국내구토형바실러스세레우스감시및독소유형 Surveillance and toxin profile of emetic toxin producing Bacillus cereus in Korea 질병관리본부국립보건연구원감염병센터장내세균과 Ⅰ. 들어가는말 Bacillus 속의박테리아는대부분의환경속에존재하고있으며, 현재약 148개의종으로분류되고있다. 이중에서 Bacillus cereus group에속하는종은 7가지로 B. cereus sensu stricto, B. thuringiensis, B. anthracis, B. mycoides, B. weihenstenstephanensis가포함된다 [1]. Bacillus spp. 는포자를형성 (65-75 ) 하기때문에음식을조리하는과정중에열처리에의해사멸되지않으므로우유, 인스턴트식품그리고가정에서조리하는음식에서도생존한다. 또한생존온도에제한이적어낮은온도에서도생존할뿐만아니라생장하는특성을지니고있어냉장보관된식품및식재료에서도증식한다. B. cereus sensu stricto는인체에감염된후크게두가지증상을유발하게되는데, 설사증상을야기하는설사형과구토를유발하게하는구토형이있다 [2]. 설사증상을유발하는대표적인독소로는 Hemolysin BL(HBL), Nonhemolytic enterotoxin(nhe) 이있으며, 이들독소는단백질복합체로구성되고감염후 8-16시간의잠복기를거쳐복통과설사를동반하는증상이나타난다. 구토형의경우에는 cereulide라는독소에의해메스꺼움과구토등의증상을유발하며일부의경우에는설사증상을동반하기도하며잠복기는 1-5시간정도로보고되고있다. B. cereus sensu stricto에의한식품매개질환성집단발병은나라마다차이를나타내는것으로알려져있으나, 이는각나라마다의보고시스템에의한차이라고알려져있다 [3]. 네델란드의경우 1991-1994년까지의집단발병사례중가장많은원인병원체 (19%) 로보고되고있으며, 일본의경우에는 0.7% 만이집단발병원인병원체로보고되고있다. 또한아시아지역에서는구토형독소에의한집단발병이많이발생하는반면유럽과북아메리카지역에서는설사형감염이많이발생하는것으로알려져있다 [3]. 설사형의경우진단은비교적간단하여선택배지를통한병원체의분리와설사형독소의유전학적진단이가능하며, 독소발현을최종확인하는 immunoassay 키트 (BCET-RPLA(Oxoid, Hampshire, UK) 와 Tecra ELISA(Tecra International Pty Ltd., NSW, Australia) 등이사용되고있다. 그러나구토형감염을유발하는 cereulide는유전자로부터유래하는독소가아닌아미노산들을새로이조합하여구성된약 1.2kDa의 peptide로알려져있으며, 열에매우안정적이며항원성이없는것으로알려져있다. 이러한원인들로인해유전학적진단및면역학적진단이힘들었으나, 최근들어 cereulide를생성하는펩타이드합성효소 (non-ribosomal peptide synthetase, NRPS) 의특징이밝혀지면서유전학적진단법이보고되고있다 [4]. 유전학적진단외에독소의세포독성을측정하는방법들이개발되어보고되고있는실정이다. 국내의경우, 2007년까지수인성 식품매개성감염병감시와 17개시 도보건환경연구원을통한집단식중독원인균분리를통해지속적으로 B. cereus 및설사원인균분리를모니터링하였으며, 2008년이후로는집단식중독발생건에한하여 B. cereus 감염을확인하고있다. 구토형 B. cereus의경우 2008년부터진단법이확립되었으며, 이를바탕으로집단식중독발생원인균으로밝혀진병원체를대상으로진단하고있다. Ⅱ. 몸말 2005년부터 2007년까지급성설사질환의원인규명을위하여전국 17개시 도보건환경연구원과연계하여설사환자대변검체에서병원성세균을분리하였다. 수집된검체를선택배지 (MYP media, - 1 -
Oxoid, Hampshre, UK) 에접종후깃털모양의분홍색집락을선별하여 API 20E kit와 API 50 CHB kit(biomerieux, Marcy-L Etoile, France) 를이용하여생화학적검사를시행하였다. B. cereus로동정된균주를대상으로게놈유전자를추출하여 10개의독소유전자를검출하는 primer와 i-star Master mix PCR kit(intron biotechnology, Seoul, Korea) 를사용하여 PCR을시행하였으며, HBL 독소와 NHE 독소의발현여부를확인하기위하여 BCET RPLA(Oxoid, Hampshire, UK) 와 Tecra ELISA(Tecra International Pty Ltd) kit를이용하여독소단백질검사를확인하였다. 2005년부터 2007년까지의급성설사질환자실험실감시사업결과, B. cereus의월별분리분포는병원성장내세균 (pathogenic E. coli, Salmonella spp, Staphlylococcus aureus) 의전형적인월별분리분포와유사한결과를보였다 (Figure 1). 또한병원체의급격한증가를보이지는않았으나, 매년병원체의분리수가증가하는추세이다. 그러나 2007년까지구토형 B. cereus에대한보고가없었다. 2008년이후구토형독소에진단법을확립하고곡류에서분리된 B. cereus와설사및구토증상이있는환자로부터분리된 B. cereus에서 cereulide를합성하는 NRPS 효소유전자를진단하고독소의생산을확인한결과식품 ( 선식류 ) 및환자분리주에서구토독소의생성을확인할수있었다 (Figure 2). 설사원인의독소로알려진 HBL 독소를 encoding하는유전자는환자분리주의경우 hbl 유전자가존재하지않는특성을보였다. 또한사람분리주중 2주는 NRPS 유전자를보유하지않았으나 cereulide의생성을세포독성실험을통하여확인할수있었다. 이는 cereulide가 NRPS 효소에의존적이지않게생성되는것으로판단된다. 병원체의특성상집단발생의경우유전학적근연관계를분석하기위해 PFGE로분석하기에는어려움이있다. 또한 PFGE 분석시간이최소 6일이소요됨으로보다신속한유전학적근연관계를분석하고자 rep-pcr 방법을도입하여수행하였다. 식품분리주와 PFGE 분석이불가능한 7주를대상으로수행하였으며, 분석시간은 2일이소요되었다 (Figure 2). 국내최초구토형 B. cereus 집단감염사례 2008년 3월 11명이생선회를섭식하였으며, 이들중 6명이동일 22:00부터설사, 복통, 메스꺼움, 구토증상을보여환자검체를채취하여원인병원체검사를실시하였다. 6명의환자이외에 5명의무증상자의검체를채취하여동일한검사를실시하였다. 역학조사결과, 3명의환자는설사와구토를동반하는증상을보였으며, 나머지 3명의환자는복통만을호소하였다. 11건의검체중 6명의환자와 2명의무증상자에서 B. cereus가분리되었으며, 독소유전자검사와구토형독소세포독성실험, 그리고 PFGE를수행하였다. Hep-2 세포를이용한독소생산실험을한결과모두 1:128이상의높은독소생성능을보였다 (Figure 4). 유전자분석에서는 8주모두가 hbl 유전자를보유하지않았으며 NRPS 유전자는모두보유하고있는 - 2 -
동일한양상을나타내었다. 또한집단발생의유전학적근연관계를확인한결과 100% 의상동성을보여모두동일한오염원에의해감염된것임을확인하였다 (Figure 3)[5]. - 3 -
Ⅲ. 맺는말 Bacillus spp. 는자연계에광범위하게존재하며, 열악한환경에서도생존하는능력을가지고있다. B. cereus의경우다양한독소들을생성하고있으며, 이들독소종류에의해설사및구토를야기한다. B. cereus에의한감염은증상이심하지않으며, 수일내에자연치유되는경우가많아병원에내원하는경우가드물어실제감염률에비해보고되지않는경우가많다. 또한 B. cereus의감염증상별로설사를유발하는경우에는 Clostridium perfringens와잠복기및증상이유사하며, 구토를유발하는경우에는 Staphylococcus aureus 독소감염증상과유사하여정확한진단및원인병원체분리에어려움이있다. 국내에서발생하는 B. cereus의감염증에대한통계는질병관리본부국립보건연구원급성설사질환자실험실감시망사업 2007년도자료 [6] 에의하면전국적으로 5,345주의설사유발세균이분리되었으며 B. cereus는분리된설사유발원인균중 6.3% 인 337주가분리되었다. 1970년대초반영국의중국식당에서조리된쌀에의해감염된것을시작으로 1989년까지 11개국가에서 200여건의구토형집단발생이보고되었다. 구토형 B. cereus의오염원으로알려진원인식품으로는전분성분의파스타, 유아이유식등에서주로분리되며, 특히생쌀과조리된쌀에서 10-100% 구토형 B. cereus가오염되어있는것으로보고되었다 [7]. 2007년이전에는구토형 B. cereus 진단이수행되지않아국내구토형 B. cereus의발생빈도를추측하기는어려운실정이나, 구토형 B. cereus 오염이원인식품으로알려진쌀등을주식으로하는국내실정에서잠재적인환자의발생가능성이높을것으로예상된다. 이에 2007년이전에분리된병원체를대상으로구토형 B. cereus 진단을통해정확한국내발생현황자료의축적과보다신속하고표준화된진단법이마련되어야할것이다. IV. 참고문헌 1. Bavykin, S.G., Lysov, Y.P., Zakhariev, V., Kelly, J.J., Jackman, J., Stahl, D.A. and Cherni, A. 2004. Use of 16s rrna, 23s rrna and gryb genes sequence analysis to determine phylogenetic relationships of Bacillus cereus group microoranisms. J. Clin. Microbiol. 24, 3711-3730. 2. Granum P.E: Bacillus cereus. In Food Miceobiology: Fundamental and Frontiers 2nd edition. Edited by: - 4 -
Doyle MP. Washington D.C., ASM Press; 2001:373-381. 3. Kramer, J.M., Gilbert, R.J., in: Doyle M.P(Ed), Foodborne Bacterial Pathogens, Marcel Dekker Inc., New York, 1989, pp. 21-70. 4. Ehling-Schulz, M., Vokov, N., Schulz, A., Shaheen, R., Anderson, M., Martlbauer, E., and Scherer, S. 2005. Identification and partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus. Appl. Environ. Microbiol. 71(1); 105-113. 5. Kim J.H., Lim E.G., Jang H.C., Park. J.Y., Lee. S.J., Park. M.S., Choi G.B. and Lee B.K. A case of emetic toxin producing Bacillus cereus strains isolated from outbreak. 2009. Krean J. Clin. Micrbiol. 12(1):48-52. 6. Division of Enteric Bacterial Infections, Division of Enteric and Hepatitis viruses, Division of Malaria and Parasitic Diseases. Surveillance Network of Water-borne and Food-borne disease. 1th ed. Seoul; Center for Infectious Diseases, National Institute of Health, 2007:7-31. 7. Taylor J.M, Sutherland A.D, Aidoo K.E, Logan N.A. Heat-stable toxin production by strains of Bacillus cereus, Bacillus firmus, Bacillus megaterium, Bacillus simplex and Bacillus licheniformis. FEMS Microbiol Lett 2005;242:313-7. - 5 -