Na + -K + -2Cl - cotransporter 가결핍된 백서에서전정기관의형태학적변화 연세대학교대학원 의학과 이주형
Na + -K + -2Cl - cotransporter 가결핍된 백서에서전정기관의형태학적변화 지도교수이원상 이논문을석사학위논문으로제출함 2004 년 12 월일 연세대학교대학원 의학과 이주형
이주형의석사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2004 년 12 월일
감사의글 아직부족한제가많은분들의도움과은혜에힘입어이렇게석사학위논문을완성하게되었습니다. 이논문이완성될때까지, 때로는아버지처럼엄하게때로는어머니처럼자상하게저를지도해주신이원상선생님께누구보다더먼저감사의말씀을드리고싶습니다. 또연구의진행에많은도움을주시고조언을해주셨던임중우선생님과정운교선생님께도깊은감사의말씀을드립니다. 또실험과정에서많은도움을주고모든과정을꼼꼼하게챙겨주신최재영선생님, 정상호선생님께도감사드립니다. 석사과정을지내는동안격려해주시고한가족처럼따뜻하게대해주신교실의여러선생님께도감사말씀을전합니다. 또제가힘들때항상위로를해주고너무편안하게내조를잘해준사랑하는아내와양가부모님께감사의말씀을드립니다. 그리고사랑하는재원이, 재훈이와도이기쁨을함께하고싶습니다. 저자 씀
차 례 그림및표차례 국문요약 1 I. 서론 3 II. 재료및방법 5 III. 결과 6 IV. 고찰 13 V. 결론 19 참고문헌 20 영문요약 23 - i -
그림차례 그림 1. 이상행동을보이는 NKCC1 이결핍된백서 6 그림 2. 내이의전반적인광학현미경적소견 7 그림 3. 팽대부릉과평형반의광학현미경적소견 8 그림 4. 반고리관의팽대부릉주위의현미경적소견 9 그림 5. 반고리관의현미경적소견 10 그림 6. 반고리관의팽대부릉주위의현미경적소견 11 그림 7. 이석기관의평형반주위의현미경적소견 12 - ii -
국문요약 Na + -K + -2Cl - cotransporter 가결핍된백서에서 전정기관의형태학적변화 내이의림프액은크게두가지성분으로구성된다. 막성미로내에는내림프액이들어있고막성미로와골성미로사이에는외림프액이들어있다. 내림프의이온성분은세포내액과유사한조성 ( 고농도의 K +, 저농도의 Na + ) 을가지고있으며, 외림프액의이온성분은세포외액의조성과유사하다. ( 저농도의 K +, 고농도의 Na + ) 내림프액이세포내액과유사한농도를유지하기위해서는계속해서 K + 이내림프액내로들어와야하는데, 이러한내림프액내로의 K + 의이동은변연세포의기저외측부에서주로 Na, K-ATPase와 Na + -K + -2Cl - cotransporter(nkcc1) 를통하여이루어진다. NKCC1은상피세포와비상피세포모두에서세포막을통해 Na + 와 K + 가두개의 Cl - 와동시에세포내로이동하여전해질균형을맞추는체계이며, 신장, 비점막뿐만아니라전해질이동이있는모든기관에분포한다. 본연구의목적은이러한 NKCC1이결핍된백서에서전정기관의조직학적변화를알아보기위함이다. 정상과 NKCC1이결핍된백서의내이조직중에서전정기관을채취하여광학현미경을이용하여조직학적으로비교관찰하였다. 정상백서에비해 NKCC1이결핍된백서는조직학적으로전정과반고리관은불규칙한모양을보였고, 그크기가감소하였고, 골성구조의두께가얇아져있었다. 그러나내이의골격자체는대체로그형태를유지하고있었다. 막성미로가위축되어있었으며, 이로인해내림프강의용적은감소해있었다. 반고리관의팽대부릉의점액성물질은소실되어있었으며, 감각세포의수도감소되어있었다. 이석기관에서도이석의수가정상에비해감소되어있었다. 결론적으로 NKCC1이결핍되어있을경우전정기관의 - 1 -
조직학적으로심한변형이있었으며, NKCC1 은전정기관에서주요부분의 형성과전해질균형에중요한역할을할것으로사료된다. 핵심되는말 : 전해질이동, 전정기관, NKCC1 이결핍된백서 - 2 -
Na + -K + -2Cl - cotransporter 가결핍된백서에서 전정기관의형태학적변화 < 지도교수이원상 > 연세대학교대학원의학과 이주형 I. 서론 내이의림프액은크게두가지성분으로구성된다. 막성미로 (membranous labyrinth) 내에는내림프액 (endolymph) 이들어있고막성미로와골성미로 (bony labyrinth) 사이에는외림프액 (perilymph) 이들어있다. 와우 (cochlear) 의고실계 (scala tympani) 와전정계 (scala vestibuli) 에는외림프액이, 중심계 (scala media) 에는내림프액이존재하며, 전정기관 (vestibular organ) 에서는이석기관 (otolith organ) 인난형낭 (utricle) 과구형낭 (saccule), 세개의반고리관 (semicircular canal) 에는내림프액이존재한다. 내림프의이온성분은세포내액 (intracellular fluid) 과유사한조성 ( 고농도의 K +, 저농도의 Na + ) 을가지고있으며, 외림프액의이온성분은세포외액 (extracellular fluid) 의조성과유사하다. ( 저농도의 K +, 고농도의 Na + ) 내림프액은혈관선조 (stria vascularis) 의변연세포 (marginal cell) 에서생성되며내림프낭 (endolymphatic sac) 에서흡수되는것으로알려져있다. 1,2 내림프액이세포내액과유사한농도를유지하기위해서는계속해서 K + 이내림프액내로들어와야하는데, 이러한내림프액내로의 K + 의이동은변연세포의기저외측부에서 Na, K-ATPase와 3 Na + -K + -2Cl - cotransporter - 3 -
(NKCC1) 2,4 를통하여이루어진다고보고되어져왔다. NKCC1은상피세포와비상피세포모두에서세포막을통해양이온인 Na + 와 K + 가두개의 Cl-와같이이동하여전해질균형을맞추는체계이며, 신장, 비점막뿐만아니라전해질이동이있는모든기관에분포한다. NKCC1의역할은전해질의이동과항상성유지, 세포의용적조절등이주인것으로보고되어지고있다. 5,6 내이에서 NKCC1이고농도로발현되는것을보고한경우가있으며, 변연세포의기저외측뿐만아니라말초전정계의암세포 (dark cell) 에서도발현되는것으로보고된바있다. 7,8,9 지금까지 NKCC1이결핍된귀에서광학현미경적이상에대한연구는몇차례보고된바있었으며, 이들모두와우의구조변화에대한것만기술이되어있다. 10,11,12 대표적인와우의구조이상은 Reissner 막의와해 (collapse), 이로인한내림프강의소실또는축소등이고 11,12 그외에도개막 (tectorial membrane) 에의 calcium 침착, Corti 관 (tunnel of Corti) 의소실, 유모세포 (hair cell) 와지지세포 (supporting cell) 수의감소등이있다. 전정계의이상에대한조직학적연구는아직미진한상태이다. NKCC1이결핍되었을때나타나는구조적이상뿐만아니라여러신체의기관에어떤영향을미치는지에대한연구는몇차례있었다. 주로 NKCC1이결핍된백서에서실험을한것이며, 대표적인이상은불임, 장에서염소 (chloride) 분비감소, 타액의심각한감소, 전정기능장애로인한평형감각이상및청각소실등이보고되었다. 10,11,13 전정말초기관에서는전해질의이동을통해내림프액의전해질농도가조절되므로, NKCC1 같은전해질이동체계가존재할가능성이높으나, 아직이에대한연구가없다. NKCC1의기능이파괴되어있다면전정말초기관의구조에어떠한영향을미치는지도연구가안되어있는상태이다. 그래서본연구의목적은 NKCC1이결핍된백서 (knock out mouse) 에서정상백서와비교하여전정기관의구조변화를알아보고자함이다. - 4 -
II. 재료및방법 1. 조직의채취 연구에이용예정인백서는 Sla12a2 Δ506-521 종이다. 이는 NKCC1 형성에관여하는유전자 (Sla12a2 gene) 를파괴시켜생성시켰으며, Pace 등 13 이만든종을이용하였다. 2. 조직의처리 백서의 gm 당 1.42mg의 71mM avertin(2,2,2-tribromoethanol) 을이용해 5 마리의정상백서와 8마리의 NKCC1 결핍백서 (knock out mouse) 를마취시킨후두부를절단한다음, 두부는시상면으로절개하여뇌를제거하고내이를절제하여노출시킨다음에 4 의포르말린고정액에 24시간고정시켰다. 고정된조직은 0.1M EDTA 용액에서탈칼슘화 (decalcification) 를시켰다. 3. 조직의분석 탈캄슘화된조직은세척및파라핀포매를시행하였고, 4 μm두께로절편을 자르고 xylene 으로파라핀을제거하였다. 그다음 Hematoxylin-Eosin 염 색을시행한후광학현미경 (Olympus, Japan) 으로관찰하였다. - 5 -
III. 결과 1. NKCC1 이결핍된백서의행동 NKCC1이결핍된백서는정상과비교하여외관상에는차이가없었으나행동에서특이한이상을보여정상과쉽게구분되었다. 앉아서정지하고있을경우정상백서는움직임이전혀없었으나, NKCC1이결핍된백서는실험대상인 8마리모두머리를고정하지못하고좌우로흔드는이상행동을보였다. 일정한구간을이동하게하였을경우에정상백서는목표지점에일직선으로동요없이이동하였으나, NKCC1이결핍된백서는모든경우에서목표지점에이르지못하고계속해서중심을잃고제자리에서빙빙도는이상행동을보였다. 운동중에는평형감을상실해서운동시에부자연스러운모습을보였다. 즉 NKCC1이결핍된백서는모두에서전정기능이상에합당한소견을보였다. ( 그림 1) 그림 1. 이상행동을보이는 NKCC1 이결핍된백서 정상백서는제자리에서가만히있어도신체균형을유지하는데반해 NKCC1 이 결핍된백서는그림에서와같이한방향으로빙글빙글도는행동양상을보였다. - 6 -
2. 광학현미경적관찰 가. 백서내이의전반적인광학현미경적소견 정상백서와 NKCC1이결핍된백서의내이를광학현미경을통해비교하였다. ( 그림 2) 정상백서의경우난형낭 (utricle) 과구형낭 (saccule) 은형태가모두잘유지되고, 이석막 (otolithic membrane) 과평형반 (macule) 의구조가잘유지되고전정과반고리관의형태도잘유지되어있다.( 그림 2.A) 정상백서에비해 NKCC1이결핍된백서는전정과반고리관의크기가정상백서에비해감소하여있으며, 불규칙하며위축된구조변화를보였다. 그림 2. 내이의전반적인광학현미경적소견 (H-E염색, x20, Bar=50μm ) A. 정상백서의전정기관. 이상소견없고전정기관과반고리관 ( 화살표 ) 의크기가정상이고내림프강이잘유지되고있는것을볼수있다. B. NKCC1이결핍된백서의전정기관반고리관의크기가감소되어있고, 내림프강이좁아져있으며 ( 화살표 ), 전정기관이위축되어있는것을볼수있다. 전정기관의골격자체는정상과비교해서형태학적변화는거의보이지않았다. - 7 -
내림프강 (endolymphatic space) 이축소되어있었고, 상대적으로외림프강 (perilymphatic space) 는확장되어있었다. 와우의막성미로도전정기관과마찬가지로내림프강이수축되어있었다. 그러나와우의골성구조는정상과비교하여큰차이는없었다.( 그림 2.B) 전정기관의전반적양상을보면반고리관과이석기관모두정상과비교하여 NKCC1이결핍된백서는막성미로의위축과그로인한내림프강의축소, 감각세포의감소및팽대정의점액성구조소실과이석과이석막의소실로인한변형이관찰되었다.( 그림 3) 그림 3. 팽대부릉과평형반의광학현미경적소견 (H-E 염색, x200, Bar=200μm ) A. 정상백서팽대부릉의구조는말안장모양이잘유지되어있으며, 점액질의팽대정의모양도잘보인다. 막성미로의형태는잘유지되어있고, 내림프강및외림프강의형태도잘유지되고있다. 평형반에도이석막의형태가잘유지되고있다. B. NKCC1이결핍된백서막성미로가팽대정위에위축되어있었으며, 그로인해내림프강이좁아져있었다. 팽대정의점액성구조도소실되어있다. 평형반의경우이석막의형태도파괴되어있으며정상백서와비교하여감각세포의수도감소되어있는소견이다. - 8 -
나. 전정기관의세부구조의광학현미경적소견 1. 반고리관, 팽대부릉, 팽대정의형태변화 정상백서의경우팽대부릉 (crista ampullaris) 의형태는잘유지되고있었고, 팽대정 (cupula) 의점액성분도잘보였다. 그리고내림프강및외림프강의형태도잘유지되고있었다.( 그림 4.A) 그에반해 NKCC1이결핍된백서의경우에막성미로가팽대정위에위축되어있었으며, 그로인해내림프강이좁아져있었다. 팽대정의점액성구조도소실되어있었다.( 그림 4.B) 그림 4. 반고리관의팽대부릉주위의현미경적소견 (H-E 염색, x200) A. 정상백서팽대부릉의구조는말안장모양이잘유지되어있으며, 점액질의팽대정의모양도잘보인다. 막성미로의형태는잘유지되어있고, 내림프강및외림강의형태도잘유지되고있다. B. NKCC1이결핍된백서막성미로가팽대정위에위축되어있었으며, 그로인해내림프강이좁아져있었다. 팽대정의점액성구조도소실되어있다. - 9 -
반고리관을수직으로잘라반고리관내부를관찰하였을때, 정상백서의경우정상적인골격이유지되고있고, 반고리관내부에서막성미로의형태가잘유지되고있었으며, 내림프강과외림프강의형태도잘유지되고있었다.( 그림 5.A) 그에반해 NKCC1이결핍된백서에서반고리관의크기는정상에비해현저하게감소하여있었고, 막성미로의위축으로인해내림프강의용적이거의없을정도로좁아져있었으며, 상대적으로외림프강의공간이넓어져있는소견이관찰되었다. 반고리관자체의골격은어느정도유지되고있었다.( 그림 5.B) 그림 5. 반고리관의현미경적소견 (H-E 염색 x200) A. 정상백서막성미로의형태는잘유지되어있고, 내림프강및외림프강의형태도잘유지되고있다. B. NKCC-1이결핍된백서반고리관자체가정상에비해감소하여있고, 반고리관내의막성미로가위축되어있었으며, 그로인해내림프강이대단히좁아져있다. - 10 -
고배율에서는팽대부릉과평형반의형태를더자세히관찰할수있었다. 반고리관의팽대부릉의경우정상에비해 NKCC1이결핍된백서는막성미로의위축이저배율에비해더잘보였으며, 내림프강의공간이거의없는것을확인하였다. 그리고정상에비해감각세포의수가감소해있었다.( 그림 6). 그림 6. 반고리관의팽대부릉주위의현미경적소견 (H-E 염색, x400, Bar=200μm ) A. 정상백서팽대부릉의구조는말안장모양이잘유지되어있으며, 점액질의팽대정의모양도잘보인다. 막성미로의형태는잘유지되어있고, 내림프강및외림강의형태도잘유지되고있다. B. NKCC1이결핍된백서막성미로가팽대정위에위축되어있었으며, 그로인해내림프강이좁아져있었다. 팽대정의점액성구조도소실되어있다. 정상에비해서유모세포의수가감소해있다. - 11 -
2. 이석기관의형태변화 이석기관의평형반의경우정상백서에서는이석막의형태가잘유지되고유모세포도잘유지되어있는소견을보였으나,( 그림 3.A) NKCC1이결핍된백서의경우에이석막의형태도파괴되어있으며정상백서와비교하여감각세포의수도감소되어있는소견이다.( 그림 3.B) NKCC1이결핍된백서이석기관의평형반의고배율현미경소견중특이한것은이석의수가정상에비해상당히감소하였으나신경상피자체의모양은정상에유사하게잘유지되고있었다는점이다. 평형반에서도다른부위와마찬가지로막성미로의위축과내림프강의감소된소견이관찰되었다.( 그림 7) 그림 7. 이석기관의평형반주위의현미경적소견 (H-E 염색, x400, Bar=200μm ) A. 정상백서막성미로와신경상피의모양이잘보전되어있다. 이석기관의평형반의모양과이석도은잘유지되어있다. B. NKCC1이결핍된백서막성미로가위축되어있으며, 그로인해내림프강이좁아져있다. 이석의숫자는정상에비해상당히감소한소견이다. 그러나신경상피자체의모양은잘유지되고있다. - 12 -
IV. 고찰 내림프액의이온구성은고농도의 K + 과저농도의 Na + 으로되어있으며이는세포내액의구성과유사하다. 이러한전해질항상성의유지는와우내전위 (endocochlear potential) 를생성하는데뿐만아니라내이내세포용적유지에도중요한역할을담당한다. 내이에서이러한전해질항상성유지는주로 Na + -K + -2Cl - cotransporter(nkcc) 를이용하는것으로보고되어져있다. 2,4 이러한 NKCC은 2개의유형이존재하는데세포막의기저외측에서분비기능이주인 NKCC1과세포막첨부에서흡수기능을주로하는 NKCC2이다. NKCC1은다양한기관에분포하는데반해 5,10, NKCC2는신장에만존재한다고알려져있다. 14 NKCC1은전해질이동이있는모든기관에존재하며, 양이온인 Na + 와 K + 이 2개의 Cl - 와동시에세포막을통해이동하여와우내전위 (endocochlear potential) 을생성하는것으로알려져있다. 15 내이기관에서 NKCC1에대한연구는전정기관보다는주로와우에대한연구가많이되어있으며, 와우내에서는혈관조 (stria vascularis) 변연세포 (marginal cell) 에서의발현이주로보고되어져있다. 7 Dixon(1999) 등은 NKCC1이내림프액의형성과세포용적유지에가장중요한역할을하는전해질이동경로이며, 다른전해질이동통로와도긴밀한상호작용을한다고설명하였으며, 이러한 NKCC1이생체에존재하지않거나기능을안할경우난청과평형기능의장애를유발하고해부학적으로도이상을일으킬수있다고보고하였다. 16 NKCC1이결핍될경우실제생체에서는어떤변화가일어나는지알아보기위해서는지금까지주로 NKCC1을인위적으로제거된백서를이용한동물실험이이용되어왔다. NKCC1이결핍된백서는정상에비해발육이부진하고청력이떨어져있으며균형감각을잘못잡아제자리에서빙빙도는행동 (circling behavior) 을하였으며, 전해질항상성유지실패로인해 28% 에서는사산하였고, 저혈압, 소화기관및호흡기에서염소이온분비감 - 13 -
소등을보인다고보고되었다. 11 기존의연구중동물실험에서내이의기능중청력은뇌유발전위청력검사를통해객관적인결과를내는데성공하였고, 실제로 NKCC1이결핍된백서에서고도이상의난청이존재함을확인한연구가있었다. 11 아직까지평형기능을객관적으로측정하여보고한연구는이루어지지않았다. 본연구에서실험에이용한백서는 Pace(2000) 가만든종을이용하였으며, 13 정상에비해과다활동과계속제자리에서빙빙도는행동을보였다. 이러한운동중에계속해서중심을잃고평형감을상실해서운동시부자연스러운모습을보였다. 이러한점들과본연구의결과에서보듯이전해질불균형에의한전정기관의심한구조적변형이평형기능의감소를일으키는것으로사료된다. 아직까지백서에서객관적인평형기능을측정하는것에는한계가있고, 현재까지의연구들은명백한이상행동으로주관적인판단을하였는데, 앞으로객관적인평형기능을평가하는방법을개발하여연구에응용하면더의미있는연구가될것으로생각된다. 양이온과음이온이같이세포내로이동하는체계 (cotransporter) 를억제하는이뇨제 (furosemide, bumetanide 등 ) 는이독성을유발하는것으로알려져있다. 17 임상적으로상당히많이이용되는이러한이뇨제에의한이독성으로는가역적인감각신경성난청이 furosemide 투여후바로나타날수있다고하는데, 어지럼과동시에나타날수도있다. 8 이러한결과는인체의전정기관내에 NKCC1의존재여부를설명할수있다고설명한보고가있다. 10. NKCC1이파괴되어있다면, 전해질이동에지장이생겨세포내의전해질항상성이파괴되고이로인해세포용적조절기능을상실하게되어결국세포의변형으로인해구조적변화가발생한다. NKCC1이없는경우의내이형태변화적연구는주로동물을이용한실험을해왔으며, 내이중에서대부분와우쪽의연구가주를이루고있다. 지금까지보고된와우의이상중대표적인것은 Reissner 막의와해와이로인한와우관 (cochlear duct) 의위축으로알려져있으며, 12 Reissner 막이와해되는기전으로는와 - 14 -
우혈관조의변연세포에서의 K + 분비가감소함으로서, 이와관련된물의분비가억제되어서내림프액의양이감소하고이로서내림프강의용적이감소함으로서 Reisnner 막의변형이온다고보고하였다. 12 내림프강내에수분과 K + 은완전히없어지지않고약간남아있는데, Na, K-ATPase에의한분비작용에의해서 NKCC1이없어도수분과 K + 이세포내로들어가기때문이다. 18 결과적으로 NKCC1이결핍되어있으면내림프액의생성이안되기때문에내림프액이감소하게된다. 세포내로의 K + 분비는 NKCC1 뿐만아니라 Na, K-ATPase 등에의해서도일어난다. 19 그러나 Na, K-ATPase 만으로는 K + 의분비가충분하지않고, NKCC1이 K + 분비에더중요한역할을하게된다. 이러한 NKCC1이결핍된백서에서는내림프액이감소하고 Reissner 막의와해가나게된다. 그러므로 NKCC1은세포용적유지및생성에절대적으로필요한이온의통로라고보고하였다. 12 그이외의와우의변형으로는혈관조에서심층부와변연세포사이의공간의증가, Reissner 막의완전파괴, 개막 (tectorial membrane) 에칼슘침착, Corti 관의소실및외유모세포수의감소와지지세포수의감소및변형등이보고되었다. 10,11 Pace(2000) 는 NKCC1이결핍된백서의와우를전자현미경으로관찰하였는데, 특이소견으로 Reissner 막의세포층이정상에서는 2층인데비해 NKCC1이결핍된백서는 3-4층으로늘어나있고, 개막에과립형침착물이있으며, 혈관조의변연세포의용적이감소되어있고미토콘드리아 (mitochondria) 의수가증가해있는이상을보고하였다. 12 전정기관의구조변화에대한연구는잘이루어지지않았으며, Flagella(1999) 등은 NKCC1이결핍된백서의분비기관의구조적변화를보고하였는데, 주로소화기쪽에더비중을두었고, 전정기관의구조변화에대해서는간략하게기술하여보고한바있다. 11 이보고에따르면정상백서에비해 NKCC1이결핍된백서의전정기관의광학현미경적소견은반고리관의경우막성미로의상피세포는정상적으로존재하지만팽대정 (cupula) 위로위축된소견을보였고, 결과적으로외림프강이상대적으로 - 15 -
팽창되어있는소견을보였다. 이석기관의경우도막성미로의위축과불규칙한소견이보인다고기술하였는데, 구형낭이난형낭보다변형이심하다고기술하였다. Dixon(1999) 등은정상과 NKCC1이결핍된백서의내이의형태학적비교를시행하였는데, 와우의변형을보고하면서전정기관의기형도일부언급하였다. 이보고에서반고리관을이루는골구조가얇아져있으며, 반고리관자체의반경도정상에비해 NKCC1이결핍된백서가더작아져있었으나, 골성미로자체의변형은없다고하였다. 17 세개의반고리관중수평반고리관의변형이가장심하다고한다. 그이유로는발생학적으로수평반고리관이세개의반고리관중가장늦게형성되기때문이라고알려져있다. 20 본연구에서도유사한변형이관찰되었는데, 반고리관의크기가정상에비해더감소되어있고, 팽대정의점액구조가소실되고이석막의파괴가진행되어있는것을발견하였다. 그러나와우의막성미로가심하게변형되어있는것에반해골성구조는대체로정상적인형태를유지하였다. 이는과거와우의형태학적연구와도같은결과이다. 반고리관의형성이완전히되지않은상태에서도 NKCC1에의한전해질이동은존재할것이며, NKCC1이결핍되어내림프액의생성에문제가생겨서내림프액의용적이감소하게되어서반고리관의크기가줄어들고얇아질수있다고추정된다. 본연구에서전정기관특히반고리관의골구조의크기가정상에비해감소되어있었는데, NKCC1의결핍에의해서막성미로뿐만아니라전정기관의골성구조의형성에도영향을미치는것으로사료되며, 와우에비해전정기관의변형이더큰것으로사료된다. 이는아마도외림프강에대한내림프강이차지하는비중이와우에비해전정기관이더크거나전정기관의내림프액생성과정에서 NKCC1의비중이와우보다더클것이라고추정된다. 와우에서와마찬가지로전정기관의구조변화중가장중요한것은내림프공간의위축인데, 내림프공간이완전히없어지는경우는드문것으로보고되고있다. 그이유로는와우에서처럼전정기관에서도 NKCC1이전해질항상성을유지하는데가장중요한역할을하지만, Na, - 16 -
K-ATPase와같은다른전해질이동체계가존재하기때문일것이다. 본연구에서도막성미로의위축에의한내림프강이정상에비해감소한것으로나왔으나, 완전히내림프강이없어진경우는없었다. NKCC1이결핍된백서가한방향으로빙빙도는현상을보이는것도전정기능이완전히파괴되지않고어느한쪽이상대적으로덜파괴되어나타나는것으로생각된다. 이러한형태학적인이상에의해평형기능의장애가유발되는것으로추정되며, 향후에더객관적인평형기능측정이필요할것으로사료된다. 내이에서 NKCC1의위치를찾기위한연구는주로전정기관보다는와우에서많이되어왔는데, 혈관조변연세포에서 NKCC1이주로발현된다는연구결과가몇차례있었다. 2,7,8 다른동물실험에서는태아기에 Reissner 막, 일부지지세포그리고 Corti 기관의미성숙상피세포에서도발견되었다. 9 Crouch(1997) 등은정상백서의내이에서면역화학염색과역전사중합효소반응을이용하여더정확한부위를찾아내었는데, 와우혈관조변연세포의기저외막에서 NKCC1이주로존재한다고보고하였으며, 변연세포기저막뿐만아니라나선형인대 (spiral ligament) 의아래쪽에위치한제2형섬유세포 (type 2 fibrocyte) 에서도발현됨을발표하였다. 7 이들은전정기관에서도동일한연구를시행하였는데, 반고리관의팽대부릉 (crista ampullaris) 에있는암세포 (dark cell) 에주로발현하는것으로보고하였으며, 감각신경상피 (neurosensory epithelium) 배열의아래쪽에있는섬유세포에서도발현됨을보고하였다. 앞에서도언급했듯이세포내로의 K + 의이동은 NKCC1 뿐만아니라 Na, K-ATPase에의해서도일어난다. Na, K-ATPase가풍부하다고알려진나선형신경절 (spiral ganglion) 과그구심신경말단에서는 NKCC1이발현이안되었고, Reissner 막과지지세포에서도 NKCC1이없다는보고가있다. 7 이를토대로보면, NKCC1은 Na, K-ATPase과더불어내이내전해질이동에관여하는중요한통로역할을하지만, 내이내의모든기관에분포하지않고특정부위에서만기능을하는것을유추할수있었다. 전정기관내에서더정확한위치확인을위하 - 17 -
여차후에전정기관에역전사중합효소반응이나대한면역화학염색법을이 용하여야할것이다. - 18 -
V. 결론 NKCC1이결핍된백서는정상백서와비교하여전정기관에해부학적으로많은변형이관찰되었다. 와우와비교하여전정기관의변형이더심한것을확인하였다. 향후에 NKCC1의전정기관내의정확한위치를파악하는것과평형기능의객관적평가를통한 NKCC1과내이기능의상관관계를밝혀내는것에대한연구가더필요할것으로생각한다. - 19 -
참고문헌 1. Wangemann P. Comparison of ion transport mechanisms between vestibular dark cell and strial marginal cell. Hear Res 1995;84:149-57. 2. Wangemann P, Liu J, Marcus DC. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hear Res 1995;84:19-29. 3. Konishi T, Hamrick PE, Walsh PJ. Ion transport in guinea pig cochlear. I. potassium and sodium. Acta Otolaryngol 1978;86:22-34. 4. Ikeda K, Morizono T. Electrochemical profiles for mono valent ions in the stria vascularis: cellular model of ion transport mechanism. Hear Res 1989;39:279-86. 5. Haas M, Forbush B. The Na-K-Cl cotransporter of secretory epithelia. Annu Rev Physiol 2000;62:515-534. 6. Russell JM. Sodium potassium chloride cotransport. Physiol. Rev 2000;80:212-7. 7. Crouch JJ, Sakaguchi N, Lytle C, Schulte, BA. Immunohistochemical localization of the Na-K-Cl cotransporter(nkcc1) in the gerbil inner ear. J Histochem Cytochem 1997;45:773-778. 8. Goto S, Oshima T, Ikeda K, Ueda N., Takasaka T. Expression and localization of the Na-K-2Cl cotransporter in the rat cochlea. Brain Res 1997;765: 324-6. 9. Sakaguchi N, Crouch JJ, Lytle C, Schulte, BA. Na-K-Cl cotransporter expression in the developing and senescent gerbil cochlea. Hear. Res. 1998;118: 114-22. 10. Delpire E, Lu J, England R, Dull C, Thorne T. Deafness and imbalance associated with inactivation of the secretory Na-K-2Cl - 20 -
co-transporter. Nat Genet 1999;22:192-5. 11. Flagella M, Clarke LL., Miller ML, Erway L, Giannella RA., Andringa A et al. Mice lacking the basolateral Na-K-2Cl cotransporter have impaired epithelial chloride secretion and are profoundly deaf. J Biol Chem 1999;274: 26946-55. 12. Pace AJ, Madden VJ, Henson OW, Koller BH, Henson MM. Ultrastructure of the inner ear of NKCC1-deficient mice. Hear Res 2001;156:17-30. 13. Pace AJ, Lee E, Athirakul K, Coffman TM, O'Brien DA, Koller BH. Failure of spermatogenesis in mouse lines deficient in the Na + -K + -2Cl - cotransporter. J Clin Invest 2000;105:441-50. 14. Gamba G, Miyanoshita A, Lombardi M, Lytton J, Lee WS. Molecular cloning, primary structure and characterization of two members of the mammalian electroneutral sodium-potassium-chloride cotransporter family expressed in kidney. J Biol Chem 1994;269:17713-22. 15. Haas M. The Na-K-Cl cotransporters. Am J Physiol 1994;267:865-9. 16. Dixon MJ, Gazard J, Chaudhry SS, Sampson N, Schulte BA, Steel KP. Mutation of the Na-K-Cl co-transporter gene Slc12a2 results in deafness in mice. Human Molecular Genetics 1999;8:1579-84. 17. Ikeda K, Oshima T, Hikada H, Takasaka T. Molecular and clinical implication of loop diuretic ototoxicity. Hear Research 1997;107:1-8. 18. Iwano T, Yamamoto, A Omori K, Kawasaki K, Kumazawa T, Tashiro Y. Quantitative immunocytochemical localization of Na, K-ATPase α-subunit in the lateral wall of rat cochlear duct. J Histochem Cytochem 1990;37:353-63. 19. Kerr TP, Ross MD, Ernst SA. Cellular localization of Na, - 21 -
K-ATPase in the mammalian cochlear duct: Significance for cochlear fluid balance. Am J Otolaryngol 1982;3:332-8. 20. Jackler RK, Luxford WM, House WF. Sound detection with the cochlear implant in five ears of four children with congenital malformations of the cochlea. Laryngoscope 1987;97:15-7. - 22 -
Abstract Morphologic change of the vestibular organ in the Na + -K + -2Cl - cotransporter deficiency mouse Ju Hyoung Lee Department of Medicine The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Won-Sang Lee) The fluid of inner ear is composed two components; perilymph and endolymph. The ion concentration of endolymph is similar to intracellular fluid(low sodium and high potassium). For maintaining of this electrolyte homeostasis, potassium is continuously influxed to endolymph with ion transport system, such as Na, K-ATPase and Na + -K + -2Cl - cotransporter(nkcc1). NKCC1 is cation-coupled chloride transporter, which participates in vectorial slat transport, ion gradient homeostasis and cell volume regulation in diverse tissues. The purposes of this study were to investigate the morphology in the vestibular system of KCC1-deficient mice(knock out mice). The NKCC1-deficient mouse line used for this study was Sla12a2. Histologic examination of inner ear especially vestibular system was performed in normal and knock out mouse. Histologic exam revealed irregular shape and decreased size and wall thickness of vestibule and semicircular canal, collapse of membranous labyrinth and endolymphatic space, absence of gelatin material in crista - 23 -
ampullaris and reduced hair cells. In summary, NKCC1 plays essential roles in the formation of critical components of vestibular apparatus and electrolyte homeostasis in vestibular organ. Key words: ion transport, vestibule, knock out mouse - 24 -