https://doi.org/10.7742/jksr.2017.11.3.147 Change of Surviving Fractions based on the Recovery of Potentially Lethal Damage in HFL-I Cell Line Eunae Choi Department of Bio-convergence Engineering, Korea university Received: May 21, 2017. Revised: June 15, 2017. Accepted: June 30, 2017 ABSTRACT Potentially lethal damage repair (PLDR) in HFL-I was investigated by delayed plating experiments. The surviving fraction data were fitted to the linear Quadratic equation (LogSn=-nγ(αd+βd 2 ) where γ=1 for immediate plating). And a repair factor γ was developed to compare survival for immediate and delayed plating. When we only took into account the repair factor of PLDR γ which was derived from the delay assay, the cell survival response th fractionated carbon ion irradiation was not fully matched. This gap suggested that consideration of another repair process is necessary. So this suggests that the various repair process plays an important role in the fractionated irradiations. Keywords: Potentially lethal damage repair, Marchese model, Surviving fraction, HFL-I Ⅰ. INTRODUCTION 탄소빔은비정의끝부분에서에너지전달상승에의한흡수방사선량이높은구역인브래그피크가발생하는특이성이있다. 이는 X선과는극히대조적인방사선량분포를갖는다. 실제임상적용시에는넓은암부위에균일한방사선량이전달되도록하기위해여러깊이에서발생시켜브래그피크를중첩시킨 SOBP(Spr ead Out Bragg Peak) 를사용한다. SOBP 구간은월등히높은생물학적효과비를 (Relative Biologic Effectiv eness, RBE) 를가지기때문에정확한선량분포가요구된다. [1] 이러한 SOBP 구간의높은 RBE는암조직주변의정상조직손상에대한우려로이어져이에대한해결책으로분할조사를시행하고있으며 interval 시간동안정상조직이회복과재생의가능성을지원해준다. 그러나 interval 시간동안암조직역시회복과재생의가능성이있다. 즉 interval 시간을주는것은 Hypoxic tu mor cells 의 Repopulation 과 Reoxygenation 허락해 줌으로써역선량효과가될수있음을뜻한다. [2] 이에대해 Regrowth, Resensitization, Sublethal dam age Repair가치료성적에지대한영향을미친다고보고되고있지만대부분치료결과의 modeling 과정에서 static tumor만고려되고있다. [3] 또한 Tumor control pr obability (TCP) model은일반적으로 surviving cells 의 Poisson approximation 분포를기본으로한정의로써세포사는 single hit mechanism 혹은 Linear Quadra tic model (LQ model) 을따르는데이러한이론은분할조사사이의 interval 시간동안세포가완전한회복이되었다고가정한다. [4] 완전한회복에성공하였다고가정할시 100 kev/μm 탄소빔을조사하여 single 조사와 fraction 조사에서다른결과를보이는오류를보인다. [5] 즉 X선과달리탄소빔분할조사시회복량의변화가있음을알수있으며다양한회복의구조를가지고있어이를반드시고려하여야한다. [6] 오류를해결하고자다양한생물리학적모델이제안되어져오고있으며치료성적향상을위한다양한시도가되어지고있다. [7,8] * Corresponding Author: Eunae Choi E-mail: eunae0815@gmail.com Tel: +82-10-4578-0146 Address: Hanagwahaggwan 411, Anamlo-145, Seongbuggu, Seoul
Change of Surviving Fractions based on the Recovery of Potentially Lethal Damage in HFL-I Cell Line 본연구는 HFL-I 셀라인에 13.18keV/μm의탄소빔조사후 immediate assay와 delayed assay를시행하였다. 그리고세포생존율의데이터를얻어이를바탕으로 12시간, 36시간, 48시간후발생한 Potentially Lethal Damage Repair (PLDR) 의양을측정하였다. 또한탄소빔분할조사시 interval 시간안에발생되는회복의양과비교하였다. PLDR만고려된 marchese model에적용하여 γ값을계산한후비교해봄으로써다른회복매커니즘의존재를확인하고이를적용할수있는새로운파라미터를고려하고자한다. Ⅱ. MATERIAL AND METHODS 1. 조사전준비본연구에서는 RIKEN BRC cell bank에서분양받은 HFL-I 셀라인을사용하였다. (Cell No. RCB0521) 미디아는 10% fetal bovine serum를함유한 Eagle's min imum essential medium (MEM; Nissui Pharmaceuical) 를사용하였다. 75cm 2 플라스틱플라스크 (BD Falcon) 에서 37 의온도와 5% CO 2 를제공하는환경에서배양하였다. 탄소빔조사 3일전에 0.15 ~ 5.5Gy 선량별로다양한세포의농도로 25cm 2 플라스틱플라스크에플레이팅하였다. 이세포들은플레이팅후탄소빔조사직전에거의 confluent한상태가된후방사선조사가진행되었다. 방사선조사는일본의 National Institute of Ra diological sciences(nirs) 내에위치한 Heavy Ion Me dical Accelerator(HIMAC) 로가속한탄소빔을사용하였다. 탄소빔의 initial energy는 290MeV/u이었다. Lucit e absorber 를활용하여 13.18keV/μm 의저 LET 에너지의탄소빔을만들어사용하였다. 방사선량은 25cm 2 플라스틱플라스크에담긴 HFL-I셀라인의위치로조절하였다. 선량률은 1.2Gy/min이었다. 2. PLDR 측정 PLDR의양은 immediate plating과 delayed plating 을시행한후그차이를비교하여측정할수있다. 각각다른농도의셀라인샘풀은탄소빔조사후즉시한 dish당약 70개의콜로니생성을위해 10cm dish에플레이팅하였다. 그리고 PLDR 발생을제공하지않기위 해탄소빔조사된세포를즉시 colony assay를시행하는 immediate plating을하였다. 또한 delay plating 함으로써 PLDR을지원해주고생존율을측정하여 immed iate plating의양과비교하여측정하였다. delayed time 동안세포는 37 의온도와 5% CO 2 를제공하여인큐베이터하였다. 12시간, 36시간, 48시간후 delayed plati ng하여 colony를형성시켰다. 2. 분할조사후확인분할조사는 24시간의 interval 시간으로총 1~4번으로조사하였다. 마지막조사가끝나면 1시간안에 colo ny assay를시행하였다. 2주후 colony가형성이되면 2 0% 메탄올로고정시키고 0.2% 크리스탈바이올렛으로염색하였다. 생존하였다고판단하는 colony 는최소 50개이상의세포이며 interval 시간동안 HFL-I 셀라인은 3 7 의온도와 5% CO 2 를제공하는 incubator에두어 S LDR PLDR 동시에지원해주었다. Ⅲ. RESULT HFL-I 셀라인에 13.18keV/μm의탄소빔조사후 im mediate assay와 delayed assay를시행하였다. immedia ted assay를시행한실험값은 PLDR이발생하지않았으므로 marchese model에서 γ는 1이되어 LQ survival model과동일하다. mathematica software (ver.9.0) 를이용하여 Table 1과같이 α,β,α/β 파라미터값을얻었다. 그리고 colony assay를통해세포생존율의데이터를얻어이를바탕으로 12시간후발생한 Fig 2와같이 P LDR의양을측정하였다. 그리고 36시간후발생한 PL DR의양을확인하고 Fig 3 과같이 3γ값을확인하였다. 48시간후발생한 PLDR의양을 Fig 4와같이측정하였다. delayed time 동안 cell이 confluent 한상태로두어 PLDR을적극적으로지원해주고 marchese mo del을이용하여 γ값을얻었다. delayed time이길어질수록 γ값은감소하여 PLDR의증가를확인하였다. 또한 HFL-I 셀라인을활용하여 24시간의 interval 시간으로탄소빔분할조사를시행하였다. 한번의 interval 시간을가지는 2fraction 조사후 marchese model을이용하여 γ값을계산하였다. 두번의 interval time을가지는 3fraction 조사후, 세번의 interval time을가지는
4fraction 조사후 marchese model을이용하여 γ값을계산하였다. γ값이감소함을확인하였으며 fraction 수가많아질수록 Table 2와같이 PLDR의양이증가하고있음을확인하였다. Table 1. α, β, α/β values of single fraction derived by the LO fit to the data 13keV HFL-I α(gy -1 ) β(gy -2 ) α/β(gy) 0.65 0.03 21.67 Table 2. γ values derived by the marchese model fit to the data γ LogSn=-nγ(αd+βd 2 ) Fig. 1. Dose-response curves of the HFL-I death by 12hour delayed plating. filled circle: immediate assay, open circle: 12hour delayed assay. (horizontal axis: Fig. 2. Dose-response curves of the HFL-I death by 36hour delayed plating. filled circle: immediate assay, open circle: 36hour delayed assay. (horizontal axis: Fig. 3. Dose-response curves of the HFL-I death by 48hour delayed plating. filled circle: immediate assay, open circle: 48hour delayed assay. (horizontal axis: 12h delay 36h delay 48h delay 0.71 0.56 0.44 2fraction 3fraction 4fraction 0.67 0.40 0.37 Ⅳ. DISCUSSION AND CONCLUSION PLDR은 cell이 confluent한상태이거나세포분할이연기될때나타난다. [9] 따라서본연구에서는탄소빔조사후 12시간, 36시간, 48시간동안 cell을 confluent 하게두고 delayed assay를시행하고 γ값을구하였다. delayed time에따라 PLDR이증가함을보였다. PLDR 을고려한파라미터를 γ 라두었을때 n번분할조사시 PLDR은 n번반복되어 LogSn=-nγ(αd+βd 2 ) 로계산할수있다. [10,11] 분할조사시 interval 시간에일어나는 PLDR은방사선조사후 cell cycle이 6시간이상되면고려된다. 분할횟수에따라회복양을합한값으로나타낼수있다. [12] 탄소빔의 1분할, 2분할, 3분할, 4분할조사시각각의 interval 시간동안나타나는 γ값역시감소하고있음을확인하였다. 그러나 γ값만감안한 marchese mod el을 surviving fraction값에적용시오류를보인다. 이는탄소빔분할조사시다른회복의매커니즘이존재함을뜻하여이를적용할수있는새로운파라미터가고려되어져야함을뜻한다. 실제탄소빔분할조사시의세포생존율은더많은회복양이감안되어져 surviving fraction값을상승함을알수있었다. PLDR의발생양을나타내는 γ값뿐만아니라또다른 repair의발생양이있었음을나타내며다른과정의 repair의양을포함하는파라미터가감안되어야탄소빔분할조사시적용가능할수있음을알수있다. 다양한회복의매커니즘
Change of Surviving Fractions based on the Recovery of Potentially Lethal Damage in HFL-I Cell Line 이존재함으로이를적용할수있는새로운파라미터가고려되어져야할것이다. Reference [1] masau suzuki, yoko kase, tatsuaki kanai, koichi ando "Change in radiosensitivity with fractionated-dose irra diation of carbon-ion beams in five different human cell lines" Radiation Oncology Biology. Physics. Vol. 48, pp 251-258, 2000. [2] Travis EL, Thames HD, Watkins TL, Kiss I, "The k inetics of repair in mouse lung after fractionated irra diation" International Journal of Radiation Biology an d Related Studies in Physics, Chemistry, and Medici ne, pp. 903-919, 1987. [3] Thames HD, "An 'incomplete-repair' model for surviv al after fractionated and continuous irradiations" Inter national Journal of Radiation Biology and Related St udies in Physics, Chemistry, and Medicine, pp 319-3 39, 1985. [9] Ang K, Thames HD Jr, van der Kogel AJ, van der Schueren E., "Is the rate of repair of radiation-induc ed sublethal damage in rat spinal cord dependent on the size of dose per fraction?", Radiation Oncology Biology. Physics. pp. 557-562, 1987. [10] Michael J. Marchese, "Potentially lethal damage repai r in cell lines of radioresistant human tumours and n ormal skin fibroblasts" International Journal of Radiat ion Biology and Related Studies in Physics, Chemist ry, and Medicine, Vol. 48, No. 3, pp. 431-439, 198 5. [11] Michael J. Marchese, "Potentially lethal damage repai r in human cells" Radiotherapy and Oncology, Vol. 9, pp. 57-65, 1987. [12] Jack E Fowler, "Is Repair of DNA Strand Break Da mage from Ionizing Radiation Second Order R ather Than First-Order? A Simpler Explanation of Apparen tly Multiexponential Repair", Radiation research, pp. 124-136, 1999. [4] Nilsson P1, Thames HD, Joiner MC, "A generalized formulation of the 'incomplete-repair' model for cell survival and tissue response to fractionated low doserate irradiation" Radiation biology, pp.127-142, 1990. [5] Dale RG1, Fowler JF, Jones B., "A New Incomplete -repair Model Based on a 'Reciprocal-time ' Pattern of Sublethal Damage Repair" Acta Oncologica, pp 9 19-929, 1999. [6] Taku Inaniwaa, Masao Suzuki, Takuji Furukawa, Yu ki Kase, Nobuyuki Kanematsu, Toshiyuki Shirai and Roland B. Hawkins, "Effects of Dose-Delivery Time Structure on Biological Effectiveness for Therapeutic Carbon-Ion Beams Evaluated with Microdosimetric K inetic Model" Radiation Research, pp. 44-59, 2013. [7] Eunae Choi, "Comparison of Linear-Quadratic model, Incomplete-Repair model and Marchese model in frac tionated carbon beam irradiation" Journal of the kore an society of radiology, Vol. 9, No. 6, pp. 417-420, 2015. [8] Seonghee Kang, Jeonghwan Kim, Dokyung Kim, Bos un Kang, "A Research on Superparamagnetic Iron O xide Nanoparticles Toxicity to U373MG Cell and its Effect on the Radiation Survival Curve" Journal of t he korean society of radiology, Vol. 6, No. 6, pp. 5 07-513, 2012.
최은애 고려대학교바이오융합공학과 요약 HFL-I 세포를이용하여 immediate assay 를시행하였다. 발생한 repair 의양이없기때문에 LogSn=-nγ(αd+β d 2 ) 에서 γ 의값은 1 이며이는 LQ model 과같다. 그리고세포생존율의데이터를바탕으로 α, β, α/β 의값을얻었다. 또한 12 시간, 36 시간, 48 시간후 delayed assay 를시행하여 marchese model 통해 γ 값을도출한후 Pot entially lethal damage repair (PLDR) 가발생한양을확인하였다. delay time 이길어질수록 γ 값은감소함으로써 PLDR 의양이증가함을확인하였고이에따라세포생존율은상승됨을보였다. 탄소빔의 1 분할, 2 분할, 3 분할, 4 분할조사시각각의 interval 시간동안나타나는 γ 값역시감소하고있음을확인하여 PLDR 의발생을확인할수있었지만 γ 값만감안한 marchese model 을 surviving fraction 값에적용시오류발생함을보였다. 이는탄소빔분할조사시다른회복의매커니즘이존재함을뜻하여이를적용할수있는새로운파라미터가고려되어져야할것이다. 중심단어 : 잠재적치사손상회복, marchese model, 세포생존율, HFL-I