Polymer(Korea), Vol. 40, No. 3, pp. 380-384 (2016) http://dx.doi.org/10.7317/pk.2016.40.3.380 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) 난용성약물인 Isoflavone 계화합물을함유한하이드로콜로이드패치의물리화학적특성 이선화 심우선 류종성 박선규 이천구 김기현 * 정성훈 * 강내규 LG 생활건강기술연구원, * 동국대학교약학과 (2015 년 10 월 22 일접수, 2015 년 12 월 23 일수정, 2016 년 1 월 10 일채택 ) Physicochemical Properties of the Poorly Soluble Isoflavone Class-loaded Hydrocolloid Patch Sun Hwa Lee, Woo Sun Shim, Jong Seong Ryu, Sun Gyoo Park, Cheon Koo Lee, Ki Hyun Kim*, Seong Hoon Jeong*, and Nae Kyu Kang LG Household & Healthcare R&D center, Daejeon 34114, Korea *College of Pharmacy, Dongguk University, Gyeonggi 10326, Korea (Received October 22, 2015; Revised December 23, 2015; Accepted January 10, 2016) 초록 : Genistein 과 daidzein 은 isoflavone 계열의약물로써다양한암의치료및예방, 항산화, 항염활성효과를나타내는물질이다. 그러나이약물들은용해성이좋지않아약물을포함하는크림형태의에멀젼에적용하여피부를통해전달하기어렵다. 본연구에서는하이드로콜로이드패치라는 TDDS(transdermal drug delivery system) 를이용하여 genistein 과 daidzein 과같은난용성약물을피부에전달하였다. 패치가에멀젼보다피부로잘흡수되는것을돼지피부 (porcine skin) 를이용한투과실험및 confocal microscopy 로확인하였으며, 이는패치의밀폐효과 (occlusive effect) 에의해피부내로잘흡수된것이다. 하이드로콜로이드패치는에멀젼형태의크림보다난용성약물을피부내로전달하는데더좋은방법이며, 사용하기편리하므로효과적인화장품으로써가치가있다. Abstract: Genistein and daidzein, phytoestrogens belonging to the isoflavone class, have a role in the treatment and prevention of various cancers, antioxidant and anti-inflammation activity. However, it is difficult to deliver through the skin from applying the emulsion such as cream containing them because these drugs are nearly insoluble in aqueous solutions. In this study, the hydrocolloid patch including poorly soluble drugs such as genistein and daidzein was used as the transdermal drug delivery system (TDDS) to deliver them through the skin. It was confirmed that the patches are helpful for the drugs to be absorb much and more deeply than the cream due to the occlusive effect of patch, which was verified from the porcine skin and the confocal microscopy. The hydrocolloid patch is a better way to deliver the poorly soluble drugs through the skin than the general cosmetics such as emulsion-based cream, and is valuable as effective cosmetics due to its convenient usage. Keywords: genistein, daidzein, hydrocolloid patch, transdermal drug delivery, poorly soluble drug. 서 Genistein 과 daidzein 은이소플라본계화합물에속하는피토에스트로겐으로다양한암, 심혈관계및골다공증과같은질병의치료및예방에효과가있으며, 항산화, 항염에효과를나타낸다. 1 또한각질세포가광에의해손상되었을때, free radical scavenger 역할을하기도한다. 2 이러한좋은효과를가짐에도불구하고, 이약물들은물에거의녹지않아경구 론 To whom correspondence should be addressed. E-mail: ngkang@lgcare.com 2016 The Polymer Society of Korea. All rights reserved. 용이나국소피부전달용으로이용하는데많은제약을받아왔다. 이러한난용성약물의용해성및경구용의생체이용률을높이고자많은연구가이루어져왔다. Youan group과 Shen group 등은각각 poly(ethylene glycol)(peg) 와생분해성고분자인 poly(lactic acid)(pla), poly(lactic acid-co-glycolic acid)(plga) 의 nano-particle로부터생체이용률을향상시키고자하였으며, 1,3,4 Eudragit(poly(butyl methacrylate-co-2- dimethylamino ethyl methacrylate-co-methyl methacrylate)) 혹은사이클로덱스트린으로난용성약물의용해성을향상시켜생체이용률을향상시키는연구가진행되었다. 5,6 또한나노에멀젼또는마이크로에멀젼을이용하여, 난용성약물인 genistein의피부투과량을향상시키는노력이시도되었다. 7,8 380
난용성약물인 Isoflavone 계화합물을함유한하이드로콜로이드패치의물리화학적특성 381 한편, 약물을효율적으로경피전달하기위해, 연고나크림형태의바르는타입뿐만아니라, 다양한효능을가진성분을함유한패치시스템이연구되고있다. 9,10 특히, 피부안전성이우수하여습윤드레싱제로사용되고있는하이드로콜로이드패치는피부위를밀폐시킴으로써각질층의수화를촉진시키므로약물의흡수를돕는다는장점을가진다. 11 또한스테로이드제제약물을함침한하이드로콜로이드패치의경피투과율은밀폐되지않은조건보다 3~4 배더잘투과된다고보고되었다. 12 본연구에서는피부에적용하였을때불편함이없고경피를통해약물을효율적으로전달하기위해하이드로콜로이드패치시스템을도입하였다. 난용성약물모델은다양한활성을가지는 genistein, daidzein 을사용하였으며, 이약물의물리화학적특성및약물을함침한하이드로콜로이드패치의경피투과를평가하였다. 실 Genistein과 Daidzein의용해도평가. 피부흡수및확산실험시 receptor cell에공급되는 medium에대하여농도구배생성과정에서 sink condition을유지하는정도를알아보기위하여두물질의용해도평가를수행하고, patch 단위면적당유효성분의함량을평가하였다. 용해도실험을위하여용매로써 phosphate buffered saline(pbs) buffer(ph 7.4) 와, PBS buffer에일정량의가용화제를첨가한것을사용하였다. 식약처 (Ministry of Food and Drug Safety, MFDS) 의약품동등성시험기준고시전문 ( 제2013-237호 ) 의가용화제예시로나온 sodium lauryl sulfate(sls) (0.25, 0.5, 1, 1.5%), polysorbate- 80(Tween 80 TM ) (0.25, 0.5, 1, 1.5%), polyethylene glycol-8 (PEG 400 TM ) (10, 20, 40, 60%) 을 PBS buffer에각각가하여준비하였고이용매에대한 daidzein, genistein의용해도실험을진행하였다. 실험방법은 Eppendorf tube에용매를 1mL 씩넣고이에유효성분을소량넣은후평형을이루는농도를측정하기위하여 24시간 shaking 하였다. 이후 3시간정도가만히두어과포화를막고평형상태에오게한후 12000 rpm으로 30분간원심분리를하여상등액을취하여유효성분의농도를정량하였다. 약물을함침한하이드로콜로이드패치의제조방법. 오일, 스틸렌 -에틸렌-부타디엔-스틸렌공중합체고분자와이소프렌고무를혼합하여 30분동안 150도에서녹였다. 온도를 120도정도로내린후, 이소부틸렌고무와점착부여제 (rosin) 및약물 (genistein 또는 daidzein) 을첨가한후 30분동안교반하며녹였다. 마지막으로온도를 100도로낮추고하이드로콜로이드파우더 (sodium carboxymethylcellulose) 를넣고 20분간잘분산되도록교반하였다. 이혼합된용액을열압축기를이용하여균일한두께를가진평평한모양으로이형지에도포하 험 고상온에서식혀서약물을함침한하이드로콜로이드패치를얻었다. 하이드로콜로이드패치내유효성분함량분석. 본연구에사용된하이드로콜로이드패치는 T&L 로부터공급받았으며, 패치를구성하는물질 (poly(styrene-b-iso-butylene-bstyrene), rosin 등 ) 에 PEG 400 에 2%(w/w) 농도로녹인 genistein 혹은 daidzein 을각각패치구성물질에대해 5% (w/w) 혼합하여 300 µm 두께로패치를제조하였다. 패치의단위면적당유효성분의함량을확인하기위해 1cm 2 의패치를잘라 4 ml methanol 에넣은후 48 시간 shaking 한후적절한희석과정을거쳐 HPLC 로정량하였다. 컬럼은 SUPELCOSIL TM LC-18 을사용하였으며, 컬럼온도 : 30 o C, 이동상은 60%(w/w) acetonitrile 을사용하였고, 이때유속은 1.0 ml/min 이었다. 검출기로는 UV-Vis spectrophotometer 를사용하였으며, daidzein 과 genistein 의측정파장은각각 248, 260 nm 이었다. 패치내유효성분의 Membrane 을통한확산평가. 두물질의투과도비교를위해성질이다른 2 가지 model membrane 을선정하였으며, hydrophilic model membrane 으로는 0.45 µm pore size 의 cellulose acetate 를, hydrophobic model membrane 으로는 0.45 µm pore size 의 MTF polytetrafluoroethylene (PTFE) 을각각사용하였다. 각각의 membrane 을 Figure 1 에서의 side-by-side cell 의 receptor chamber 에붙여고정하였으며, 그다음적당한크기로자른패치를 membrane 위에고정하였다. Cell 의온도는피부온도와유사한 32 o C 로유지하였다. 앞선실험결과를바탕으로 receptor cell 에는 sink condition 을유지하면서기포가발생하지않도록 0.2%(w/w) polysorbate-80(tween 80 TM ) 을함유하는 PBS buffer 를 medium 으로채워주었다. 정해진시간에 receptor cell 에서일정하게 600 µl 의샘플을취하고같은양만큼 medium 을보충해주었다. 대조군으로는 medium 을 methanol 로채운후같은방법으로실험을진행하였다. Calcein 의피부투과실험. 하이드로콜로이드패치에 calcein 25 mm solution 1%(w/w) 를함침하여제조하였다. Calcein 이함침된하이드로콜로이드패치를 porcine skin 에 Figure 1. Scheme of side-by-side cell. Polymer(Korea), Vol. 40, No. 3, 2016
382 이선화 심우선 류종성 박선규 이천구 김기현 정성훈 강내규 부착하여, 시간에따른형광물질의피부투과를 confocal microscopy(nikon, Japan) 를이용하여확인하였다. 대조군으로 calcein 25 mm solution 1%(w/w) 를포함하는크림을제조하여, porcince skin 에도포한후같은방법으로시간에따른형광물질의피부투과를확인하였다. 결과및토론 Genistein 과 Daidzein 의용해도평가. 가용화제로각각 SLS, Tween 80, PEG 400 을사용한용해도실험결과를 Figures 2, 3, 4 에나타냈다. Genistein 과 daidzein 모두 SLS 와 Tween 80 을사용한결과에서가용화제의함량증가에따라용해도가직선성을보이며증가하였으나, PEG 400 을사용한경우 PEG 400 함량이 60% 가되는지점에서용해도가크게증가하였다. 하이드로콜로이드패치내유효성분의함량. 패치의단위면적당유효성분함량평가결과는 Figure 5 에나타냈다. Daidzein 과 genistein 함량은각각 25.15±0.74, 15.22±0.52 µg/ cm 2 로확인되었다. 이론적인양 (30 µg/cm 2 ) 에비해각각 84%, 51% 로적게검출되었는데, 이는패치내에함침되어있는약물이모두빠져나오기어렵기때문이나, 대부분의약물이패치내에안정하게함침되어있음을확인할수있었다. 패치내유효성분의막을통한확산평가. Side-bi-side cell 에의한투과도실험결과를 Figure 6 과 Figure 7 에나타냈다. Y 축은 membrane 의단위표면적당유효성분의확산된양을나타낸것으로, 그래프에서보는것과같이두물질모두 hydrophilic membrane 을사용했을때 hydrophobic membrane 을사용한결과보다물질의투과가빠른것을확인할수있었으며, hydrophobic membrane 의경우 rate-limiting 효과를보였다. 이는 PTFE membrane 이패치와 receptor medium 사이에서일정부분물리화학적 barrier 역할을한것으로보인다. 또한 hydrophilic membrane 을사용한경우 daidzein 의투과속도가 genistein 보다빠르게나타났는데이는 daidzein 에비해 genistein 이더물리화학적으로 hydrophobic 하고이로인해 membrane 과의친화성이떨어진것에기인한것으로판단된다 (daidzein logp=2.51, genistein logp=3.04). 13 이러한 Figure 2. Solubility of genistein( ), daidzein( ) vs. the concentration of sodium lauryl sulfate (SLS). Figure 4. Solubility of genistein( ), daidzein( ) vs. the concentration of PEG 400. Figure 3. Solubility of genistein( ), daidzein( ) vs. the concentration of Tween 80. Figure 5. Amount of drug in the unit area of patch. 폴리머, 제 40 권제 3 호, 2016 년
난용성약물인 Isoflavone 계화합물을함유한하이드로콜로이드패치의물리화학적특성 383 Figure 8. Molecular structure of daidzein and genistein and scheme of hydrogen bond of genistein. Figure 6. Results of membrane penetration of drug to the medium of receptor cell containing 0.2% (w/w) Tween 80 in side-by-side cell. Figure 7. Results of membrane penetration of drug to the medium of receptor cell containing methanol in side-by-side cell. hydrophobicity 의차이는 Figure 8 에서와같이 genistein 의 5- hydroxyl group 과 4-ketonic oxygen 사이의분자내 hydrogen bond 의형성에의해 4-ketonic oxygen 이물분자의수소와 hydrogen bond 를할기회가줄어듦으로 hydrophobic 한성질이증가하기때문이다. 14 Hydrophobic membrane 을사용한경우단위면적당유효성분의함량을고려해보면 genistein 의투과속도가더빠르게나온것을관찰할수있다. 이는 hydrophilic membrane 에서의결과와는반대로 hydrophobic 한성질이더욱강한 genistein 이 membrane 과의친화성이더크기때문이다. Receptor cell medium 에의한영향을비교하기위해대조실험으로 methanol 을 receptor medium 으로사용한투과도실험결과를 Figure 7 에나타내었다. Buffer 를 medium 으로썼을때와마찬가지로 hydrophilic membrane 을사용한경우투과속도가빠르게나왔지만그차이가현저히줄어들 Figure 9. Confocal microscopy image of skin penetration of calcein in cream and patch (depth: 300 µm). 었으며, 더이상 hydrophobic membrane 을사용한결과에서 rate-limiting 구간이관찰되지않았다. 이는 methanol 과 PTFE membrane 의친화성이 buffer 사용시보다증가하여더이상 membrane 이 patch 와 receptor medium 사이의물리화학적 barrier 로써의역할을크게하지못하기때문이다. 또한 buffer 를사용했을때와비교해서 daidzein 에비해 genistein 의투과속도가크게증가하였는데이것은상대적으로더 hydrophobic 한 genistein 이 medium 에대한친화도가더욱커졌기때문으로예상된다. Calcein 의피부투과실험. Figure 9 에서보는바와같이, 에멀젼크림을도포한경우각질및표피상부에만흡수되었으나, 하이드로콜로이드패치를부착한경우, 패치에서형광물질이확산되어피부로더잘흡수된것을확인할수있었으며약 100 µm 이상깊이의진피층까지도흡수되었음을확인하였다. 이는패치의밀폐효과 (occlusive effect) 에의해수화된피부내로더잘흡수된것으로판단된다. 결 난용성약물을함유하고있는크림형태의에멀젼과같은일반적인화장품제제보다하이드로콜로이드패치를이용하는것이밀폐효과에의해경피를통한약물전달에더효율적인수단임을확인하였다. 이것은패치가피부표면을밀폐시킴으로써피부의수화를촉진하고그로인해약물의확산을좀더향상시키기때문이다. 또한하이드로콜로이드패치는난용성약물뿐만아니라다양한약물을함침시킬수있는장점이있어효과적으로피부에효능성분을전달할수있는방법을제공하고사용하기도편리하므로, 바르는화장품의단점을보완할수있는피부적용제품으로써가치가있다. 론 Polymer(Korea), Vol. 40, No. 3, 2016
384 이선화 심우선 류종성 박선규 이천구 김기현 정성훈 강내규 감사의글 : 본연구는보건복지부보건의료연구개발사업의지원에의하여이루어진것임 ( 과제고유번호 : A103017). 참고문헌 1. N. Motlekar, M. A. Khan, and B.-B. C. Youan, J. Appl. Polym. Sci., 101, 2070 (2006). 2. Z.-R. Huang, C.-F. Hung, Y.-K. Lin, and J.-Y. Fang, Int. J. Pharm., 364, 36 (2008). 3. A. L. T. C. Zampieri, F. S. Ferreira, É. C. Resende, M. P. N. Gaeti, D. G. A. Diniz, S. F. Taveira, and E. M. Lima, J. Biomed. Nanotechnol., 9, 1 (2012). 4. Y. Ma, X. Zhao, J. Li, and Q. Shen, Int. J. Nanomedicine, 7, 559 (2012). 5. J. Tang, N. Xu, H. Ji, H. Liu, Z. Wang, and L. Wu, Int. J. Nanomedicine, 6, 2429 (2011). 6. Á. E. Daruházi, L. Szente, B. Balogh, P. Mátyus, S. Béni, M. Takács, A. Gergely, P. Horváth, É. Szöke, and É. Lemberkovics, J. Pharm. Biomed. Anal., 48, 636 (2008). 7. A. P. C. Silva, B. R. Nunes, M. C. Oliveira, L. S. Koester, P. Mayorga, V. L. Bassani, and H. F. Teixeira, Pharmazie, 64, 32 (2009). 8. S. Kitagawa, K. Inoue, R. Teraoka, and S. Morita, Chem. Pharm. Bull., 58, 398 (2010). 9. S. J. Kim, S. S. Kwon, E. R. Yu, and S. N. Park, Polym. Korea, 38, 676 (2014). 10. M. H. Lee, S. J. Kim, and S. N. Park, Polym. Korea, 37, 347 (2013). 11. G. P. Martin, D. Ladenheim, C. Marriott, D. A. Hollingsbee, and M. B. Brown, Drug Dev. Ind. Pharm., 26, 35 (2000). 12. D. Ladenheimi, G. P. Martin, C. Marriott, D. A. Hollingsbee, and M. B. Brown, J. Pharm. Pharmacol., 48, 806 (1996). 13. J. A. Rothwell, A. J. Day, and M. R. A. Morgan, J. Agric. Food Chem., 53, 4355 (2005). 14. M. Raghunathan, Y. Zubovski, R. M. Venable, R. W. Pastor, J. F. Nagle, and S. T. Nagle, J. Phys. Chem. B, 116, 3918 (2012). 폴리머, 제 40 권제 3 호, 2016 년