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우리나라는 종자산업법 시행과 UPOV 었다. 가입에 의해 국내외적으로 종자시장과 무역규모가 커지게 되 육종목표를 설정할 때에는 국제경쟁과 수출을 염두에 두고, 또한 환경친화형 농업과 식량안보 등 을 고려해야 한다. 국제경쟁력을 높이려면 고수량, 생력기계화 적응성, 불량환경 적응성 등 생력저비 용 특성을 갖추어야 한다. 수출을 위해서는 품질의 고급화 다양화 및 다양한 환경적응성이 필수적이 다. 환경친화형농업은 저투입 지속농업, 유기농업, 생태농업, 정밀농업 등에 알맞는 품종이 개발되어 야 한다. Ⅰ. 육종의 목표설정 및 방법 1. 육종의 목표 어떠한 품종을 작출( 作 出 ) 하고 싶은 것인가, 목표가 설정되지 않으면 교배친 ( 交 ) 의 선택도 불가능하다. 영리적인 생산에 있어서는 다양한 목표가 설정될 수 있지만, 모든 특성을 만족하는 품종의 작출은 일시적으로는 불가능하며, 단기목표는 줄인 쪽이 달성하기 쉽다. 버섯의 있어 고품질, 맛, 색 등은 품종개량의 중요한 목표이지만, 개인적인 기호도, 유행 등에 따라서 다르 며, 시대, 지역 등에서도 달라진다. 한편, 온도 적응성, 다수성, 병저항성, 저장성 같은 제특성 ( 特 性 ) 은 어떠한 시대에도, 또한 어디에 있어서도 변하지 않는 중요한 육종목표이다. 2. 육종재료의 선정 육종목표에 따라 육종 재료의 수집하고 수집되어진 재료의 특성검정을 통한 육종모본으로 선 정 및 이용되어진다. 1 온도적응성 2 내병성 3 고품질성 ( 자실체의 형태, 색깔, 저장성 등) 4 다수성 5 무포자성
3. 버섯의 육종방법 결정 1) 도입육종법 도입육종법은 외국이나 다른지방에서 재배되고 있거나 자생하는 종을 도입하여 재배품종으로 이용하는 것이다. 2) 교잡육종법 1 단포자 교잡(mono-mono) : 핵균주간 교잡하는 방법 버섯의 자실체로부터 포자를 분리하고 단핵균주를 선발하여 단 2 단핵균주와 이핵균주간 교잡 (Di-mono) : 성하는 방법 단핵균주와 이핵균주간 교잡하여 새로운 품종을 육 3 다포자 교잡 : 다른품종의 포자를 서로 혼합하여 무작위로 교잡하는 방법 4 종속간 융합 원형질체 융합 를 나출시켜 : 세포벽분해효소를 이용하여 포자, 균사, 자실체의 세포벽 분해하고 원형질체 PEG(poly-ethylene glycol), 전기충격, 레이저융합등이 이용하는 방법 3) 형질전환 방법 유전물질 디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid/dna) 이 단백질 등과 결합하지 않은 노출된 형태로 미생물 세포 사이에서 전달되는 과정 4) 돌연변이 육종 유전물질인 디옥시리보핵산 (deoxyribonucleic acid/dna) 의 구조를 변화시킴으로써 세포의 유 전적 구성을 변화시킬 수 있는 물질. 1 2 방사선 : 전자기파, 소립자, X- 선, 감마선, 알파선, 베타선, 자외선 등. 화학적 돌연변이원 ( 화학물질 ) Nitrous acid, Hydroxylamine(NH2OH), Ethyl Methane Sulfponate(EMS), n-nitiroso n-methyl Urethane(NMU) 등
Ⅱ. 우수 단핵균주 선발 1. 기자재 및 초자류 ① 기자재 : 클린벤치, 멸균기, 항온기, 냉장고, 저울, 현미경, ph메타, 피펫(or 스포이드) ② 시약 : MCM 배지 ③ 초자류 : 페트리디쉬, 스프레더, 백금니(or 이쑤시게), 콜크보러, 페트리디쉬, 메스실린더, 비이커, ④ 기타 : 멸균수, 랩, 상자, 메스, 핀셋, 호일 2. 단핵균주 선발 ① 페트리디쉬( 60, 15mm)에 MCM 배지를 만들고 배지가 굳은 후 콜크보러로 구멍을 내어 일 부배지를 제거한다. ② 균사가 생장하여 배지를 제거한 부분에 균사가 생장하였을때 현미경하에서 클램 프 유무를 검경한다. ③ 단핵균주의 선단부위는 균사가 매끈하게 자라며 성숙한 균사에서는 측지가 발생되 어진다. ④ 이핵균사체는 선단부위가 자라면서 클램프 를 형성하게 되며 성숙한 균사에서는 클램 프가 일정한 간격으로 형성되어진 것을 관찰할 수 있다. 그림 2. 단핵균사체 그림 1. 클램프 검경을 위한 균주배양 그림 3. 이핵균사체
4. 단핵균주 배양 ① 선발된 단핵균사는 새로 만든 MCM배지에 이식하고 이핵균사체는 폐기한다. ② 25 항온기에서 배양한다. 5. 단핵균주 특성조사 ① 단핵균사체를 PDA 배지에 1균주당 3개체씩 반복하여 옮긴다. ② 25 항온기에서 배양하여 균사의 특성을 조사한다. ③ 균사선발은 균사생장속도와 밀도, 균사의 형태(윤문형성 유무)등을 육안검정 및 측정하여 여러종류의 단핵균사체를 선발하여 교잡에 이용한다(그림4). 그림 4. 여러 가지 형태의 단핵균주 그림 5. 단핵균주의 대치배양 Ⅲ. 성양식 조사 1. 대치배양 ① PDA 또는 MCM배지에 선발된 단핵균주를 그림 4와 같이 1~2cm 간격으로 대치배양 한다 (그림5). ② 균사형태 및 생장특성이 다른 16개의 단핵균주를 선발하여 대치배양 한다(표 6).
표 1. 느타리버섯의 4극성 교배형 조사 방법 교배형 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 단핵균주간 교배 3 사극성교배계( 四 極 性 交 係 Bifactorial system, Tetrapolar pattern) 4개의 핵이 4 개의 담자포자를 형성하며, 2 개의 서로 다른 유전인자 (unlinked genetic factor) A와 B 가 유성생식에 관여한다. A 인자는 핵짝짓기 (nuclear pairing) 와 클램프연결체 (clamp connection) 를 지배하고, B 인자는 핵이동 ( 核 移 動 nuclear migration) 과 클램프융합 (clamp fusion) 을 지배한다. = : 는 동형핵상 ( 同 形 核 狀 homokaryotic) 이며, : 는 이형 핵상( 異 形 核 狀 heterokaryotic) 을 나타내는데, 이형핵상만이 임성( 姙 性 ) 이다. 느타리버섯 (Pleurotus osteratus), 표고버섯 (Lentinus edodes), 팽이버섯 (Flammulina velutipes) 등 대부분의 버섯이 여기에 속하며 교배( 交 ) 의 예는 다음과 같다. a A = B = 의 경우 서로 동형핵상으로서 불임성이다. ( ) b A B 의 경우 서로 이형인자와 이형핵상으로서 임성( 姙 性 fertile) 이다. ( ) c A B = 의 경우 (hemicompatible) A인자는 발현하는데 B 인자는 발현되지 않아 불임성이며, 이 경우 양균사의 접합부위
에 거짓 클램프 (false clamp) 를 국부적으로 형성하게 되는데 (+) 로 표시한다. 동형핵 상으로서 불임성이다. ( ) d A = B 의 경우 A인자는 발현되지 않고 B 인자만 발현하는 것으로 불임성이며, 핵짝짓기와 클램프형 성이 되지 않고 (F) 로 표시한다 ("Flat" 의 약어). 클램프융합이 일어나지 않는다는 설이 있 으나 대개 클램프를 형성하지 못한다 (non-clamp). 동형핵상으로서 불임성이다. ( ) 표 2. 느타리종의 16개 단포자 분리주의 네 가지 교배형 교배형 A1B1 A1B2 A2B1 A2B2 1 6 7 11 14 2 3 8 5 10 4 9 12 13 15 16 1 - - - - - - - - - - + + + + + + 6 - - - - - - - - - - + + + + + + 7 - - - - - - - - - - + + + + + + 11 - - - - - - - - - - + + + + + + 14 - - - - - - - - - - + + + + + + 2 - - - - - - - - + + - - - - - - 3 - - - - - - - - + + (+) (+) (+) (+) (+) (+) 8 - - - - - - - - + + - - - - - - 5 - - - - - + + + - - - - - - - - 10 - - - - - + + + - - - - - - - - 4 + + + + + - (+) - - - - - - - - - 8 + + + + + - (+) - - - - - - - - - 12 + + + + + - (+) - - - - - - - - - 13 + + + + + - (+) - - - - - - - - - 15 + + + + + - (+) - - - - - - - - - 16 + + + + + - (+) - - - - - - - - - 표 3. 버섯의 생활주기 및 성 양식에 관한 특성(Raper, 1978) 종 담자기의 포자수 포자의 핵수 꺽 쇠 연결체 불화합성 인자 성양식 풀버섯 4 1 없음 없음 1차 자웅동주성 양송이 2-4 2 없음 A 2차 자웅동주성 여름양송이 4 1 없음 A 2극성 자웅이주성 맛버섯 4 1 있음 A 2극성 자웅이주성 목이 4 1 있음 A 2극성 자웅이주성 표고 4 1 있음 A, B 4극성 자웅이주성 팽나무버섯 4 1 있음 A, B 4극성 자웅이주성 느타리 4 1 있음 A, B 4극성 자웅이주성 치마버섯 4 1 있음 A, B 4극성 자웅이주성
Ⅳ. 우성인자의 단핵균주 선발 선발된 단핵 균사 (n) 는 모균주와 다른 형질을 소요하게 되는데 그 이유는 n+n 의 이질핵 균사가 자 실체가 형성된 후 핵융합에 의해 일시적으로 2배체 상태가 되고 곧이어 감수분열이 일어나 유전적으 로 양친 핵과 동일한 두 가지 형태와 양친 핵내의 유전자가 재조합된 새로운 형태의 핵으로 나누어 지기 때문이다. 선발된 단핵균주의 우성인자 발현율을 조사하기 위해 모균주당 50개 이상의 단핵균주를 선발하고 열성인자를 가진 다른 계통의 단핵균주와 대치배양을 실시하여 우성형질을 가진 우수단핵균주를 선 발한다. 1. 대치배양 1 PDA 또는 MCM 배지( 60, 15mm) 에 선발된 단핵균주와 열성인자를 가진 단핵균주를 1~ 2cm 간격으로 대치배양한다. 2 25 항온기에서 균사간 교잡이 이루어지거나 대선이 형성될 때 까지 배양한다. 2. 교잡 유무 검경 1 대치배양하여 대선이 형선된 부위나 겹쳐진 부위를 채취하여 새로운 배지에 옮긴다. 2 25 항온기에서 균사를 현미경 검경에 적합할 때 까지 배양하고 현미경 검경을 실시한다. 3 현미경 검경 후 클램프가 형성된 균주를 선발한다. 3. 종균제작 및 재배접종 1 톱밥종균 ( 톱밥 : 미강 (80:20)) 을 제조하여 클램프가 형성된 균주를 접종한다. 2 종균배양이 완료된 후 재배접종을 실시한다. 3 배양이 완료되면 생육실로 옮겨 발이 및 생육을 실시한다. 4 육종목표에 맞추어 환경조건을 설정하여 재배를 실시한다.
그림 6. 교잡계통의 종균배양 그림 7. 교잡계통의 따른 배양일수의 차이 4. 단핵균주의 특성조사 육종을 목표에 맞추어 특성조사를 실시한다. 교잡에 이용되어진 단핵균주의 특성을 파악하고 목표형질을 나타내는 단핵균주를 선발하여 육종모본으로 이용한다. 그림 8. 단핵균주간 교잡시 발현특성
Ⅴ. 단포자 교잡을 통한 신품종 육성방법 1. 단포자 교잡 1 육종목표와 일치하는 우성인자를 가진 단핵균주를 선발한다. 2 선발된 단핵균주를 상호계통간 단포자 교잡을 실시한다. 3 클램프 형성 유무를 검경한다. 4 클램프가 형성된 균주만 종균제조 및 재배접종을 실시한다. 5 육종목표에 맞추어 환경조건을 설정하고 재배를 실시한다. 6 버섯의 특성조사 기준에 맞추어 특성조사를 실시하며, 육종을 목표에 맞추어 부가적인 특성 을 조사한다. 2. 우수계통특성검정 및 조직분리 1 특성조사시 우수계통을 선발하고 우수계통의 조직을 분리한다. 2 조직분리한 우수계통의 영양체는 유전적으로 안정적이며 균일하다. 3 조직분리한 균사체는 원균으로 저장하고 일부는 종균으로 제작한다. 4 2, 3차의 특성검정을 실시하여 세밀하게 특성파악을 파악하고 우수균주는 선발하고 나머지 는 도태시킨다. 3. 생산력 검정 및 확대재배실시 여 최종선발된 계통의 균주는 원균은 저온저장하고 안정성, 균일성 및 수량 등을 조사하기 위하 3 회의 대량재배 및 농가실증시험을 실시한다.