[ 생명과학 ] STEAM R&E 결과보고서 외래식물가시박의항산화활성을통한 식물의재이용에관한연구 연구기간 : 2013. 5 ~ 2013. 12 연구책임자 : 박주현 ( 전북과학고생물과 ) 공동지도교사 : 노동찬 ( 전북과학고과학과 ) 참여학생 : 서보인 ( 전북과학고 1학년 ) 이석진 ( 전북과학고 1학년 ) 정상호 ( 전북과학고 1학년 ) 외부자문 : 홍정원 ( 서남대법의학전공 )
1. 개요 연구목적 정부와시민단체간의다양한환경적인해결책을통해우리는딱딱한포장도로에서좀더환경과가까워진삶을살게되었다. 이런환경과많이가까워진삶으로인해다양한종들의토종동물, 식물들을관찰할수있게되었다. 그러던중, 과거에비해우리토종동 식물들이해외에서들어온유해동 식물에의해고통받으며생명을이어가는것을확인할수있었다. 우리는환경부에서지정한많은생태계교란종중우리는가시박 (Sciyos angulatus L.) 에주목했다. 가시박은전국적으로분포하고있을뿐만아니라특히전라북도에서도많은지역에서가시박에의한피해사례가많다. 실제로가시박을채집하는도중관찰한가시박에의한피해는상당하다고생각되는바이다. 현재가시박제거방법은예취를하거나어린식물을뽑는것인데, 많은노동력이필요하고완전한제거가불가능하며제거과정도중에씨앗이땅에떨어져발아될확률만높아질수있다. 또한, 재생력이강하여단기간에제거하기는매우곤란하기때문에보다효율적이고지속적인관리방안이마련되어야할것이다. 최근경제수준이향상되고의학의발전이신기원을이루면서건강한장수를추구하는이들이많아졌고, 질병과노화, 수면연장에대한연구가활발하게진행되고있는데이연구들에서대표적으로다루고있는부분이항산화작용이다. 이역시합성항산화제의경우독성, 발암성의문제를이유로천연물을이용한안전한항산화물질에대한연구가진행되고있다. 본교학생들은연구를수행하는과정에서생물, 화학, 물리, 수학교과의통합적사고를이용하여탐구수행능력을증진할뿐만아니라, 제거된가시박을이용하여항산화활성체크및추출물에함유된탄수화물, 아미노산함량을측정함으로써제거된후쓸모없이버려지는가시박의재이용가치를규명하는것이본연구의목적이다. - 1 -
연구범위 가시박의생활사와문제점등을여러보도자료와논문등을통해확인하며, 가시박이존재하는지역을시청및환경연합단체를통해확인한후채집을하였다. 이후채집된가시박을건조하여물과에탄올을이용하여추출물을획득하며, 획득한추출물은 evaporator를이용하여각각농축시켰다. 농축된원액을조선대학교해양생물연구교육센터에의뢰하여동결건조를시켜분말을획득하였다. 분말과농축원액을이용하여우리 ( 학생 ) 들은 polyphenol assay 실험을통한 polyphenol 정량실험과 DPPH 라디칼소거능실험을수행하여항산화도실험을측정하였다. 또한 DNA에산화적스트레스를준상태에서우리의가시박추출물이 DNA oxidation 을얼마나막아줄것인지증명하는실험을계획하고수행하였다. 항산화활성을다양한실험을통해확인하였으며, 가시박의이용가치성을다시한번확인할수있는계기가되었다. 뿐만아니라가시박추출물에함유된다양한고분자화합물을측정하는실험을계획하여수행하였다. 가시박추출물에함유된탄수화물을정량하는실험인 DNS 환원당실험을수행하였고, 또한대전의한국기초과학연구소에의뢰하여가시박추출물의아미노산의조성및함량등을확인하였다. 가시박추출물을이용하여우리가직접실험을계획하고, 결과해석을통해가시박의이용가치를재규명하여유해한식물을재이용할수있기를기대한다. 2. 연구수행내용 이론적배경및선행연구 생태계교란식물가시박 (Sciyos angulatus L.) 가시박의생물학적분류 : 현화식물문 > 쌍떡잎식물강 > 박목 > 박과. - 2 -
북아메리카원산의일년생귀화식물로 1980년대오이등채소의접붙이용으로수입되었다. 우리나라의중부및남부지방의물가에서자라고, 뛰어난생명력과번식력을자랑한다. 가시박이라는이름은아래의오른쪽그림의모습을가진열매로부터유래되었다. 가시박이생태계교란식물이된이유는주변의다른식물을뒤덮으며자라는특성이있어다른식물을말라죽게한다. 조사결과현재국내에서는가시박의제초활성및방제효과에관한연구만진행된상태이며, 이용가치에대해밝힌연구가잘진행되지않았다. 활성산소와항산화제활성산소란산소자유라디칼 (oxygen free radical) 및이것으로부터파생된여러가지산소화합물들을통칭하는것으로, 이들은모두반응성이높은특징을가지고있다. 자유라디칼 (Free Radical) 은독립적으로존재하여불안정하기때문에반응성이높다. 이전자가안정화된다면상대세포는산화되어손상을일으키게되는데호기성생물들의체내에서활성산소의생성메커니즘은에너지를만드는대사과정, 체내효소계및환원대사등생명유지에필요한여러대사반응의내적요인과화학약품, 공해물질, 광화학반응등의각종물리적, 화학적, 환경적인외적요인등에의해생성된다. 미토콘드리아 (mitochondria) 전자전달계에서는 NADH나 succinate로부터받은전자가각전자전달복합체를따라단계별로전달되어결국산소를환원시켜물로된다. 그러나이러한전자전달계의중간단계에서전자가이탈되어바로산소로전달되면 O - 2 가생성되고, 이는과산화수소가된다. 이것이형성메커니즘인데, 활성산소는핵산, 단백질, 지질등에손상을끼친다. 이러한활성산소의유해성을막기위하여 - 3 -
우리의신체는항산화비타민, 비효소적항산화물질, 그리고항산화효소로구성되어있는효율적인항산화방어체계를가지고있다. 항산화체계각각의역할은독특할뿐만아니라, 기능적으로상호보완적으로작용한다. 일반적으로항산화비타민은직접적으로유리기를제거하는역할에관여하며, 항산화물질인 glutathione과다른 thiol 물질들은세포의산화환원상태를유지하는데중요한역할을하고, SOD(Superoxide dismutase), CAT(Catalase), 그리고 GPX(Glutathione peroxidase) 와같은항산화효소는활성산소의하나인전자환원반응을촉매한다. 그래서활성산소로부터의방어기전을구축하고있으며, 기전으로서는우선활성산소의생성을막게하고, 반응성이있는대사산물을처리함으로써활성산소의공격을차단한다. 또한이산화물이더욱파괴적인형태의활성산소인하이드록실라디칼로전환되는것을막으며, 활성산소에의해공격을받았을경우손상복구를빠르게하며다른항산화제들이효과적인기능을발휘하기위한환경을제공해준다. 페놀성화합물자연계에존재하는페놀성화합물은식물의잎, 꽃, 과일, 종실등에서빨강, 노랑, 파랑등다양한색깔을나타낸다. 페놀성화합물은식품에약간떫은맛을내며커피, 차, 코코아중에서는바람직한맛을낸다. 그구조는 1,000가지이상이알려져있으며, 단순하게 monocyclic phenolic acid, phenylpropanoid, phenolicquinone 과 lignin, melanin 및 tannins (hydrolyzable 및 condensedtannin) 등까지다양한구조를가지고있다. flavonoid 종류는식물에가장보편적으로함유된색소성분의하나로보통 glucose, rhamnose와결합하여배당체로존재한다. 감귤류에존재하는 flavonoid는인체모세혈관의벽을튼튼하게유지시켜줌으로 bio-flavonoid라고한다. 식품중에가장흔하게분포되어있는대표적인 flavonoid는 quercetin과 hesperidin이있으며다량의 vitamin C 와공존하면생체혈관의투과성을조절하여주는약리작용을한다. - 4 -
페놀계항산화제들은연쇄반응에서 alkylperoxy radical이나 alkyl radical에게수소를공여함으로써그 radical을제거하여산화를억제한다. 페놀성화합물은배추를포함한식물계에널리분포되어있는 2차대사산물의하나로써, 페놀성수산기를가지고있기때문에단백질및기타거대분자들과결합하는성질을가지며, 항산화효과등의생리활성기능을가진다. 본연구에서는 Folin-Ciocalteu method를활용하여페놀성화합물을정량할것인데, Folin-ciocalteu 반응은단백질의정량에사용하는티로신의발색반응이다. Folin-Ciocalteu Phenol Reagent( 페놀시약 : 텅스텐산나트륨, 몰리브덴산나트륨, 인산, 황산으로조제 ) 를사용하여페놀혹은티록신잔기가있는단백질을정량할때에사용한다. 황산산성하에서는몰리브덴산이나텅스텐산어느것도헤테로폴리산이되어인산을둘러싸며거대분자를형성 ( 인몰리브덴산, 이텅스텐산 ) 하며이들이페놀기에의해환원되면몰리브덴블루, 텅스텐블루가된다. 이반응에서산화, 환원에따른흡광도를 UV-VIS Spectrophotometer 에의해측정하면그를 Gallic acid로만든 Folin-Ciocalteu Phenol Reagent와비교하여폴리페놀성화합물의농도를측정할수있다. DPPH 를활용한항산화도측정 자색을띄며안정한라디칼로잘알려진 DPPH(DPPH 의화학식은 아래그림과같다.) 는 1922 년 Goldschmidt 와 Renn 에의해발견되었다. <DPPH 의화학적구조 > <DPPH 원리 > - 5 -
DPPH는라디칼상태에서는최초의강한자색을띄지만환원이되면노란색의 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H) 이된다. DPPH 라디칼을활용한항산화능측정법의원리는, 안정한라디칼인 DPPH가산화방지물질로부터전자혹은수소를제공받으면비라디칼로전환되면서보라색이노란색이되며, 517nm에서보라색을관측하고노란색을관측하지못하는성질을이용하여흡광도가변화함에따라항산화도를측정할수있다. 이방법을사용하여천연물의수용성혹은유기용매추출물의항산화활성을측정할수있다. DNS 환원당분석환원당측정법이다. 즉환원성이있는당 (ex. glucose를비롯한단당류 ) 의측정법으로, 환원력은알도스 C1 위치에헤미아세틸기또는케토즈 C2 위치의헤미케틸기의존재에의해나타난다. 환원당과 3.5-dinitrosalicylic acid가반응하면 3-amino-5-nitrosalicylic acid가되는것을이용하는것으로알칼리성조건에서만발색되며비특이적이기때문에모든 reducing compound와반응한다. 3,5-Dinitrosalicylic acid이 3-amino-5-nitrosalicylic acid으로환원되면 540nm근처파장의빛을강하게흡수함을이용한분석법이다. DNS 발색시약엔 3,5-Dinitrosalicylic acid과 sodium potassium tartrate, NaOH가들어가는데, sodium potassium tartrate는용액의이온농도를증가시켜산소가분해되는추세를감소시키고, NaOH는 DNS와환원당간산화환원반응의염기성매체로작용한다. 다른환원당측정법인 potassium ferric hexacyanid(prussian blue) 나 Somogyi-nelson (molybdenum blue) 보단정확도가떨어진다는단점이있다. - 6 -
Fenton reaction 반응펜톤산화반응은 2차철염의펜톤시약과과산화수소 (H 2 O 2 ) 혼합용액을사용하여반응중생성되는 OH radical의산화력으로유기물을산화처리하는방법이다. 펜톤시약은 1894년영국의화학자 H.J.H Fenton에의해처음으로발견되었고, 펜톤산화에대한반응메커니즘은 Haber and Weiss(1934) 에의하여제안되었으며, 그후 Barb et al.(1951) 은이를수정하여완성시켰다. 과산화수소 (H 2 O 2 ) 는취급하기가용이하고다양한유기물과반응성이높으며독성물질이나색도물질을유발하지않는비교적경제성이있는산화제이다. H 2 O 2 와 Fe 2+ 를이용하여 OH radical을간편하게만들수있다. 즉 H 2 O 2 와 FeSO 4 를함께혼합하였을때, H 2 O 2 가 OH radical을생성시키기때문에유기물을효과적으로분해제거할수있다. 반응식 : H 2 O 2 + Fe 2+ Fe 3+ + OH- + OH 연구주제의선정 연구주제를가시박의항산화활성확인으로정한후학생 ( 우리 ) 들은전북환경운동연합의도움을받아가시박에대한정보및여러피해사례를수집하였으며전주천, 만경강등학교를기준으로가까운곳들에직접방문하며가시박의피해를눈으로확인하고가시박을제거했다. 8월중 (2013.08.05.) 에는학생 ( 우리 ) 들이주도적으로세미나를진행해앞으로해나가야할실험기법들과항산화작용에대해직접제작한 ppt를공유하며실험수행에필요한지식을향상시켰다. 여러논문을참고해학생 ( 우리 ) 들이계획한실험에필요항실험방법들을직접작성하였고, 선생님의도움을받아수정을거친뒤실험을수행하였다. 실험에있어서필요한조작변인들은팀원간의협의를거친후정했다. 또한여러실험을분배해실험속도를향상시켰다. - 7 -
연구방법 가시박의피해장소탐방및제거작업 - 가시박의피해와실태조사를위한전북권내시청, 군청및다양한관공서를이용하여가시박의분포를파악한다. 전북권내의가시박제거작업을위해학생들의봉사와이를통해획득한가시박식물체를이용한다. 가시박의추출및분획 -가시박제거활동을통해식물체를얻고이를건조한후파쇄하여 70% ethanol 30L, D.W 30L에각각침적하여, 실온에서 7일동안침출시킨다. 침출시킨시료를여과기를이용하여여액만취하고, 이와같은방법으로분리한잔사에대하여동일한조건으로 2회반복실시한다. 여과하여얻어진여액은 60 수욕상에서 Roatating Evaporator로농축하여 70% ethanol 추출물을얻는다. 가시박 D.W추출물및에탄올추출물의동결건조 -가시박추출물의탄수화물, 단백질, 페놀, 아미노산함량을분석하기위해추출물원액을조선대학교해양생물연구교육센터에의뢰하여동결건조를하였다. polyphenol 함량측정 -Total phenols 분석은 Spanos와 Wrolstad 방법 (Spanos & Wrolstad., 1990) 을변형하여사용하였다. 항산화활성, 면역활성, 항암활성, 항비만활성등다양한활성이보고되고있는폴리페놀성화합물의분석은 Folin-Ciocalteu 발색법에따라실시하였다. 즉, 시료 20 μl을 96 well plate 에넣고 1 N Folin-Ciocalteu 시약 100 μl를가한후, 3 분동안실온에방치하였다. 7.5% Na 2 CO 3 용액 80 μl을가한후 90 분간암실조건에서반응시킨후원심분리 (1600 g, 8 분 ) 한상층액의흡광도 ( 측정파장 = 765 nm) 를측정하여표준시약인 Galic acid에대한표준농도곡선과상응하는농도를비교결정하였다. DPPH assay Nanjo et al., 1996의방법을변형하여사용하였다. 시료를 1mg/mL의 - 8 -
농도로 70% ethanol을용매로하여녹인다. DPPH 시약은 0.3mM을이용하며, control은 ascrobic acid(vitamin C) 를이용하여대조군으로사용한다. blank는 DPPH와메탄올을이용한다. 추출물과대조군등을 517nm의 UV를이용하여흡광도를측정후비교한다. 가시박에탄올추출물아미노산성분분석가시박추출물의아미노산함량분석을위해대전한국기초과학연구소에의뢰하여각추출물의아미노산조성및함량분석을실시하였다. DNS(3,5-dinitrosalicylicacid) Method 환원당을측정하는실험으로시험관에 D-glucose 표준용액, 물, DNS 시약을차례대로넣고잘섞은후끓는물에 15분동안반응시킨후 15분동안냉각한다. 발색된반응액에증류수를넣어희석한다음 546nm에서흡광도를측정하여표준곡선을만들고, 시료의환원당량은표준용액곡선에서계산하여비교한다. DNA 추출과 DNA Oxidation assay AGS cell( 위암세포 ) 주를이용하여 DNA를추출하고준비된가시박의추출물, 증류수, 300uM FeSO 4, 0.1mM H 2 O 2 를제조한다. Fenton reaction을이용하여 DNA protect를관찰한다. 30분간실온에서방치하고 130mM EDTA를첨가한다. Blank는 5ul DNA와 35ul D.W를이용하고 control은 5ul DNA와 7ul의 sample, 14ul FeSO 4, 14ul H 2 O 2 를이용하여전기영동결과를비교한다. MTT assay AGS cell을 96well에 100ul의 DMEM 배지와함께분주한다. sample을처리후, MTT 10ul을넣고관찰하면서 formazan의형성을확인하고, formazan이형성되기시작하면 1500rpm 20분간원심분리하여 supernatant 제거후, DMSO 100ul 넣는다. formazan 을다녹인후, 540nm 에서흡광도측정한다. - 9 -
연구활동및과정 가설설정 1 가시박추출물에서항산화효과를확인할수있을것이다. 또한농축시킨원액과 1mg/ml의농도로만든샘플을비교하였을때원액이더많은효과를보일것이다. 2 열수추출을통해얻어진추출물과 70% EtOH 추출을통해얻어진추출물의항산화성을비교하였을때열수추출을통해얻어진추출물이더많은효과를보일것으로예상한다. 3 아미노산, 탄수화물함량과항산화활성은농도의존적으로증가할것이다. 4 가시박의다양한물질들을이용하여버려야만하는가시박을재이용할수있을것이다. 실험설계실험과정실험방법설명 1 가시박제거작업및추출과정전라북도고산초등학교앞고산천주변에가시박의피해가많다는것을전북환경운동연합을통하여알아낸뒤고산천인근을돌며가시박채집을하였다. 채집한가시박을실험실로가져와흙과이물질을제거하고, 건조를통하여수분을제거하였다. 건조된가시박을추출효율을높이기위해믹서기로분쇄하였다. 2 추출물여과및농축 파쇄한가시박은증류수와 70% EtOH 을용매로이용하여 1 차추출과 - 10 -
2차추출을하였다. membrane, pore 0.2um Bottle 필터를이용하여추출물을필터링한후 Evaporator기기를이용하여농축시켰다. Evaporator는시료로부터용매를증발시켜제거해농축된추출물을얻을수있게하였다. 이추출물은조선대학교해양생물연구교육센터의연구원으로부터도움을받아동결건조시켜분말형태로만든후실험에사용하였다. 3 polyphenol assay 표준 Gallic acid를농도 (0,10,20,30,50,80,100,150,200,300,500µg/mL) 로희석하고, 시료 ( 열수추출한원액 1mg/mL sample, 에탄올추출한원액과 1mg/mL sample) 는각각 250, 500, 1000 µg/ml 농도로희석한 20µL 에 100µL 1N Folin Ciocalteau 시약을가한다. 이반응은 7.5% Na 2 CO 3 를가하여중화시키고, 시료를 20초동안 vortex하여준다. 혼합물은상온 (30 ) 에서 1시간 30분동안반응시킨다. 배양시킨혼합물은마이크로플레이트리더기와 96well을사용하여 765nm로흡광도를측정한다. 반응혼합물의높은흡광도는더높은총페놀량을나타낸다. 4 라디칼소거활성에의한항산화효과 (DPPH assay) DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 를 0.3mM 농도에맞게 ethanol 에 녹여제조하고추출물은 250, 500, 1000µg/mL 농도로희석하였다. - 11 -
( 네가지종류의추출물중한가지추출물만을가지고실험을한다고가정했을때 ) 96well에각농도별로 100ul씩채운다. control은 ascrobic acid(vitamin C) 를이용하여대조군으로사용한다. ascrobic acid또한농도는 250, 500, 1000µg/mL로, 추출물과같게하였다. blank는 DPPH와메탄올을이용한다. 모든시약과시료를다넣은후에는호일로감싸 1시간 30분동안반응이이루어지길기다리고, 517nm의 UV를이용하여흡광도를측정하였다. 반응혼합물의낮은흡광도는높은라디칼소거능에의한항산화효과를나타낸다. control은 ascrobic acid(vitamin C) 를이용하여대조군으로사용한다. blank 는 DPPH와메탄올을이용한다. 추출물과대조군등을 517nm 의 UV를이용하여흡광도를측정한다. 5 DNS환원당분석 2M NAOH 50ml와 3,5-Dinitrocylic acid 0.25g+ Sodium potassium tartrate 75g을혼합하여 stirrer를이용해완전히녹인후 DW를첨가하여 250ml 발색시약을완성한다.( 발색시약은호일로감싸서보관 ) 5mg/ml D-glucose 를희석하여 0, 50, 100, 150, 250, 400, 500, 1000, 1500, 2500, 5000ug/ml 1ml를제조하고추출물은 polyphenol assay 때사용했던농도그대로준비한후각각을 vortex를이용하여발색시약 1ml와함께잘섞어준다 water bath 90 에서 10분간반응시킨후마이크로플레이트에서 96well 로 575nm에서흡광도를측정한다. D-glucose standard curve를작성한후 standard curve 직선방정식을이용하여우리시료의당농도와함량을계산한다. polyphenol assay, DPPH assay, DNS 환원당분석법모두 3 번의반복실험 을통한평균값으로결과값을얻었다. 6 DNA 추출, DNA oxidation, MTT assay 서남대학교홍정원교수님의도움을받아 AGS cell 에서추출하여 DNA 를 - 12 -
준비하고가시박추출 (DW,EtOH원액과 1mg/ml 샘플 ), 증류수, 200uM FeSO 4, 0.1mM H 2 O 2 를제조한다. Fenton reaction을이용하여 DNA protect를관찰한다. 30분간실온에서방치하고 130mM EDTA를첨가한다. Blank는 5ul DNA와 35ul D.W를이용하고 control 은 5ul DNA와 7ul의 sample, 14ul FeSO4, 14ul H 2 O 2 를이용하여실험을수행했다. Agarose gel은 Agarose1.2g+ 1X TAE buffer 100ml를섞은뒤전자레인지에돌린다음식혀콤을꽂고굳힌후사용하였다. 시행착오극복 - 전주천일대에첫채집을갔을때이미환경단체에서가시박을제거한후였기때문에많은양을채집할수없었다. 채집된양은사후관리소홀문제로사용할수없게되었다. 이후수소문끝에고산천일대를탐색하기까지오랜시간이걸렸다. 사전조사가미흡하였던문제가있었다. 방학중실험실화재문제로연구진행을많이할수가없었다. 8월말부터가시박추출물과분획을획득하였고, 빠르게실험진행이이루어졌다. - D.W로열수추출하여얻은가시박추출물이 membrane, pore 0.2um Bottle 필터를잘통과하지못해여과기를변형시켜여과지를이용하여여과한후다시 membrane, pore 0.2um Bottle 필터과정을끝마쳤다. - 처음실험을진행했을때는모두피펫을잘사용해본적이없어피펫사용에미숙하였으나반복실험을통해피펫사용법을완전히숙지하였다. - DNS 환원당분석실험 D- glucose standard curve 를작성하는과정에서 1mg/mL 의농도는결과값이미미해농도를 5mg/mL 로증가하여실험하였더니지금과같은결과를얻을수있었다. - 13 -
월별연구추진실적 - 기간 : 2013.07.13. ~ 2013.11.16. 날짜 활동내역 2013.07.13. 가시박피해장소탐방및 1 차제거 작업 ( 전주천 ) 2013.08.06. 가시박피해장소탐방및 2 차제거작업 ( 고산초등학교앞산자연휴양림만경강 ) 가시박세척및건조과정 2013:08.28 열수추출, 70% EtOH 추출시작 2013.09.04. 1 차추출물획득 2013.09.17. 여과과정 2013.09.23. 회전농축기를사용하여농축과정 2013.09.26. 여과과정마무리 2013.09.27. 가시박추출물동결건조의뢰 2013.10.18.~10.23 polyphenol 과 DPPH 2013.10.28.~2013.11.05. DNS 환원당분석실험 2013.11.16. DNA oxidation 실험마무리 - 14 -
3. 연구결과및시사점 연구결과 polyphenol assay 실험결과 < 그림 1> Galic acid 표준용액의 standard curve < 표 1> 가시박추출물내 polyphenol 함량분석 농도 sample 1mg/mL 0.5mg/mL 0.25mg/mL 분말 D.W 가시박 23.61 ug/ml 16.35 ug/ml 12.96 ug/ml 분말 EtOH 가시박 13.96 ug/ml 11.43 ug/ml 10.33 ug/ml 농도 sample 농축원액 D.W 가시박농축원액 EtOH 가시박 원액원액 1/2 희석원액 1/4 희석 179.83 ug/ml 102.20 ug/ml 60.31 ug/ml 161.86 ug/ml 90.66 ug/ml 52.50 ug/ml 페놀성화합물은식물계에널리분포하며다양한분자량과구조를가지고있다. 페놀성 OH기는강력한항산화활성이활성산소의소거능으로알려져있다. 우리는가시박농축원액과농축원액을동결건조한분말을농도 1mg/mL를제조하였다. 각각샘플을희석하여농도 - 15 -
별로가시박에함유되어있는총폴리페놀화합물의함량을측정하였다. Galic acid를표준용액한 standard curve를이용하여가시박 sample의폴리페놀함량을측정하였다. D.W로녹여서만든가시박추출물이 EtOH을처리한 sample보다폴리페놀합량이농도별로분석하였을때, 더높게나타남을알수있었다. 동결건조하지않고농축원액을사용한것은동결건조과정에실험적으로차질이생길우려를대비하여실험을추가하였다. 용매를 D.W를이용하여추출한가시박농축원액이 EtOH를사용하여추출한원액보다폴리페놀함량이더높음을알수있었다. 원액의경우는정확히추출물이함유한농도를알수는없지만분말을이용하여실험한결과를살펴보면추출물 1mg에포함된폴리페놀양이 D.W의경우 23.61ug, EtOH의경우 13.96ug이함유된것을알수있다. 농축원액에서는 D.W의경우 179.83ug, EtOH의경우 161.86ug이포함되어있다. DPPH 라디칼소거능결과 sample scavenging activity (%) ascrobic acid 93 원액 D.W 53 원액 EtOH 23 1mg/mL D.W 35 1mg/mL EtOH 15 < 그림 2> 가시박추출물의라디칼소거능 DPPH는항산화물질에의해환원되어보라색으로탈색되는항산화활성도를측정하는방법이다. ascorbic acid은항산화활성이매우높은물질로알려져있으며위의그래프와같이 ascorbic acid을기준으로라디칼소거능을비교측정하였다. 517nm에서흡광도를측정, 라디칼소거능을알아본결과 ascorbic acid는 1mg/ml에서 93% 을나타내며농도를알지못하는 D.W로추출한가시박농축원액의경우 53% 정도의라디칼소거능을보여준다. 또한원액 EtOH로추출한가시박농축 - 16 -
원액의경우 23% 라디칼소거능을보였다. 분말을사용하여제조한 sample은용매 D.W 추출물의경우 35%, 용매 EtOH 추출물의경우 15% 의라디칼소거능이측정되었다. 실험을통해농축원액 D.W > D.W 1mg/mL > EtOH 농축원액 > EtOH 1mg/mL 차례로소거능정도가높다는것을확인하였다. 이를통해 D.W를사용하여추출한농축원액의경구가 asc의경우가플경우보단효과가더높다는것을알수있고또한 EtOH 보다는 D.W로추출한 sample이 ascorbic acid과비교하였을때 50% 정도라디칼소거능을가졌음을알수있는실험데이터결과이다. 아미노산성분분석 < 표 2> 가시박 EtOH 추출물 1mg/mL 내아미노산성분분석 가시박 EtOH 추출물 1mg/mL sample Amino acids mg/100mg Sample(%) Asp 0.35 18.30 Glu 0.53 27.58 Ser 0.05 2.50 Gly 0.14 7.18 His 0.07 3.61 Arg 0.05 2.57 Thr 0.04 2.05 Ala 0.24 12.19 Pro 0.11 5.74 Tyr 0.01 0.76 Val 0.08 4.07 Met 0.01 0.50 Cys 0.00 0.00 Ile 0.05 2.63 Leu 0.07 3.88 Phe 0.06 2.85 Trp 0.04 2.14 Lys 0.02 1.20 Tatal 1.92 100 아미노산성분분석은학교에서실험을할수없기때문에대전한 국기초과학연구소에의뢰하였다. 실험결과는 < 표 > 와같다. 아미노산 - 17 -
성분분석결과 Glu 25.58%, Asp 18.30%, Ala 12.19%, Gly 7.18%, Pro 5.74%, Val 4.07%.. 등으로나타났다. 아미노산성분분석한이유는추출물내아미노산함량을측정함과동시에아미노산중에서도항산화성분을지니고있는아미노산의함량을알기위함이다. 대표적인아미노산인 tryptophan, tyrosine, leucine, proline, histidine, alanine, 항산화제인글루타티온은글루탐산, 시스테인, 글리신의아미노산중합체로서환원성이높은셀프하이드릴기를가져환원을시키고자신은산화되는성격을가졌다. 인돌구조를가진트립토판또한환원적인성격을가졌다. 이런아미노산중가시박에서검출된항산화활성을가진아미노산은전체아미노산함량에대하여약 61% 정도를차지하였다. 아미노산성분분석을통하여가시박 EtOH 추출물에함유된항산화활성을가진아미노산이구성이상당히높음을알수있었다. DNS 실험 < 그림 3> D-gulcose standard 와가시박추출물의탄수화물함량 < 표 3> 가시박추출물의탄수화물함량 구분흡광도탄수화물양 (mg/ml) 가시박 D.W 추출물원액 0.2375 2.38 가시박 70% EtOH 추출물원액 0.217 2.18 가시박 D.W 추출물 1mg/mL 0.0085 0.0767 가시박 70% EtOH 추출물 1mg/mL 0.0045 0.036-18 -
DNS 실험은분자내알데히드기를가지고있는환원당에의해 DNS 의색변화로환원된정도를흡광도를통해알아보는것이다. D.W로추출한원액의경우탄수화물양이 2.38mg/ml, EtOH 추출물원액은탄수화물양이 2.18mg/mL가측정되었다. D.W로추출한시료를이용하여 1mg/mL 농도로제조하여탄수화물을측정한결과탄수화물양이 0.0767mg/mL, EtOH를사용하여추출한시료로 1mg/mL제조하여탄수화물함량을측정한결과는 0.036mg/mL였다. 식물이탄수화물이많을것이라생각하였으나실제로측정해본결과탄수화물양이생각보다적어반복실험수행을하였으나결과는같았다. DNA oxidantion < 그림 4> D.W 가시박추출물을통한 DNA 보호작용 펜톤반응에서 Fe(II)-H 2 O 2 로인한강력한산화작용을일으켜 -OH radical을생성하게된다. 결과적으로 DNA는 OH radical에의해분해된다. Fe(II)-H 2 O 2 를첨가하지않고 DNA와 D.W만넣은 Blank는 DNA 분해율이적어 DNA가보존됨을알수있다. Fe(II)-H 2 O 2 를첨가한 control은 DNA가산화작용으로분해되어 Blank와비교하였을때양이매우적음을볼수있다. 폴리페놀 assay, DPPH assay 결과를바탕으로 EtOH로추출한가시박보다 D.W로추출한가시박추출물이항산화작용이높다는것을판단하여 D.W추출물을이용하여실험을하였다. Fe(II)-H 2 O 2 를첨가하고가시박샘플을농도별로투여하여 DNA 상태를확인한결과 DNA의산화작용을보호하는효과는가시박 D.W - 19 -
추출물이농도-의존적으로 DNA 산화작용을억제하는것을관찰할수있었다. 즉가시박추출물의농도가높을수록 DNA가많이분해되지않음을보여준다. 이는가시박추출물이세포의산화적스트레스로부터 DNA 산화를억제하는결과로볼수있다. 항산화작용에큰영향이있음을이결과를통해확인할수있었다. MTT assay 가시박 D.W 추출물 가시박 EtOH 추출물 < 그림 5> 가시박 D.W 추출물과 EtOH 추출물의 MTT assay DNA 추출과 AGS cell 확보및 MTT 실험은서남대학교홍정원교수님의도움을받아이루어졌다. MTT assay는살아있는세포를확인하기위해흔히사용되고있는방법으로 yellow tetrazolium salt MTT 는살아있는세포에서물에녹지않은 formazan crystal로환원된다. 이 formazan은나중에 DMSO로녹여서생성된크리스탈의양을마이크로플레이트리더기를이용하여 540nm파장에서흡광도를측정하여확인한다. 우리는 DNA추출에이용한 AGS cell을이용하여 MTT assay 를실험하였다. 실험결과위의그래프에서나타나듯이 D.W 추출물, EtOH 추출물모두농도에관계없이세포독성이없었다. 즉가시박추출물이세포에위험이없다는것을 MTT assay실험을통해검증하였다. - 20 -
시사점 첫째, DPPH, polyphenol, DNS 환원당분석법, 동물세포주로부터 DNA 추출, MTT assay 등여러가지연구활동을통하여전문적인실험실력향상및새로운전문적인지식을배울수있게되었다. 둘째, 단기간이아닌장기간연구를통하여심화적이고실질적인연구활동법을배웠으며연구활동을통해얻은지식뿐만아니라연구활동에대한테크닉또한배울수있었다. 셋째, R&E 활동을통하여주도적인연구활동과팀원간의협동과효율적인분배를배우게되었다. 넷째, 가시박을직접제거하며채집하는과정에서항산화효과외에도덩쿨식물이라는특징을활용하여가시박을건물의냉방효과에도이용이가능하겠다는생각을하게되었다. 다섯째, 쓸모없게만느껴졌던가시박에서항산화효과를확인함으로써새로운항산화제로널리쓰일수있는가능성을증명했다. 이로써버림과동시에재활용이가능하게되어가시박제거후처리과정에도효과적으로적용될수있게되었다. 앞으로가시박이생태계교란식물이아니라아카시아나편백나무와같이건강에도움이되는식물로인정받기를기대해본다. 여섯째, 생물을단하나의관점으로보지말고여러관점을통해탐구가능하다는것을알았다. - 21 -
4. 홍보및사후활용 후속연구추진 이번연구에서가시박의항산화효과가있다는사실은증명되었으나원액속어떤성분들이항산화효과를이루고있는지는밝혀지지않아이후 HPLC(High-performance liquid chromatography, 액체크로마토그래피 ), GC-Mass(Gas chromatography mass spectrometry, 가스크로마토그래프질량분석기 ) 를이용하여가시박원액의정성 정량분석을실시할것이다. 또한추가적으로 NMR Spectrometer(nuclear magnetic resonance spectrometer, 핵자기공명분석계 ) 와 IR( Infrared Spectroscopy, 적외선분광법 ) 도적용하여분자구조와작용기를알아내항산화효과를분자단위로볼수있는가에대한의문도풀것이다. 또한이는가시박원액속천연물의유무도확인할수있는기회가될것이라예상된다. 항산화제의활용방안에대해조사하던중, 피부장벽손상및아토피피부염의원인중하나로활성산소에의한산화적손상이제기되고있는것을확인하였고, 이에따라가시박의항산화효과가아토피피부염치료에도효과가있을지의문이생겨후속연구로추진할계획이다. 사후활용방안 가시박채집과정에서가시박의 " 덩쿨식물 " 이라는특성을살려연세대학교건물의담쟁이넝쿨과같이건물의냉온, 냉방효과를증진하는단열재역할로도활용이가능하다판단되었다. 가시박의항산화효과가이번연구를통해확인됨으로써기존항산화제의역할인산성화방지, 뇌졸중, 심근경색, 동맥경화와같은혈류장애로부터혈관을개선하는효과, 암, 당뇨병각종궤양을치료효과를가시박추출물이대체활용할수있을것이라예상된다. 이로써가시박을이용해기미, 주근깨방지용화장품, 여러의약품등다양한활용사례가나타날것이다. - 22 -
5. 참고문헌 - 활성산소소거활성에따른꾸지뽕잎추출물의신경세포보호효과 Neuroprotective Effect according to Reactive Oxygen Species Scavenging Activity from Extracts of Cudrania tricuspidata Leaves_ 강용경, 이은아, 박해룡 _ 한국식품조리과학회 (2012년 12월 ) - 상황버섯열수추출물의항산화활성과식후혈당상승억제효과최황용하경수조성훈가은혜장흥배권영인한남대학교식품영양학과, 한국폴리텍바이오대학바이오품질관리과 Antioxidant and Anti-hyperglycemic Effects of a Sanghwang Mushroom(Phellinus linteusau) Water Extract - 구골나무나뭇잎의항산화효과와유효성분의분석 = Antioxidant Activities and analysis of the effective compounds on the Osmanthus heterophyllus leaves_ 주성진 _ 원광대학교일반대학원화학과 - Spanos, G. A. & Wrolstad, R. E., Influence of processing and storage on the phenolic composition of Thompson Seedless grape juice., Journal of Agricultural and Food Chemistry 38, 1565-1571, 1990. - Nanjo, F., Goto, K., Seto, R., Suzuki, M., Sakai, M. & Hara, Y., Scavenging effects of tea catechins and their dericatives on. 1.1-diphenyl-2-picrydrazyl radical. Free Radic BiolMed 21, 895-902, 1996. - 항산화제, 내몸을살린다 _ 정윤상 _ 모아북스 _2011.06.13. - 23 -