1) 대한한방부인과학회지 J Korean Obstet Gynecol. VOL.27 NO.2 : 059-070 (2014) http://dx.doi.org/10.15204/jkobgy.2014.27.2.059 夏 枯 草 에서 추출한 Ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과 경희대학교 한방부인과 한방부인과학교실 허자경, 황덕상, 이진무, 이창훈, 장준복, 이경섭 ABSTRACT Inhibitory Effects of Ursolic Acid from Prunella Vulgaris on Osteoclast Differentiation Ja-Kyung Heo, Deok-Sang Hwang, Jin-Moo Lee Chang-Hoon Lee, Jun-Bock Jang, Kyung-Sub Lee Dept. of Korean Gynecology, College of Korean Medicine, Kyung-Hee University Purpose: This study was conducted to evaluate the inhibitory effect of ursolic acid from Prunella vulgaris on osteoclast differentiation. Methods: MTT-assay was performed to estimate cytotoxicity of ursolic acid from Prunella vulgaris in BMMs stimulated with M-CSF. TRAP staining, TRAP activity and Real-time PCR were performed to know the inhibitory effect on osteoclast differentiation. Actin ring formation were analysed to observe the effect of ursolic acid from Prunella vulgaris. Results: Ursolic acid from Prunella vulgaris has no cytotoxicity at the concentration of 1 μg/ml or lower. Ursolic acid decreased the number of TRAP positive cells and the expression of NFATc1 gene, c-fos gene, TRAP and OSCAR in BMMs stimulated with RANKL. Ursolic acid restrained the formation of actin ring. Ursolic acid inhibited NF-κB activity by inducing degradation of p-ikbɑ. Conclusions: Ursolic acid from Prunella vulgaris has the inhibitory effect of osteoclast differentiation and bone resorption. Futher studies are needed to treat osteoporosis by usolic acid from Prunella vulgaris. Key Words: Ursolic Acid, Prunella Vulgaris, Osteoclast, NFATc1, C-Fos, OSCAR, TRAP Corresponding author(kyung-sub Lee) : Dept. of Gynecoloogy, Kangam Korean Hospital, Kyung-Hee University, 994-5, Daechi 2-dong, Gangnam-gu, Seoul, Korea Tel : 02-3457-9003 E-mail : kyungsl@nate.com 59
夏 枯 草 에서 추출한 Ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과 Ⅰ. 서 론 세계보건기구(WHO)는 골다공증을 골 량의 감소와 미세구조의 이상을 특징으로 하는 전신적인 골격계 질환으로, 결과적 으로 뼈가 약해져서 부러지기 쉬운 상태 가 되는 질환으로 정의하고 있다 1). 이는 파골세포와 조골세포간 상호작용의 불균 형으로 발생하는데, 폐경 이후 여성호르 몬의 결핍으로 발생하는 골다공증은 조 골세포에 의한 골형성보다 파골세포의 골 흡수의 증가가 주요한 원인으로 알려 져 있다 2). 현재 골다공증 치료 방법으로 뼈 손실 이 더 이상 증가하지 않고 진행속도를 지 연시키는 방법을 많이 사용하고 있는데, 알렌드로네이트와 같은 비스포스포네이 드(bisposphonate) 계열의 약제들을 사 용하고 있지만 사용의 번거로움과 낮은 약효 및 부작용으로 인해 사용에 많은 제 한이 따르고 있다 3). 그리고 뼈 손실의 진 행속도를 지연시켜 골량 유지에 효과적인 것으로 알려진 에스트로겐 호르몬 대체 요법은 10년 이상의 장기 치료 시 유방암, 고혈압 발생 빈도의 증가 등의 부작용이 있다 3). 그래서 최근에는 비교적 부작용이 적은 한약재를 이용한 파골세포 분화 억 제 연구가 활발하게 이루어지고 있다 4-8). 夏 枯 草 는 脣 形 科 (꿀풀과, Labiatae)에 속한 多 年 生 本 草 인 꿀풀 Prunella vulgaris var. lilacina NAKAI의 果 穗 를 건조한 것 으로 性 味 는 寒 無 毒 하고, 味 는 苦 寒 하 다. 歸 經 은 肝, 膽 經 이며, 淸 肝, 散 結 하는 효능으로 瘰 癧, 癭 瘤, 乳 癰, 目 赤 腫 痛, 頭 痛, 筋 骨 疼 痛 등을 치료한다 9). 실험적 연 구로는 유방암 예방효과 10), 갑상선항진증 개선효과 11), 항염증효과 12), 면역증강효과 13), 간보호효과 14) 및 항알러지 효과 15) 등이 있다. 夏 枯 草 의 주 효능이 肝 血 을 補 하여 肝 虛 를 치료하는데 있고 16), 肝 血 이 충분하 면 腎 精 으로 化 함으로써 腎 精 이 충만해 진다. 골다공증은 骨 痿 등의 병증과 유 사하고 17) 骨 은 腎 과 밀접한 관련이 있으 므로 18) 夏 枯 草 의 補 肝 腎 하는 효능이 골다 공증에 양호한 효과를 나타낼 것으로 생각 된다. 또한 夏 枯 草 의 全 草 는 triterpenoid saponins을 함유하는데, 그 sapogenin에는 ursolic acid이 포함되어 있다. Triterpenoid saponins 유도체인 ursolic acid는 이성질 체로 생물학적 활성 때문에 치료제로서 관심이 집중되고 있는데, 조골세포의 분 화를 촉진시키고, 골 형성을 유도하였다 는 실험결과가 있다 19). 그러나, 폐경후 골 다공증은 파골세포의 골 흡수 증가가 골 다공증의 병인으로 중요한데, 아직까지 夏 枯 草 성분 ursolic acid의 파골세포 분 화억제 효과를 알아본 연구가 없었다. 이에 저자는 夏 枯 草 성분 ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과를 알아보기 위해, TRAP 활성과 actin ring 형성, nuclear factor of activated T cells c1(nfatc1), c-fos, TRAP 및 osteoclast associated receptor(oscar)의 Real-time PCR 분 석, p-ikbɑ의 western blot 분석하여 유 의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다. Ⅱ. 실 험 1. 재 료 1) 검 액 夏 枯 草 (Prunella vulgaris) 주성분의 하 60
J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 나인 ursolic acid를 SIGMA Chemical (H5142, St. Louis, USA)에서 구매하여 DMSO에 녹인 후 0.22 μm 필터(Millopore Carrigtwohill, Ireland)에 여과하여 -20 에 보관하였으며 실험 시 용액제조 후 15 일 이내에 사용하였다. 2) 시 약 Murine receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)와 murine macrophage-colony stimulating factor(m-csf)는 Peprotech 사(London, UK)에서 구입하였다. TRAP staining solution은 Sigma Aldrich사(St. Louis, USA)에서 구입하였으며, TRAP activity 실험에 사용된 TRACP assay kit 는 TaKaRa(Tokyo, Japan)에서 구입하였 다. β-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology 사(Santa Cruz, USA)에서 구입하였다. Phospho-IκBα에 대한 항체는 Cell Signaling Technology사(Beverly, USA)의 제품을 사용하였다. α-minimum essential medium (α-mem), 10% fetal bovine serum(fbs), 1% antibiotic, Dulbecco s phosphate-buffered saline(dpbs)은 Gibco사(Rockville, USA) 에서 구입하였으며 0.1% Triton X-100는 Sigma Chemical사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. CCK-8(cell counting kit)은 Dojindo(Kumamoto, Japan)를 사용하였다. Rhodamin-conjugated phalloidin은 Molecular Probes(Eugene, USA)에서 제품을 구입 하여 사용하였다. 3) 파골세포의 배양 및 분화 6주령의 수컷 ICR 생쥐를 희생시킨 후 α-mem을 1cc 주사기에 충전하여 경골 및 대퇴골에서 골수를 채취하였다. 채취 한 골수세포에서 적혈구를 제거한 후 10% 의 FBS과 1%의 antibiotic과 30 ng/ml의 M-CSF를 첨가한 α-mem 배지에서 5% CO 2, 95% 습도 및 37 를 유지하면서 3 일간 배양하였다. 배양 후 cell culture plate 바닥에 부착된 세포를 파골전구세포로서 의 대식세포(bone marrow macrophages, BMMs)로 사용하였다. 2. 방 법 1) 세포 독성 측정 BMMs를 96-well plate에 1 10 4 cells/well 로 분주하고 M-CSF 30 ng/ml를 처리한 후 ursolic acid를 각각 0.1, 1, 10, 50, 100 및 500 μm을 첨가하여 24시간 및 48시 간 배양하였다. 그 후 각각의 well에 cell counting kit(cck-8, Dojindo, Japan) 용액을 처리하고 2시간 동안 배양한 후, ELISA microplate reader(bio-rad, Hercules, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성 효과는 시료를 첨 가하지 않는 대조군에 대한 백분율(%) 로 표시하였다. Ursolic acid 10 μm에서 독성이 나타났기에 0 μm를 대조군으로 하고 실험군의 농도를 0.1, 0.5, 1 μm로 결정하였다. 2) TRAP 활성세포 염색과 세포 수 측정 BMMs를 48-well plate에 2 10 4 cells/well 로 분주하고 RANKL 100 ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml로 처리한 배지에 ursolic acid 0.1, 0.5 및 1 μm를 각각 첨가하고 4일 동안 배 양하였다. 4일 후 세포를 3.7% formaldehyde 에 20분간 고정하고 DPBS로 3회 세척 후 0.1% Triton X-100으로 10분간 세포막을 용해시키고 다시 DPBS로 3회 세척한다. TRAP 용액으로 염색하여 보라색의 TRAP positive cell인 파골세포를 확인 하였고, 염색된 파골세포 중 핵이 3개 이상인 세포 의 개수를 현미경에서 직접 관찰하였다. 61
夏 枯 草 에서 추출한 Ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과 3) TRAP activity 측정 BMMs를 48-well plate에 2 10 4 cells/well 로 분주하고 RANKL 100 ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml로 처리한 배지에 각각 ursolic acid 0.1, 0.5, 1 μm를 첨가하고 배양하였다. 4일 후 배양액을 제거하고 DPBS 용액으로 3 회 세척 후, 1.5 ml의 e-tube에 cell을 수확 하여 담은 후 protease inhibitor가 첨가된 lysis buffer [40 mm HEPES(pH 7.0), 0.1% NP-40, 20% glycerol, 5 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, 48 μg/ml PMSF]를 60 μl씩 넣고 세포막을 용해시켰다. 4 13000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상 층액 50 μl를 취하여 TRACP assay kit protocol 대로 만들어낸 혼합액 50 μl와 함께 60분 동안 배양한 후, 1 N 수산화나 트륨 용액을 50 μl씩 넣어 효소 반응을 정 지시키고 ELISA microplate reader를 이 용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며 남은 10 μl의 상층액으로 Bradford assay를 이용하여 cell을 정량하였다. TRAP activity 실험 결과는 시료를 첨가하지 않는 대조 군의 흡광도에 대한 백분율(%)로 표시 하였다. 4) Real-time PCR 분석 BMMs를 48-well plate에 2 10 4 cells/well 로 ursolic acid 0.1, 0.5 및 1 μm를 첨가 한 그룹별로 3개씩 분주하고 RANKL 100 ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml를 4일 동안 함 께 배양 후 각각 3개의 well을 함께 수집하 여 RNA RNeasy kit(qiagen, Valencia, USA)를 이용하여 cell에서 총 RNA를 분 리하였다. 추출한 RNA의 1 μg을 oligo-dt (Invitrogen, Carlsbad, USA)를 사용하여 cdna로 합성하였다. 합성된 cdna를 iq SYBR Green supermix(bio-rad, Hercules, USA)로 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 중합효소연쇄반응에 사용된 primer는 파골 세포 분화의 지표로 사용된 TRAP, OSCAR, NFATc1 및 C-Fos이고 control 유전자인 GAPDH와 비교하여 그 상대적 양을 비교 하였다. Primer의 염기서열은 TRAP [(sense) 5 - CTG GAG TGC ACG ATG CCA GCG ACA - 3, (antisense) 5 - TCC GTG CTC GGC GAT GGA CCA GA - 3 ], OSCAR [(sense) 5'- CTG CTG GTA ACG GAT CAG CTC CCC AGA -3', (antisense) 5'- CCA AGG AGC CAG AAC CTT CGA AAC T -3'], NFATc1 [(sense) 5 - CTC GAA AGA CAG CAC TGG AGC AT - 3, (antisense) 5'- CGG CTG CCT TCC GTC TCA TAG -3'], c-fos [(sense) 5'- CTG GTG CAG CCC ACT CTG GTC -3', (antisense) 5'- CTT TCA GCA GAT TGG CAA TCT C -3'], GAPDH [(sense) 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TAC CC -3', (antisense) 5'-CCT CAG TGT AGC CCA AGA TGC CCT -3'] 이다. 각 각의 annealing 온도는 TRAP 66, OSCAR 60.4, NFATc1 58.3, c-fos 57, 시 간은 30초, extension 온도는 72 에 30 초로 사이클을 45회 반복시켰다. 각각의 cycle threshold(ct)값을 GAPDH의 CT 값과 비교하여 상대 비교 방법으로 계산 하여 그래프로 나타내었다. Real-time PCR 에 사용된 기계는 icycler mini opticon system(bio-rad, Hercules, USA)을 사 용하였다. 시료를 첨가하지 않은 대조군 의 값을 1로 정하고 시료를 첨가한 것을 그에 대한 비율로 그래프로 나타내었다. 5) Western blot 분석 BMMs를 2개의 6-well plate에 1 10 6 cells/well로 분주한 후 대조군은 100 ng/ml 의 RANKL만 들어있는 배지에 키우고 실 62
J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 험군은 100 ng/ml의 RANKL과 10 μm의 ursolic acid가 함유된 배지를 넣어서 배 양했는데 이때 대조군과 실험군 모두 각 각 5분, 15분, 30분이 되었을 때마다 각 각의 well의 cell을 DPBS로 세척 후 수확 하였다. Protease inhibitor와 phosphatase inhibitor가 함유된 lysis buffer [40 mm HEPES(pH 7.0), 0.1% NP-40, 20% glycerol, 5 μg/ml leupeptin, 10 μg/ml aprotinin, 48 μg/ml PMSF]를 첨가하여 30분간 유지 하여 lysis시킨 후 13,000 rpm으로 4 에서 원심분리를 하여 상층액을 사용하였다. 단 백질을 정량하여 각각의 sample이 40 μg 으로 통일한 후, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis를 수행 하였다. semi-dry transfer(bio-rad, Hercules, USA)를 이용하여 membrane에 단백질을 이동하였다. 5% skim milk(bio-rad, Hercules, USA)를 처리하여 비특이 단백질이 붙는 것을 방지한 후 단백질 각 사이즈별로 항 체를 처리하였다. 항체들을 차례로 반응시 키고 ECL kit(amersham Biosciences, USA) 를 사용하여 chemiluminescence로 확인하 였다. 실험에 사용한 항체는 p-iκbα, β-actin 에 대한 항체를 사용하였다. 6) Actin ring 염색 BMMs를 48-well plate에 2 10 4 cells/well 로 분주하고 RANKL 100 ng/ml와 M-CSF 30 ng/ml로 처리한 배지에 ursolic acid 0.1, 0.5 및 1 μm를 첨가하고 4일 동안 배양하 였다. 4일 후 세포를 3.7% formaldehyde 에 20분간 고정하고 DPBS로 3회 세척 후 0.1% Triton X-100으로 10분간 용해시키 고 다시 DPBS로 3회 세척한 후, 200:1로 희석한 rhodamin-conjugated phalloidin 을 처리하여 30분간 배양하였다. Actin ring 형성은 형광현미경 Olympus IX 71-F3 2PH(Olympus, Japan)를 사용하여 관찰 하였다. 7) 통계분석 실험결과에 대한 통계처리는 SPSS version 13.0을 이용하였다. 대조군과 각 농도별 ursolic acid의 비교는 one-way ANOVA 를 사용하였고 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 차이가 있다고 판정하였다. Ⅲ. 결 과 1. 세포 독성 평가 BMMs에 M-CSF 30 ng/ml를 처리한 후 ursolic acid 0.1, 1, 10, 50, 100 및 500 μm을 첨가하여 24시간 및 48시간 배양 한 후 cell viability를 측정한 결과, 1 μm 에서 세포 독성이 없는 것으로 평가되었 다(Fig. 1). Fig. 1. Cytotoxicity of Ursolic Acid from Prunella Vulgaris on BMMs 2. 파골세포 분화 억제 효과 1) TRAP 염색 TRAP 염색 후 TRAP positive cell을 현미경으로 관찰한 결과 ursolic acid 0.1, 0.5 및 1 μm에서 대조군에 비해 농도 의 존적으로 억제되었다(Fig. 2A). 63
夏 枯 草 에서 추출한 Ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과 2) TRAP positive cell 수 TRAP 염색 후 TRAP positive cell 수 를 측정한 결과, 대조군 124.33±7.50개에 비해, ursolic acid 0.1μM군에서는 110.67± 2.51개(p<0.05), 0.5μM군에서는 94.67±6.81 개(p<0.01) 및 1μM군에서는 21.33±3.51개 (p<0.01)로 유의하게 억제되었다(Fig. 2B). 3) TRAP activity TRAP activity를 측정한 결과 대조군 100.00±2.50%에 비해 ursolic acid 0.1 μm 군에서 80.23±4.53%(p<0.01), 0.5 μm군에서 63.45±4.70%(p<0.01) 및 1 μm군에서 16.27 ±2.66%(p<0.01)로 유의하게 억제되었다 (Fig. 2C). A B Control 0.1μM 0.5μM 1μM C Fig. 2. Effect of Ursolic Acid from Prunella Vulgaris on Osteoclast Differentiation Induced by RANKL. A : Cells were fixed and TRAP stained B : TRAP-positive cells were counted as osteoclasts C : TRAP activity were measured using absorbance (*p<0.05, **p<0.01 compare to control) 3. 파골세포 분화 유전자 발현 및 신호 통로 억제 효과 1) NFATc1, c-fos, TRAP 및 OSCAR 파골세포 분화시 지표로 사용되는 NFATc1, c-fos, TRAP 및 OSCAR의 Real-time PCR 결과 대조군에 비해 ursolic acid 0.1, 0.5 및 1 μm에서 모두 억제되었고, 1 μm에 서 가장 많이 억제되었다(Fig. 3A). 2) p-ikbɑ 파골세포 분화의 대표적인 신호통로인 NF-κB에 대해서 알아보기 위하여 p-ikbɑ 를 western blot으로 확인한 결과, 대조군 에 비해 ursolic acid 1 μm에서 인산화된 IkBɑ 신호 강도가 약하게 나타났다(Fig. 3B). 64
J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 A NFATc1 c-fos B TRAP TRAP Fig. 3. Effect of Ursolic Acid from Prunella Vulgaris on the Expression of NFATc1, C-Fos, TRAP, OSCAR and NF-κB Signal A : Gene expression levels of each genes are measured by Real-time PCR B : Cell lysates were analyzed by Western blotting with antibody to specific for phosphorylated IκBα (* : p<0.05, ** : p<0.01, compare to control group) 4. Actin ring 형성 억제 효과 Actin ring 형성은 대조군에 비해 夏 枯 草 성분 ursolic acid 0.1, 0.5 및 1 μm에서 모두 억제되었으며 1 μm에서 가장 많이 억제되었다(Fig. 4). Control 0.1μM 0.5μM 1μM Fig. 4. Inhibitory Effect of Ursolic Acid from Prunella Vulgaris on Actin Ring Formation in BMMs Stimulated with RANKL. 65
夏 枯 草 에서 추출한 Ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과 Ⅳ. 고 찰 골다공증은 골량의 감소와 미세구조의 이상을 특징으로 하는 전신적인 골격계 질환으로, 결과적으로 뼈가 약해져서 부 러지기 쉬운 상태가 되는 질환으로 정의 한다 1). 골의 항상성은 새로운 골기질을 형 성하는 조골세포와 오래된 골기질을 흡수 하는 파골세포의 적절한 균형에 의해 유 지되는데, 식이, 호르몬과 물리적인 스트 레스 등의 요인들에 의해 상호작용의 불 균형이 초래되어 골다공증이 발생하게 된 다 20). 특히, 여성들의 폐경기로 인해 발생 하는 골다공증은 조골세포에 의한 골형 성 보다는 골을 흡수하는 파골세포 활성 증가가 주된 원인으로 알려져 있다 21). 파골세포는 단핵-탐식세포(monocytemacrophage) 계통의 조혈전구세포(hematopoietic precursor)에서 분화되며, 골내막에 위치 하며 골조직에 존재하는 유일한 다핵세포 이다. 또한 파골세포는 tartrate-resistant acid phosphatase(trap)와 풍부한 calcitonine (CT) 수용체를 가지는 특징이 있으며 실 제적으로 뼈의 흡수작용을 할 때는 산 생 성이 활발하고 actin ring을 형성하여 골 기질을 흡수한다 22). 완전한 기능을 하는 파골세포가 되기 위 하여 일련의 분화과정을 거쳐야 하는데 파골전구세포는 분화에 중요한 두 가지 사이토카인 M-CSF(macrophage colonystimulating factor)와 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κb ligand)의 조절에 의해 성숙한 파골세포로 분화된다 23). 특히 파골세포의 생존, 분화, 다핵화, 활성 화에 총체적인 역할을 하는 RANKL은 TNF 계열의 사이토카인으로 수용체인 RANK와 결합하여 TRAF6(TNF receptor associated factor 6)를 활성화하고, 이는 NF-κB(nuclear factor-κb), NFATc1(nuclear factor of activated T cells cl)등과 같은 전사인자 를 활성화하여 파골세포 분화과정이 진 행된다. 따라서 RANKL 신호 과정의 각 단계별 차단을 통한 과도한 파골세포 형 성의 억제는 골다공증에 대한 치료적 접 근을 가능하게 한다 20). 黃 帝 內 經 에서 腎 主 骨, 腎 主 骨 髓, 腎 藏 精, 腎 者... 精 之 處 也 其 華 在 髮 其 充 在 骨 이라하여 骨 은 腎 과 밀접한 관련이 있다 24). 골다공증은 한의학적으로 骨 痿, 骨 枯, 骨 痺 등의 범주에 속하는데 17), 그 주된 병인 은 腎 虛 라고 보았으며 25) 나타나는 증상에 근거하여 腎 虛, 腎 陰 虛, 腎 陽 虛, 肝 腎 不 足, 脾 腎 陽 虛 등으로 변증분류할 수 있다 26). 최근에는 골다공증과 관련하여 鹿 茸 4), 天 門 冬 5), 牛 膝 6,8) 등의 補 腎, 强 筋 骨 하는 약 재를 이용한 실험연구가 많으며, 活 血 하는 紅 花 子 7), 舒 肝 行 氣 하는 天 楝 子 27) 등 다양 한 약재를 이용한 연구들도 있다. 夏 枯 草 는 脣 形 科 (꿀풀과, Labiatae)에 속한 多 年 生 本 草 인 꿀풀 Prunella vulgaris var. lilacina NAKAI의 果 穗 를 건조한 것 으로 性 味 는 寒 無 毒 하고, 味 는 苦 寒 하며, 歸 經 은 肝, 膽 經 이다 9). 夏 枯 草 의 補 肝 腎 하는 효능이 있어 골다공증에 양호한 효과 를 기대할 수 있으며, 특히 夏 枯 草 의 全 草 는 triterpenoid saponins을 함유하는데, 그 sapogenin에는 ursolic acid가 포함되어 있다 9). Triterpenoid saponins 유도체인 ursolic acid는 이성질체로 생물학적 활성 때문에 치료제로서 관심이 집중되고 있는 데, 항세균 28), 항암 29), 항염증 30), 간보호 효 과 31), 항우울 32), 항불안 33), 비만 및 지방간 억제 34) 등이 연구된 바 있다. 또한 ursolic 66
J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 acid가 조골세포의 분화를 촉진시키고, 골 형성을 유도하였다는 실험결과가 있어 19), 골다공증에 도움이 될 것으로 생각된다. 그러나 골다공증에 직접적인 영향을 미 치는 파골세포의 억제에 관한 연구는 아 직 없었다. 이에 저자는 夏 枯 草 성분 ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과를 알아보기 위해, TRAP 활성과 actin ring 형성, nuclear factor of activated T cells c1(nfatc1), c-fos, TRAP 및 osteoclast associated receptor(oscar)의 Real-time PCR 분 석, p-ikbɑ의 western blot 분석을 이용 하여 조사하였다. 夏 枯 草 성분 ursolic acid의 세포독성 여부를 확인하기 위해 cell viability를 살 펴본 결과, ursolic acid 10μM에서 24, 48 시간 배양시 유의한 세포 독성이 나타났다. 따라서 본 실험에서 사용할 ursolic acid 의 농도는 0.1, 0.5, 1 μm로 택하여 실험 을 진행하였다. 파골세포가 골 흡수 작용을 할 때, TRAP 효소의 분비가 증가하는데, TRAP은 성 숙한 파골세포에만 유일하게 존재하는 세 포 화학적 표지자로서 이를 통해 파골세 포의 분화정도를 측정할 수 있다 35). 파골 세포 분화시 분화 marker인 TRAP을 염색 하여 분화 정도를 확인한 결과, 0.1, 0.5, 1 μm의 ursolic acid에서 분화가 억제되는 것을 확인하였다. 또한 TRAP 활성을 정 량적으로 측정한 TRAP positive cell 수 와 흡광도를 이용한 TRAP activity도 모 든 실험농도에서 감소하였다. 이는 夏 枯 草 성분 ursolic acid가 파골세포 분화 억 제효과가 있음을 의미한다. 골세포 표면의 actin ring 구조는 필수 적이며 이를 통해 골기질을 흡수한다. 파 골세포가 분화하면 그 크기가 거대해지 고 표면이 actin ring을 형성하여 골흡수 과정에 관여하게 된다 36). 따라서 파골세 포에 있어 actin ring 형성은 세포가 뼈를 흡수할 수 있는 능력에 대한 중요한 표지 가 된다 37). 이번 실험에서 BMMs에 RANKL 과 M-CSF를 투입한 후, 夏 枯 草 성분 ursolic acid를 처리한 결과 파골세포의 actin ring 이 농도 의존적으로 둥글고 매끄러운 전형 적인 형태가 유지되지 않았다. 이는 ursolic acid가 골 흡수 과정에 관여하여 파골세포 분화를 억제함을 의미한다. RANKL은 수용체인 RANK와 결합으로 중요한 세포내 여러 신호전달 물질 c-fos, NFATc1 등 전사인자를 활성화시킨다. 전 사인자 c-fos는 RANKL에 의한 파골세포 분화초기에 발현되는 중요한 전사인자로 NFATc1의 발현을 촉진한다 38). NFATc1 은 세포질에 존재하지만 calcium/camodulin 신호전달 체계에 의존적으로 calcineurin이 라 불리는 phosphatase에 의해서 활성화되 어 핵으로 이동한다 39). 핵으로 이동한 NFATc1 은 파골세포에 특이적인 유전자인 TRAP, OSCAR 등의 유전자 발현을 촉진한다 40). 이번 실험에서 BMMs에 ursolic acid 0.1 μm, 0.5 μm, 1 μm를 첨가하여 RANKL과 M-CSF로 4일 동안 함께 배양 후 NFATc1, c-fos, TRAP 및 OSCAR를 Real-Time PCR 로 분석한 결과, 파골세포 분화시 발현되는 유전자 중 전사인자인 NFATc1 및 c-fos 와 분화 marker인 TRAP, OSCAR의 발 현이 모든 농도에서 억제되었다. RANKL에 의한 파골세포 분화 개시는 다양한 신호전달 체계를 경유한다. 특히 전사인자인 NF-κB는 분화에 중추적인 역 할을 하는 NFATc1와 c-fos를 조절하는 중요한 신호전달 물질로 알려져 있다 20). 67
夏 枯 草 에서 추출한 Ursolic acid의 파골세포 분화 억제 효과 RANKL과 수용체인 RANK의 결합은 RANK에 부착되어 있는 TRAF6을 활성 화하며, 이에 I-κB kinases a and b 등의 활성화는 세포질 내에서 NF-κB와 복합 체를 형성하고 있는 I-κB의 분해를 유도 하여, 이에 따라 NF-κB가 핵 내로 이동하 여 전사인자로의 역할을 수행하게 한다. 따 라서, 세포내 신호전달 물질인 IkBɑ 등 의 인산화로 인한 전사인자의 유도는 파 골세포 분화에 필수적이다 41). BMMs에 RANKL 100 ng/ml와 夏 枯 草 성분 ursolic acid 1 μm를 처리한 후, Western blot 분석을 이용하여 IkBɑ의 인산화를 측 정한 결과, RANKL만 처리한 대조군은 시간 의존적으로 p-ikbɑ 단백 발현이 증 가되었지만 ursolic acid를 같이 처리한 실 험군의 p-ikbɑ 단백 발현은 대조군에 비 하여 감소되었다. 이를 통해 夏 枯 草 성분 ursolic acid가 파골세포 분화시 요구되는 IkBɑ signal을 억제함으로써, 파골세포 분 화를 억제함을 확인하였다. 따라서, 이번 실험에서 夏 枯 草 성분 ursolic acid가 TRAP 활성 세포 수와 TRAP activity 를 감소시키고 actin ring 형성을 억제하 였는데, 이는 ursolic acid가 파골세포 분화 억제 효과가 있음을 의미한다. 이는 전 사인자인 c-fos와 NFATc1 및 NF-κB의 발현을 억제하여 분화 marker인 TRAP, OSCAR의 발현 억제를 통하여 이루어진 것으로 생각된다. 이것을 통하여 볼 때, 夏 枯 草 성분 ursolic acid가 폐경기 골다 공증 치료제로 개발될 수 있는 가능성을 보여주었고, 추후 이와 관련된 임상 연 구가 이루어져야 할 것이다. Ⅴ. 결 론 夏 枯 草 에서 추출한 ursolic acid의 파 골세포 분화 억제효과를 알아보기 위해, TRAP 활성과 actin ring 형성 억제효과, NFATc1, c-fos, TRAP 및 OSCAR의 Real -Time PCR 분석 및 p-ikbɑ의 western blot 분석을 이용하여 조사한 결과 다음 과 같은 결론을 얻었다. 1. 夏 枯 草 성분인 ursolic acid는 1 μm 이 하의 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다. 2. TRAP positive cell 수 및 TRAP activity 는 夏 枯 草 성분인 ursolic acid 모든 농 도에서 억제되었다. 3. Actin ring 형성은 夏 枯 草 성분인 ursolic acid 모든 농도에서 억제되었다. 4. NFATc1, c-fos, TRAP 및 OSCAR의 유전자 발현은 夏 枯 草 성분인 ursolic acid 모든 농도에서 억제되었다. 5. IkBɑ의 인산화된 신호강도는 夏 枯 草 성분인 ursolic acid 1μM에서 억제되 었다. 투 고 일 : 2014년 4월 28일 심 사 일 : 2014년 4월 28일 게재확정일 : 2014년 5월 10일 참고문헌 1. 정호연. 골다공증 진단 및 치료 지침 2007. 대한내분비학회지. 2008;23(2):76-108. 2. Del FA, Teti A, Rucci N. Osteoclast receptors and signaling. Arch Biochem Biophys. 2008;473:147-60. 68
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