitration in proteins by mass spectrometry. J Mass Spectrom 2001;36:616-25. 13. Salavej P, Spalteholz H, Arnhold J. Modification of amino acid residues in human serum albumin by myeloperoxidase. Free Radic Biol Med 2006; 40:516-25. 14. Shin YS, Moon JH, Kim MS. Selective screening of tyrosine-nitrated peptides in tryptic mixtures by in-source photodissociation at 355 nm in matrix-assisted laser desorption ionization. Anal Chem 2011;83:1704-8. 15. Butt YK, Lo SC. Detecting nitrated proteins by proteomic technologies. Methods Enzymol 2008;440:17-31. 16. Radi R. Nitric oxide, oxidants, and protein tyrosine nitration. Proc Natl Acad Sci U S A 2004;101:4003-8. 17. Yoon SW, Kang S, Ryu SE, Poo H. Identification of tyrosine-nitrated proteins in HT22 hippocampal cells during glutamate-induced oxidative stress. Cell Prolif 2010;43:584-93. 18. Cappelletti G, Maggioni MG, Tedeschi G, Maci R. Protein tyrosine nitration is triggered by nerve growth factor during neuronal differentiation of PC12 cells. Exp Cell Res 2003;288:9-20. 19. Reed TT, Pierce WM Jr, Turner DM, Markesbery WR, Butterfield DA. Proteomic identification of nitrated brain proteins in early Alzheimer s disease inferior parietal lobule. J Cell Mol Med 2009;13:2019-29. 20. Castegna A, Thongboonkerd V, Klein JB, Lynn B, Markesbery WR, But- 116 http://www.e-hmr.org
김광표 질산화단백질의질량분석 terfield DA. Proteomic identification of nitrated proteins in Alzheimer s disease brain. J Neurochem 2003;85:1394-401. 21. Kanski J, Alterman MA, Schoneich C. Proteomic identification of agedependent protein nitration in rat skeletal muscle. Free Radic Biol Med 2003;35:1229-39. 22. Salzano AM, D Ambrosio C, Scaloni A. Mass spectrometric characterization of proteins modified by nitric oxide-derived species. Methods Enzymol 2008;440:3-15. 23. Fiore G, Di Cristo C, Monti G, Amoresano A, Columbano L, Pucci P, et al. Tubulin nitration in human gliomas. Neurosci Lett 2006;394:57-62. 24. Sultana R, Poon HF, Cai J, Pierce WM, Merchant M, Klein JB, et al. Identification of nitrated proteins in Alzheimer s disease brain using a redox proteomics approach. Neurobiol Dis 2006;22:76-87. 25. Zhan X, Desiderio DM. Nitroproteins Identified in Human Ex-smoker Bronchoalveolar Lavage Fluid. Aging Dis 2011;2:100-15. 26. Zhan X, Desiderio DM. MALDI-induced Fragmentation of Leucine enkephalin, Nitro-Tyr Leucine Enkaphalin, and d(5)-phe-nitro-tyr Leucine Enkephalin. Int J Mass Spectrom 2009;287:77-86. 27. Soderling AS, Hultman L, Delbro D, Hojrup P, Caidahl K. Reduction of the nitro group during sample preparation may cause underestimation of the nitration level in 3-nitrotyrosine immunoblotting. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2007;851:277-86. 28. Koeck T, Fu X, Hazen SL, Crabb JW, Stuehr DJ, Aulak KS. Rapid and selective oxygen-regulated protein tyrosine denitration and nitration in mitochondria. J Biol Chem 2004;279:27257-62. 29. Borges CR, Kuhn DM, Watson JT. Mass mapping sites of nitration in tyrosine hydroxylase: random vs selective nitration of three tyrosine residues. Chem Res Toxicol 2003;16:536-40. 30. Ducrocq C, Dendane M, Laprevote O, Serani L, Das BC, Bouchemal-Chibani N, et al. Chemical modifications of the vasoconstrictor peptide angiotensin II by nitrogen oxides (NO, HNO2, HOONO)--evaluation by mass spectrometry. Eur J Biochem 1998;253:146-53. 31. Cook SL, Jackson GP. Characterization of tyrosine nitration and cysteine nitrosylation modifications by metastable atom-activation dissociation mass spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom 2011;22:221-32. 32. Zubarev RA, Horn DM, Fridriksson EK, Kelleher NL, Kruger NA, Lewis MA, et al. Electron capture dissociation for structural characterization of multiply charged protein cations. Anal Chem 2000;72:563-73. 33. Kelleher NL, Zubarev RA, Bush K, Furie B, Furie BC, McLafferty FW, et al. Localization of labile posttranslational modifications by electron capture dissociation: the case of gamma-carboxyglutamic acid. Anal Chem 1999;71:4250-3. 34. Jones AW, Mikhailov VA, Iniesta J, Cooper HJ. Electron capture dissociation mass spectrometry of tyrosine nitrated peptides. J Am Soc Mass Spectrom 2010;21:268-77. 35. Turko IV, Li L, Aulak KS, Stuehr DJ, Chang JY, Murad F. Protein tyrosine nitration in the mitochondria from diabetic mouse heart. Implications to dysfunctional mitochondria in diabetes. J Biol Chem 2003;278:33972-7. 36. Zhan X, Desiderio DM. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal Biochem 2006;354:279-89. 37. Nikov G, Bhat V, Wishnok JS, Tannenbaum SR. Analysis of nitrated proteins by nitrotyrosine-specific affinity probes and mass spectrometry. Anal Biochem 2003;320:214-22. 38. Abello N, Barroso B, Kerstjens HA, Postma DS, Bischoff R. Chemical labeling and enrichment of nitrotyrosine-containing peptides. Talanta 2010; 80:1503-12. 39. Zhang Q, Qian WJ, Knyushko TV, Clauss TR, Purvine SO, Moore RJ, et al. A method for selective enrichment and analysis of nitrotyrosine-containing peptides in complex proteome samples. J Proteome Res 2007;6: 2257-68. 40. Prokai-Tatrai K, Guo J, Prokai L. Selective chemoprecipitation and subsequent release of tagged species for the analysis of nitropeptides by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Mol Cell Proteomics 2011; 10:M110.002923. 41. Lee JR, Lee SJ, Kim TW, Kim JK, Park HS, Kim DE, et al. Chemical approach for specific enrichment and mass analysis of nitrated peptides. Anal Chem 2009;81:6620-6. 42. Kim JK, Lee JR, Kang JW, Lee SJ, Shin GC, Yeo WS, et al. Selective enrichment and mass spectrometric identification of nitrated peptides using fluorinated carbon tags. Anal Chem 2011;83:157-63. 43. Crowley JR, Yarasheski K, Leeuwenburgh C, Turk J, Heinecke JW. Isotope dilution mass spectrometric quantification of 3-nitrotyrosine in proteins and tissues is facilitated by reduction to 3-aminotyrosine. Anal Biochem 1998;259:127-35. 44. Ghesquiere B, Colaert N, Helsens K, Dejager L, Vanhaute C, Verleysen K, et al. In vitro and in vivo protein-bound tyrosine nitration characterized by diagonal chromatography. Mol Cell Proteomics 2009;8:2642-52. 45. Larsen TR, Bache N, Gramsbergen JB, Roepstorff P. Identification of nitrotyrosine containing peptides using combined fractional diagonal chromatography (COFRADIC) and off-line nano-lc-maldi. J Am Soc Mass Spectrom 2011;22:989-96. 46. Sharov VS, Dremina ES, Galeva NA, Gerstenecker GS, Li X, Dobrowsky RT, et al. Fluorogenic Tagging of Peptide and Protein 3-Nitrotyrosine with 4-(Aminomethyl)-benzenesulfonic Acid for Quantitative Analysis of Protein Tyrosine Nitration. Chromatographia 2010;71:37-53. 47. Wisastra R, Poelstra K, Bischoff R, Maarsingh H, Haisma HJ, Dekker FJ. Antibody-free detection of protein tyrosine nitration in tissue sections. Chembiochem 2011;12:2016-20. 48. Robinson RA, Evans AR. Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging. Anal Chem 2012;84:4677-86. 49. Zhang Y, Yang H, Poschl U. Analysis of nitrated proteins and tryptic peptides by HPLC-chip-MS/MS: site-specific quantification, nitration degree, and reactivity of tyrosine residues. Anal Bioanal Chem 2011;399: 459-71. 50. Tsumoto H, Taguchi R, Kohda K. Efficient identification and quantification of peptides containing nitrotyrosine by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry after derivatization. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2010;58:488-94. http://www.e-hmr.org 117