pissn 1229-1218 Original Article / 원저 도인승기탕에의한당뇨병성혈관장애개선효과 이윤정 1,2,3 김언국 2 김혜윰 1,2,3 윤정주 1,2,3 이소민 1,2,3 이용표 1,2,3 이건목 2 강대길 1,2,3 이호섭 1,2,3* 1 한의과대학생리학교실 2 원광대학교한의학전문대학원 3 한방체액조절연구센터 Therapeutic Effect of Doinseunggi-tang on Diabetic Vascular Dysfunction Yun Jung Lee 1,2,3 Eon Kuk Kim 2 Hye Yoom Kim 1,2,3 Jung Joo Yoon 1,2,3 So Min Lee 1,2,3 Geon Mok Lee 2 Dae Gill Kang 1,2,3 Ho Sub Lee 1,2,3* 1 College of Oriental Medicine 2 Professional Graduate School of Oriental Medicine 3 Hanbang Body-fluid research center, Wonkwang University ABSTRACT Objectives : Diabetes mellitus is the leading cause for vascular complications such as atherosclerosis. The present study is to investigate whether Doinseunggi-tang (DST) improves diabetic vascular dysfunction in type II diabetes. Methods : The db/db mice were treated with high fat/high cholesterol diet and DST (200 mg/kg/day) for 8 weeks. Results : DST significantly lowered blood glucose and systolic blood pressure. In addition, DST also markedly decreased total plasma cholesterol, triglyceride, and LDL-cholesterol, whereas increased the HDL-cholesterol. Vascular relaxation of aortic rings by acetylcholine or SNP was ameliorated by DST in a dose-dependent manner. Damage of vascular intima and hypertrophic of media was improved by DST. Immunohistological study revealed that DST attenuated the increase of ICAM-1, VCAM-1, and ET-1 expression in thoracic aorta. c 2013 The Korean Medicine Society For The Herbal Formula Study This is an open access journal which permits unresticted access via the internet (URL, http://www.ompak.okdanche.com.) non-commercial use, dist ribution, reproduction and providing the original work is properly cited. 119
(2013 년 6 월 ) Conclusions : Taken together, DST suppressed hyperglycemia and diabetic vascular dysfunction in type II db/db mice. The present data suggests that Doinseunggi-tang may be prevent a development of diabetic atherosclerosis. Keyword : Doinseunggi-tang, Hypertension, Diabetes, Vasorelaxation, Cholesterol. * Ⅰ. 서론 당뇨는인슐린의부족또는인슐린의기능저하 로인해탄수화물, 단백질, 지질대사가비정상적 으로진행되어고혈당과이상지혈증 (dyslipidemia) 을나타내게된다. 만성적인고혈당상태는다양 한합병증으로이행되는데, 주요만성합병증으로 는당뇨병성망막, 당뇨병성신부전, 동맥경화증 과함께고혈압, 신장병, 뇌졸중및심장병을악 화시키기도한다 1). 특히, 죽상경화같은대혈관관 련질환은당뇨병환자에게중요한합병증이며, 높 은사망률에기인하는질환이다 2, 3). 혈관내피세 포손상은세포유착분자및사이토카인의과발 현을통하여나타나며, 특히죽상경화에의한손 상에있어혈관내벽은 intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) 등과같은세포유착분자 (cell adhesion molecules) 발현증가를유도한다 4). 이러한상황에서수많은백혈구가혈관내벽에붙 게되며, 혈관내벽을통과하여내피세포기능저 하및조직손상을유발하게된다. 따라서이러한 혈관질환을억제하고치료하는합성의약품의사 용이크게증가되고있으나이들대부분심각한 부작용을동반하기때문에보다안전하고효과있 는천연물의개발연구가활발히이루어지고있다 5). 이에우리는이미오래전부터임상에서사용되어 온천연물들의복합물인도인승기탕을이용하여 본연구를진행하였다. * 교신저자 : 이호섭, 원광대학교한의과대학생리학교실 Faxl : 063-850-7260 E-mail : host@wku.ac.kr 접수 2013/03/28 수정 2013/04/17 채택 2013/04/19 도인승기탕 ( 桃仁承氣湯 ) 은감초, 대황, 도인, 그리고육계의복합물 6) 로서감초 (Glycyrrhiza uralensis) 는단맛성분인 glycyrrhizin을함유하여감미료로사용되고있으며, 약리작용으로는해독작용, 면역작용, 신장염, 전립선암등의효능이있는것으로알려져있다 7, 8). 최근연구에의하면도인승기탕이알츠하이머질환모델의신경세포에대한보호효과및백서의간손상에대한개선효과를가지고있는것으로보고되어있다 9, 10). 도인승기탕을구성하는각각의약재들중대황 (Rhizoma Rhei Radix) 은뿌리를건조시킨약재로, 항염증작용및항산화효능을갖는다고하였다 11). 특히도인승기탕을구성하는주요약재인도인 (Persicae Semen) 은 神農本草經 12) 에서 味苦平 主瘀血血閉瘕邪殺小蟲 이라하였고, 本草綱目 13) 에서는 主治瘀血血閉癥瘕邪氣殺小蟲 이라고하였으며, 천연항산화제, 노화억제, 항암억제제로오래전부터여성의질환과퇴행성질환등에사용되었으며항암및항- 어혈작용등이보고되어있다 14, 15, 16). 육계 (Cinnamomi cortex) 는녹나무과 Lauraceae에속하는육계의수피를건조한한약재 17) 로주성분은정유성분인 cinnamic acid 와 cinnamaldehyde, cinnamyl alcohol acetate, phenylpropyl acetate, methyl vinyl ketone 등이보고되어있고, 약리연구로는혈관확장작용, 혈액순환촉진작용, 진정, 해열, 건위작용등이보고되어있다 18, 19). 도인승기탕과유사한처방으로는대황목단피탕 20) ( 동과자, 대황, 도인, 망초, 목단피 ), 계지복령환 21) ( 도인, 계지, 복령, 목단피, 작약 ), 당귀승기탕 22) ( 당귀, 대황, 망초, 감초 ), 그리고칠물후박탕 23) 120
이윤정외 8 인 : 도인승기탕에의한당뇨병성혈관장애개선효과 Lee et al., Therapeutic Effect of Doinseunggi-tang on Diabetic Vascular Dysfunction ( 후박, 지실, 대황, 감초, 계지 ) 등이있으며, 이들처방은당뇨병성질환들의개선또는항산화효과등을가지는것으로연구되었다. 그러나도인승기탕의구성약재각각은많은연구결과가보고되어있을뿐아니라유사처방에대한연구도보고되었음에도불구하고, 도인승기탕자체에대한약리작용은전반적으로수행되어있지않다. db/db 마우스 (C57BL/KsJ) 는시상하부에위치한비만유전자 (leptin) 수용체인 Ob-Ra가변이되어 leptin 신호전달과정에결함이생겨과도한먹이섭취, 지방축적이일어나제 II형당뇨와유사한형태의비만증, 고인슐린혈증, 고혈당등을나타내는동물이다. 24) 그러므로본연구는 db/db 마우스에고지방 / 고콜레스테롤식이를실시하여감초, 대황, 도인, 육계등의복합처방인도인승기탕의투여에따른대사기능및혈관장애개선효과를조사하고자하였다. Ⅱ. 재료및방법 1. 시료의제조도인승기탕 (135g) 은전탕추출법을이용하여제조하였다. 감초 (15g), 대황 (75g), 도인 (37.5g), 육계 (7.5g) 는건조된것을원광대학교익산한방병원에서구입한후증류수 1,000mL 가들어있는냉각기가설치된삼각플라스크에넣은후 120분간가열하였다. 도인승기탕추출액을 3,000rpm 으로 30분간원심분리하여얻은상등액을회전식증발기로감압농축한후동결건조하여추출물 23.45g ( 수득율 17.37%) 의분말을얻었다. 2. 실험동물및식이실험은동물실험윤리위원회의승인을얻어시행하였으며, 동물관리규정을준수하였다. 7주령의수컷 db/db마우스 (C57BL/KSJ, n=10) 와 Wild type 마우스 (C57BL/KSJ-m + /m +, n=10) 를 central Lab. (Seoul, Korea) 에서제공받아실험에사용하였다. 8주령이되었을때다음과같이 10마리씩 4개그룹으로무작위로구분하였다. 1군 : 대조군 (Wild type 마우스, 일반식이 ), 2군 : 당뇨유발군 (db/db마우스, 고지방식이 ), 3군 : 양성대조군 (db/db마우스, 고지방식이, rosiglitazone, 10 mg/kg/day), 4군 : 도인승기탕투여군 (db/db마우스, 고지방식이, 200mg/kg/day). 고지방식이군은 60kcal% fat/300.8 mg/kg cholesterol (D12492) 를 8주간섭취하였다. 양성대조군으로는 PPAR (proliferator -activited receptor)-γ 길항제로잘알려진 ro- siglitazone (RG) 을사용하였다. 실험기간동안식이와식수는자유롭게섭취할수있도록하였다. 체중은매주측정하였으며, 혈당, 소변량, 삼투압및전해질량은 2주에한번측정하였다. 사육실의온도및습도는각각 22±2 및 50~60% 로유지하였으며, 12시간간격으로점등및소등하였다. 3. 혈당의측정혈당은마우스의꼬리정맥의전혈에서 Onetouch Ultra Blood glucose Meter 및 Test Strip (Life Scan Inc., CA, USA) 을이용하여측정하였다. 측정값은 Onetouch Ultra Blood glucose Meter 의수치를 mg/dl로나타내었다. 4. 혈압의측정수축기평균혈압은 automatic sphygmotonograph (Muromachi Kikai, Tokyo, Japan) 를이용하여흰쥐의꼬리동맥에서측정하였다. 각개체마다최소 8번혈압을측정하고그중 5mmHg 내에있는 5번의측정값을평균값으로이용하였다. 5. 콜레스테롤및지질함량측정혈장은 3,000rpm 으로 20분동안원심분리하고, 분석장비로서 Hitachi 7080(Hitachi, Japan) 을사용하였다. 혈장지질수치와생화학적수치는 8주동안투여한후공복시혈장으로마지막주에분석하였다. 마우스혈장에대하여 serum triglyceride(tg), total cholesterol(t-cho), low-density lipoproteins(ldl), high-density lipoproteins (HDL) 의혈액생화학적수치를측정하였다. 121
(2013 년 6 월 ) 6. Creatinine 및 creatinine 제거율측정혈장의 creatinine은분광광도계 (Miloton Roy, Rochester, NY, USA) 를이용해정량하여측정하였다. 7. 흉부대동맥의분리및혈관장력측정실험동물을단두한후흉부대동맥을분리하였다. 분리된흉부대동맥을 118mM NaCl, 4.7 mm KCl, 1.1mM MgSO 4, KH 2PO 4, 1.5mM CaCl 2, 25mM NaHCO 3, 10 mm glucose 가들어있는차가운 Krebs 용액 (ph 7.4) 에넣고연결조직과지방을제거한후약 3 mm의길이의절편으로만들었다. 흉부대동맥절편에 95% O 2-5% CO 2 기체로포화시킨 37 의 Krebs 용액으로고정시킨후 forcedisplacement transducer (Grass FT 03, GRASS Instrument, MA, USA) 가장착된생리기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA) 를이용하여 isometric tension을측정하였다. 실험에사용된혈관은내피세포가손상되지않도록주의하여분리하였으며, Kreb s 용액에서 1g 휴지기장력을유지하면서 1시간동안안정화시켰다. 혈관이안정화된후 phenylephrine으로수축시켰고이어서 SNP 및 ACh에대한혈관이완반응을측정하였다. 8. 조직절편제작과 hematoxylin-eosin 염색적출된흉부대동맥조직을 10% 포르말린 (ph 7.4) 에 3일고정시킨후, 수세로써조직내에남아있는포르말린을제거하였다. 50% 알코올에서부터 100% 알코올까지농도상승순으로탈수하고 xylene으로치환하였다. 파라핀침투과정을거친후포매하여블록을제작하였다. 이렇게준비된파라핀블록을회전형박절기 (microtome; Thermo Electron Corporation, Pittsburg, PA) 를사용하여 6-7μm으로자른뒤슬라이드위에부착시켜실온에서 3일동안건조시킨다. 절편된조직이붙어있는슬라이드를 xylene 용액에넣고파라핀을제거한다. 100%, 80%,70% 알코올순으로탈 xylene, 함수과정을거쳤으며수돗물에세척하였다. 핵염색을위해 Harris hematoxylin solution (Sigma, USA) 에 8분동안슬라이드를침적시킨후수돗물에세척한다. 감별탈색을위해 1% HCl-Alchol에 5초씩 2번침적시켜수돗물로세척한다. 0.5% Ammonium Water로중화현색한뒤수돗물에세척하고, 세포질염색을 1% eosin Y solution (Muto, Japan) 에 2분동암침적시킨후 60%, 80%, 90%, 100% 알코올순으로탈수과정을거친다. xylene 용액에서투명과정을거쳐봉입제로봉합한후광학현미경으로 400 배시야에서관찰한후사진을촬영하였다 (BX41, Olympus, Japan). 9. 혈관염증발현마커및혈관수축인자의발현측정적출된흉부대동맥조직을 4% paraformaldehyde 용액에담가 4 에서 5시간고정하고, 30% sucrose 용액에조직을침적시켰다. 조직을 OCT compound (Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance) 에넣고영하 20 에서동결한후 cryotome SME (Thermo Electron Corporation, Pittsburg, PA, USA) 를이용하여 4μ 의두께로평행하게횡단절편을만든후 poly-l-lysine 용액으로코팅한슬라이드글라스위에부착시켰다. 실온에서하룻밤충분히건조시킨다음영하 70 에서보관하였다. HISTO-STAIN R -SP Kits (Invitrogen Inc, USA) 를사용하여 [strept]avidine-biotin 방법을이용하여염색을진행하였다. 절편이붙어있는슬라이드를실온에 1시간정도건조시킨후 PBS 로 3번세척한후내인성과산화효소 (endogenous peroxidase) 의활성을방지하기위해 3% hydrogen peroxide 용액에넣어 1분간실온에방치하였다. 이후조직을 PBS로 3번세척한다음 10% nonimmune goat serum을사용하여 20분동안반응시켜항체의비특이적결합을방지하였다. Blocking antibody 를제거한뒤 CAMs (ICAM-1, VCAM-1) 및 ET-1에각각에결합하는 mouse monoclonal IgG 및 Goat polyclonal anti-mouse IgG (1 : 200, Santa Cruz Biotechnology, USA) 을습윤상자에넣고 4 에서하룻밤동안방치하였다. 슬라이드를세척한다음이차항체인 biotinylated secondary antibody에 20분동안실온에서반응 122
이윤정외 8 인 : 도인승기탕에의한당뇨병성혈관장애개선효과 Lee et al., Therapeutic Effect of Doinseunggi-tang on Diabetic Vascular Dysfunction 시킨후 PBS로 5분씩세번세척하였다. Horseradish peroxidase-conjugated streptavidin에 30분동안반응시킨후 PBS로세번세척하였다. 3-amino-9-ethylcarbazole(AEC) chromogen 과 hwmatoxylin (zymed, CA, USA) 을이용하여일정시간동안발색시킨다음슬라이드를흐르는물에씻어반응을중지시킨후봉입제로봉입하였다. 각각의발현정도는광학현미경으로 1,000배시야에서관찰한후사진을촬영하였다 (BX41, Olympus, Japan). 10. 통계처리실험결과의유의성은실험결과를 Students t- test 나 one-way ANOVA test를통하여 p가 0.05 이하인경우유의한차이로판정하였다. Ⅲ. 결과 1. 혈당및혈압변화도인승기탕의혈당및혈압의변화에미치는영향을알아보기위하여제 II형당뇨모델인 db/db 마우스에고지방식이와함께도인승기탕및 rosiglitazone 을각 각투여하면서, 약물처리 8주부터 16주차까지 2주에한번씩공복혈당을측정하였다. 그결과, db/db 마우스에고지방식이를실시한군은혈당을측정하는기간동안 580mg/dl 이상을유지하였다. 그러나도인승기탕및 rosiglitazone 을각각투여한군에서는유의성있는혈당감소효과를보였다 (Fig. 1). 한편 16주동안 wild type에 normal diet를실시한군은특이할만한혈당변화는보이지않았다. 또한혈압을측정한결과에서도 rosiglitazone 과도인승기탕을각각투여한군의수축기혈압이고지방식이를한 db/db 마우스군과비교했을때유의성있는감소를나타내었다 (Fig. 2). 몸무게및식이, 식수섭취량은 db/db 마우스군에서모두별다른차이를보이지않는것으로나타났다 (data not shown). 2. 혈장내콜레스테롤및지질대사에미치는영향제 II형당뇨병환자에서가장흔히나타나는지질대사이상은고지혈증, 특히고중성지방혈증으로 20-60% 의빈도로나타나며 25, 26), 이러한고지혈증은죽상경화증의주요위험인자의하나로작용하여결과적으로허혈성심질환을비롯한당뇨병의심혈관계합병증의발생에영향을미친다 27). Fig. 1. Effect of the DST on levels of blood glucose of db/db mice fed with HFHC diet. Values were expressed as mean ± S.E. (n=10). **p < 0.01 vs. W.T.; #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. db/db. W.T.; wild type control mice, RG; rosiglitazone, DS; Doinseunggi-tang Fig. 2. Effect of the DST on SBP of db/db mice fed with HFHC diet. Values were expressed as mean ± S.E. (n=10). **p < 0.01 vs. W.T.; #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. db/db. 123
(2013 년 6 월 ) 또한이들환자들에서혈중유리지방산의증가는간에서 VLDL의생합성을증가시키고증가된 VLDL은 LDL의증가를유발한다 28, 29). 또한유리지방산의증가는 Randle 등에의해제시된바와같이말초조직에서인슐린에대한저항성을증가시켜혈중포도당농도를상승시키는것으로알려져있다. 이에본연구에서혈중중성지방농도를측정해본결과, db/db 마우스군에서증가된중성지방의함량이도인승기탕을투여한군에서감소함을나타내었다. LDL의함량은 db/db 마우스군에서증가하였으며반면에도인승기탕을투여한군에서는유의성있는감소를보였다. 그러나 HDL의함량은 db/db 마우스군, rosiglitazone 투여군, 그리고도인승기탕투여군모두에서유의성있는증가를보였다 (Fig. 3). 3. Creatinine 및 creatinine 제거율에미치는영향혈장내 creatinine 농도는 db/db 마우스에서정상군에비해유의한증가를보였으며, 도인승기탕을투여한군에서는 db/db 마우스군과비교했을때유의하게감소되었다 (Fig. 10). Creatinine 제거율 (Ccr) 을측정한결과 db/db 마우스군에서정상군과비교했을때유의하게감소하였고, 도인승기탕투여군에서는유의하게회복되었다 (Fig. 4). 4. 혈관장력의변화제 II형당뇨모델인 db/db 마우스에서도인승기탕투여에의한혈관기능개선여부를확인하기위하여흉부대동맥을적출한후, 혈관이완실험을수행하였다. db/db 마우스에고지방식이를실시한군및도인승기탕, rosiglitazone 투여군의경동맥을이용하여 PE, ACh 및 SNP에대한혈관이완반응을조사하였다. 그결과, 혈관의수축반응에는어떤변화도나타나지않았으나, db/db 마우스에고지방식이를실시한군의경동맥에서내피세포의존성혈관이완인자인 ACh에대한혈관이완반응은일반식이를투여한군에비해현저히감소하였다. rosiglitazone을투여한군은고지방식이에의해감소된 ACh에대한혈관이완반응을현저히개선시켰고, 또한도인승기탕과함께 Fig. 3. Effects of the DST on triglyceride, LDL-cholesterol, and HDL-cholesterol in db/db mice fed with HFHC diet. Values were expressed as mean ± S.E. (n=10). **p < 0.01 vs. W.T.; #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. db/db. 투여한군은감소된 ACh에대한혈관이완반응을유의성있게개선시켰다 (Fig. 5A).NO donor인 SNP에대한혈관이완반응역시, db/db 마우스에 124
이윤정외 8 인 : 도인승기탕에의한당뇨병성혈관장애개선효과 Lee et al., Therapeutic Effect of Doinseunggi-tang on Diabetic Vascular Dysfunction 로제 II 형당뇨모델인 db/db 마우스에서도인승 기탕에의한혈관이완개선효과를확인하였으며, 이는 NO 의존적인것으로나타났다. Fig. 4. Effect of the DST on urine creatinine, and creatinine clearance level of db/db mice fed with HFHC diet. Values were expressed as mean ± S.E. (n=10). **p < 0.01 vs. W.T.; #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. db/db. 고지방식이를실시한군과비교할때, rosiglita- zone 및도인승기탕을투여한군모두에서유의성 있는이완효과를나타내었다 (Fig. 5B). 그러므 5. 혈관의조직학적변화제 II형당뇨모델인 db/db 마우스에서도인승기탕투여에의한혈관병변억제효과를분석하기위하여흉부대동맥을적출한후, hematoxylin & eosin (H-E) staining을실시하였다. wild type 마우스에일반식이를실시한군에서는정상적인혈관형태를보이나, wild type에고지방식이를실시한군에서는혈관내막의비후도가증가하는경향을보이고있다. db/db 마우스에고지방식이를실시한군에서는혈관내막및중막의비후도가 wild type에고지방식이를실시한군과비교하였을때확연한증가현상을보이고있으며 rosiglitazone을투여한군에서는그효과가감소하는것을확인할수있었다. 도인승기탕을투여한군에서는혈관내막및중막의비후도가다소감소하는경향을보이고있으며, 내피층표면의손상정도역시 db/db 마우스에고지방식이를실시한군에비해그정도가감소함을보여주고있다 (Fig. 6). 6. 혈관염증발현마커및혈관수축인자에대한발현변화분석제 II형당뇨모델인 db/db 마우스에서도인승기탕투여에의한혈관에서의혈관염증마커의발현변화를직접적으로확인하기위하여 immun- A B Fig. 5. Effect of the DST on vascular tone in thoracic aorta of db/db mice fed with HFHC diet. Effect of an DST on ACh (A) or SNP (B)-induced relaxation in thoracic aorta of db/db mice fed with HFHC diet. Values were expressed as mean ± S.E. (n=3). *p < 0.05, **p < 0.01 vs. W.T.; #p < 0.05, ##p < 0.01 vs. db/db. 125
(2013 년 6 월 ) Ⅳ. 고찰 Wild type Rosiglitazone db/db+hfhc Doinseunggi-tang Fig. 6. Effect of the DST on thoracic aorta of db/db mice fed with HFHC diet in the morphology. Representative microscopic photographs in aorta of wild type mice with control diet and db/db mice fed with HFHC diet were stained with hematoxylin and eosin. Magnification 400. ohistochemistry 를수행하였다. 혈관염증발현억 제효과를알아보기위하여혈관유착분자인 vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) 및 intra- cellular adhesion molecule-l (ICAM-1) 발현변 화를면역화학염색법을이용하여확인하였다. 그 결과, db/db 마우스에고지방식이를실시한군 은 wild type 에고지방식이를실시한군에비해 VCAM-1 및 ICAM-1 의흉부대동맥내피단백발 현이확연히증가하였으나, 도인승기탕을함께투 여한군에서는 VCAM-1 및 ICAM-1 의발현정도 가감소하는것을확인할수있었다. 이는 rosigl- itazone 을투여했을때와유사한양상을보였다. 도인 승기탕을함께투여한군의혈압변화에따라혈관수 축인자인 ET-1 의변화를알아보고자 immunohisto- chemistry 을실시하였다. 그결과, 제 II 형당뇨모 델인 db/db 마우스에고지방식이를한군에비해도 인승기탕및 rosiglitazone 을투여한군에서 ET-1 의 발현이감소함을확인하였다 (Fig. 7). 최근제 II형당뇨는과도한식품섭취및운동부족으로인한비만에서비롯된생활습관성질환 (lifestyle disease) 으로정의되며 30), 당뇨병환자의 90% 가 Type 2형임에도불구하고 31), 혈당강하및합병증등에대한명확한치료기전은아직발표되고있지않다. 도인승기탕역시단일구성약재에대한혈행개선효능에대한연구는수행되었으나복방처방자체에대한혈당강하및혈관이완, 혈관염증등에대한효능연구는아직까지이루어지지않았다. 그러므로본연구에서는도인승기탕의 Type 2 당뇨동물모델에서의혈관기능장애에미치는영향을구명하고, 합병증예방에도영향을미칠수있음을확인하고자하였다. 이에본연구에서제 II형당뇨모델인 db/db 마우스에고지방식이를투여한결과, 현저한혈당의증가를초래하였다. 그러나도인승기탕을함께투여한군에서는고지방식이에의한혈당증가를유의성있게감소시키는것으로나타났다. 당뇨병성죽상경화의초기단계에서내피세포에서의 ICAM-1 및 VCAM-1과같은세포유착분자의발현이증가한다. 그결과로단핵구및백혈구의염증부위로의침투가증가하고이들에의한염증사이토카인의분비는혈관염증을더욱진행시킨다 32, 33). 그러므로이러한세포유착인자의발현억제는죽상경화를예방및치료할수있는좋은치료목표가될수있으며, 특히, 장기간투여로인한부작용면에서안전한천연물을이용해이들분자들의선택적인억제로죽상경화를억제시켰다는연구가최근많이보고되고있다. 본연구결과에서도인승기탕은고지방식이를실시한 db/db 마우스모델에서증가한세포유착분자인 ICAM-1 및 VCAM-1의발현을현저하게감소시켰다. 실제로어떠한동물실험이나임상에서도당뇨에의한직접적인죽상경화병변이나타난다는보고는거의없다. 그러나, 당뇨가괴사성지방핵 (necrotic lipid core) 형성에기여하는것은사실로보인다. 이는제1형당뇨환자에서 fatty streak 126
이윤정외 8 인 : 도인승기탕에의한당뇨병성혈관장애개선효과 Lee et al., Therapeutic Effect of Doinseunggi-tang on Diabetic Vascular Dysfunction Wild type db/db+hfhc Rosiglitazone Doinseunggi-tang Fig. 7. Effects of the DST on VCAM-1, ICAM-1, ET-1 immunoreactivity in aortic tissues of db/db mice fed with HFHC diet. Representative microscopic photographs in aorta of wild type mice with control diet and db/db mice fed with HFHC diet were stained with anti-vcam-1, anti-icam-1, or ET-1, respectively. Magnification 1000. 나 intima/media thickness와같은 lesion initiation이 dyslipidemia와는상관없이활발히나타난다는사실에기인한다 34, 35). 괴사성지방핵은염증반응의지속으로인해거품세포의숫자가증가하면서일부가괴사하게되고죽은세포들이머금고있던지질이배출되면서형성된다. 이러한괴사성지방핵은평활근세포의증식으로생겨나는 fibrous cap과함께죽상경화반 (atherosclerotic plaque) 을형성하게된다. 이때염증반응이지속된다면대식세포들이발현하는금속함유기질단백분해효소등을포함한각종세포외기질분해효소에의해죽상경화반이파열되면서혈관내에혈전 (thrombus) 이형성되어급성심근경색증의발병으로이어질수있다 36, 37). 그러므로당뇨병에 기인한죽상경화병변은장기간당뇨에의한혈관기능장애가지속되어죽상경화반 (atherosclerotic plaque) 형성에영향을줄것이라고추측하고있다. 본실험에서도장기적인고혈당으로인하여초기죽상경화증으로대표될수있는혈관기능장애가나타났으나중증죽상경화증을나타내지는못하였으며이는혈관장력의감소, macrophage의증가, 그리고 ICAM-1, VCAM-1, E-selectin과같은혈관내피세포내세포유착분자의발현증가등으로설명할수있다. 또한도인승기탕투여가 TG나 LDL 콜레스테롤의개선및혈당강하효과를나타내고더나아가혈관이완및항염증효과를나타내는것으로보아초기죽상경화에효과를준다고사료된다. 혈장내트레아티닌농도는 127
(2013 년 6 월 ) 유의성없이감소되었으나청소율은정상범위로회복되는것으로보아고지방식이에따른신장기능부전을도인승기탕투여가개선시키는것으로보여진다. 최근연구에서는비만쥐에서내피세포손상에의해 ACh에대한혈관이완반응성이현저히손상됨을보고하였다 38). 또한, 고지방식이는흰쥐에서인슐린저항성과체중증가를유도하고이로인해혈관내피세포가손상된다는보고가있다 39). 그러므로본연구자는고지방식이를실시한 db/db 마우스모델에서도인승기탕의투여에의한혈관이완반응성변화를검증하였다. 실험결과에서고지방식이를실시한 db/db 마우스는흉부대동맥에서 ACh에대한혈관이완반응이현저히감소하였다. 도인승기탕의투여는고지방식이를실시한 db/db 마우스의손상된혈관이완반응을현저히개선시켰다. 또한실험결과에서도인승기탕은고지방식이를실시한 db/db 마우스모델에서흉부대동맥의내피층표면이거칠어지고, 중막평활근이비후되는것을개선시켰다. 따라서도인승기탕은고지방식이를실시한 db/db 마우스에서혈관내피세포의기능적인향상이나 ACh에대한혈관이완반응성을증가시키는것으로사료되며더나아가혈관기능장애를개선시키는것으로보여진다. 이는도인승기탕이제 II형당뇨모델인 db/db 마우스모델에서혈관장력의조절에아주중요한역할을하고있는것으로보인다. Ⅴ. 결론 도인승기탕은고지방식이를실시한 db/db 마우스모델에서혈당을감소시키고혈관기능장애를개선시켰다. 즉이러한개선효과는내피세포의존적인혈관이완을통하여세포유착분자의발현감소및혈관내피세포의기능적개선을통해혈관염증을개선시키거나초기죽상경화에효과를준다고사료된다. 그러므로도인승기탕에대한 연구결과는당뇨병성혈관합병증과같은혈관질환에있어천연물을이용한새로운치료방향을제시하는데유용할것으로사료된다. 감사의글본연구는원광대학교지원 (2011) 에의하여수행되었으며이에감사드립니다. 참고문헌 1. Mandrup-Poulsen T. Diabetes. Brit Med J. 1998;316:1221-5. 2. Assmann G, Gullen P, Jossa F, Lewis B, Mancini M. Coronary heart disease: reducing the risk. The scientific background to primary and secondary prevention of coronary heart disease: a Worldwide view. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 1999;19:1819-24. 3. Reaven GM, Las A. Insulin resistance, compensatory yperinsulinemia, and coronary heart disease. Diabetologia. 1994;37:948-52. 4. Fukai T, Satoh K, Nomura T, Sakagami H. Preliminary evaluation of antinephritis and radical scavenging activities of glabridin from Glycyrrhiza glabra. Fitoterapia. 2003;74:624-9. 5. Nandita S, Rajini PS. Free radical scavenging activity of an aqueous extract of potato peel. Food Chem. 2004;85:611-6. 6. 尹吉榮. 東醫學의客觀化와東西醫學病名統一을위한方法. 서울 : 東洋醫學. 1976:7-15. 7. Zhao Z, Wang W, Guo H and Zhou D. Antidepressantlike effect of liquiritin from Glycyrrhiza uralensis in chronic variable stress induced depression model rats. Behav Brain Res. 2008; 194:108-13. 8. Fu Y, Hsieh TC, Guo J, Kunicki J, Lee MYWT, Darzymkiewicz Z, Wu J. Licochalcone-A, a novel flavonoid isolated from licorice root (Glycyrrhiza glabra), causes G2 and late-g1 128
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