Printed in the Republic of Korea ANALYTICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Vol. 21, No. 1, 34-40, 2008 LC-MS/MS 를이용한혈장중레르카니디핀의분석 장문선 1 나숙희 1 장규영 1 강승우 1, 2 한상범 2 이경률 1, 3 이희주 1, 3 1 바이오코아 ( 주 ) 신약개발지원사업부, 2 중앙대학교약학대학, 3 ( 재 ) 서울의과학연구소약물동력학팀 (2007. 10. 8. 접수. 2008. 1. 15. 승인 ) Determination of lercanidipine in human plasma by LC-MS/MS Moon-Sun Jang 1, Sookie La 1, Kyu Young Chang 1, Seung Woo Kang 1, 2, Sang Beom Han 2, Kyung Ryul Lee 1, 3 1, 3 and Hee Joo Lee 1 Drug Development Supporting Service Division, BioCore Co., Ltd., IT Mi-Rae Tower 9F #60-21, Gasan-dong, Geumcheon-gu, Seoul, 153-023, Korea 2 College of Pharmacy, ChungAng University, 221, Heukseok-dong, Dongjak-gu, Seoul, 155-756, Korea 3 Dept. of Pharmacokinetics, Seoul Medical Science Institute, Seoul Clinical Laboratory, 7-14, Dongbinggo-dong, Yongsan-gu, Seoul, 140-809, Korea (Received October 8, 2007; Accepted January 15, 2008) 요약 : LC-MS/MS를이용하여신속하고정확한혈장중레르카니디핀의분석법을개발하고이분석법에대한검증을수행하였다. 혈장에내부표준물질로사용한암로디핀을첨가한후아세토니트릴로단백질을침전시키고, 그상층액을취하여건조시킨후 50 % 아세토니트릴로재용해하여 LC-MS/MS로분석하였다. MS/MS 의 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을이용하여혈장중레르카니디핀을어떠한분석의방해물없이선택적으로검출할수있었다. 레르카니디핀의표준검량선은 0.05-20 ng/ml의농도범위에서우수한직선성 (r = 0.9994) 을보였으며, 일내, 일간재현성은변동계수 11.7 % 이하, 정확성은 94.4-114.8 % 로레르카니디핀의약물동력학적연구에적용되기에충분한감도와특이성, 직선성, 정밀성및정확성을가지고있음을확인하였다. Abstract: Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method has been developed and validated for the quantitative determination of lercanidipine in human plasma. After addition of internal standard (amlodipine), plasma was precipitated with acetonitrile and the supernatant was evaporated. The residues were dissolved in 50 % acetonitrile and analyzed by LC-MS/MS. Using MS/MS with multiple reaction monitoring (MRM) mode, lercanindipine were selectively detected without severe interference from human plasma. The standard calibration curve for lercanidipine was linear (r = 0.9994) over the concentration range 0.05-20.0 ng/ ml in human plasma. The intra- and inter-day precision over the concentration range of lercanidipine was lower than 11.7 % (correlation of variance, CV), and accuracy was between 94.4-114.8 %. This method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of lercanidipine in human plasma. Key words: lercanidipine, LC-MS/MS, pharmacokinetic study Corresponding author Phone : +82-(0)2-2027-6250 Fax : +82-(0)2-2027-6299 E-mail : heejoolee0@yahoo.co.kr 34
LC-MS/MS 를이용한혈장중레르카니디핀의분석 35 1. 서론 염산레르카니디핀 ((±)2-[(3,3-diphenylpropyl)methylamino]-1,1-dimethylethyl methyl(4rs)-2,6-dimethyl-4-(3- nitrophenyl)-1,4-dihydropyridine-3,5-dicarboxylate monohydrochloride) 은고혈압의치료에사용되는 dihydropyridine계칼슘통로차단제 (Ca 2+ -channel blocker) 이다. 1-5 레르카니디핀은매우우수한지질친화성을가지고있어칼슘통로수용체의인접지질이중층에강하게결합하여이로부터서서히방출된다. 2-7 이러한작용기전으로인해레르카니디핀은 24 시간이상의긴작용지속시간을가지며 5 또한, 다른칼슘통로차단제보다 10-1000배더큰혈관선택성 6 을가지고있어강압효과뿐만아니라단시간에작용하는 dihydropyridine 계열의칼슘통로차단제에비하여현저히낮은부작용을나타낸다. 6-9 강력한항산화작용을가지고있어죽상동맥경화증 (atherosclerosis) 에대한예방및치료효과를가지고있으며, 5,10-11 1일 1회복용으로환자의순응도를높임으로써고혈압치료에있어서많은기대를받는제3세대칼슘통로차단제이다. 2-3,5,11-12 염산레르카니디핀의라세메이트정제형태로복용된레르카니디핀은거의대부분장내에서흡수되며, 1.5 내지 3 시간후혈장내최대농도에도달하고, 소실반감기는 2-5 시간이다. 6,9 염산레르카니디핀 10, 20, 40 mg을사람에게투여하였을때, 비선형약물동력학적특성을나타내며, 20 mg 경구투여시에이미최고혈중농도에도달한다고보고되어있다. 2 지금까지보고된생체시료중의레르카니디핀의분석은주로질량분석기를이용한것으로고성능액체크로마토그래프-탠덤질량분석기 (HPLC-MS/MS), 13-15 초고성능액체크로마토그래프-탠덤질량분석기 (Ultra performance liquid chromatograph-ms/ms. UPLC-MS/ MS), 16 키랄칼럼을사용하여레르카니디핀의광학이성질체를분리한 HPLC-MS/MS 분석법 17-18 등이보고되어있다. HPLC-MS/MS를이용하여레르카니디핀및다른칼슘채널차단제를동시분석한논문의경우, 13,14 정량한계 (limit of Quantitation, LOQ) 가너무높아경구투여후 36시간까지혈중모니터링이필요한생물학적동등성시험등의임상시료를분석하는데는부적합하였다. 키랄칼럼을사용하여레르카니디핀의광학이성질체를분리한 HPLC-MS/MS 분석법의경우, 정량한계를 0.025 ng/ml까지낮추어정량하기위해, 1 ml의혈장을 50 µl로농축하고이중 20 µl를분석기기에 주입하였다. 따라서단백질침전법으로는완전히제거되지않은혈장내많은매트릭스성분들이농축된상태로칼럼에다량주입되게되어, 칼럼의오염으로인한시스템의불안정성이초래될가능성이높았다. 이온포집질량분석기 (ion-trap mass spectrometer) 를사용하여혈장중의레르카니디핀을분석한 Salem 등의논문 15 에서는, 정량한계를낮추기위하여 1 ml의혈장을사용하여 100 µl로농축하고이중 60 µl를분석기기에주입하였다. 4 단계의액체-액체추출법 (liquid-liquid extraction, LLE) 을사용하여혈장내매트릭스성분들은효과적으로제거하였으나, 전처리과정이너무복잡하여수백-수천개의생체시료분석을수행해야하는약물동력학연구의고효율분석법 (high-throughput analysis) 으로는적합하지않았다. UPLC-MS/MS의경우, 짧은분석시간과높은분리능으로최근생체시료중의약물분석에많이적용되고있으나, 아직까지는보급률이낮고사용할수있는칼럼에제한성이있어, 많은실험실에서일상적인분석법으로이용하기에는한계가있다. 따라서, 본연구에서는기존분석법의단점을개선하고, 많은실험실에서일반적으로사용할수있는레르카니디핀의생체시료분석법을개발하였다. 이분석법은이미보고된분석법에비교하여시료전처리가간단하고, 낮은정량한계를가지며, 생체시료분석법으로서의양호한특이성, 직선성, 정확성및정밀성을나타내었다. 이분석법을이용하여 36 명의건강한한국인남성에게염산레르카니디핀 20 mg을투여하고, 혈장중레르카니디핀의농도를구하여약물동력학연구에응용하였다. 2. 실험 2.1. 시약및기기염산레르카니디핀표준품은대원제약 (Seoul, Korea) 으로부터제공받았으며, 내부표준물질로사용한암로디핀은 Sigam사 (St. Louis, MO, USA) 의시판품을구입하였다. 아세토니트릴과메탄올, 물은 Fisher Scientific사 (Springfield, NJ, USA) 의 HPLC급을사용하였고, 아세트산암모늄, formic acid등의기타시약들은특급및 1급시약들을사용하였다. 본연구에사용한 HPLC 시스템으로 Waters 2795 Alliance HT (Milfold, MA, USA) 를, 탠덤질량분석기 (MS/MS) 는 Waters Quattro Micro (Milfold, MA, USA) Vol. 21, No. 1, 2008
36 장문선 나숙희 장규영 강승우 한상범 이경률 이희주 를사용하였다. HPLC 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.1 150 mm, 5 µm, San Jose, CA, USA) 을사용하였으며, 데이터처리장치로는 MassLynx (Ver. 4.1) 를사용하였다. 기타장비로는원심분리기 (Micro-12, Hanil Science Industrial Co. Ltd., Incheon, Korea), 탁상용혼합기 (Maxi MixII, Thermolyne, Dubuque, IA, USA) 및질소증발기 (MG-2100, Eyela, Tokyo, Japan) 등을사용하였다. 2.2. LC-MS/MS 조건최적화 건강한성인혈장중레르카니디핀의분석은이미보고된 LC-MS/MS 분석법들을참고하여최적의조건을확립한후수행하였다. 전처리된혈장시료는다음의조건에서정량하였다. 이동상으로는 1 mm 아세트산암모늄완충액과아세토니트릴의혼합용액 (40/60, v/v) 을사용하였으며, formic acid를전체용액에 0.1 % 가되도록첨가하였다. 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.1 150 mm, 5 µm) 을사용하였으며유속은 220 µl/min, 분석칼럼의오븐온도는 45 o C로일정하게하였다. 피크검출은 triple-quadrupole mass spectrometer를이용하여 MRM (multiple reaction monitoring) 방법으로검출하였다. 이온화는 electrospray ionization (ESI) 을이용하여 positive ion mode로분석하였으며, nebulizing gas는질소를, collision gas는아르곤가스를사용하였다. 기타최적화된 MS/MS 분석파라미터는 Table 1에요약하였다. MRM 방법을이용한레르카니디핀과내부표준물질인암로디핀의 precursor ion은각각 m/z 612와 409의수소화된분자이온 ([M+H] + ) 을사용하였으며, 생성된 product ion으로 m/z 280과 238을각각모니터링하였다. Table 1. Optimum operating mass spectrometric parameters for lercanidipine and amlodipine (IS) Parameter Value Source temperature ( o C) 120 Desolvation temperature ( o C) 350 Cone gas flow rate (L/h) 23 Desolvation gas flow rate (L/h) 1000 Transition dwell time (s) 0.5 Capillary voltage (kv) 4 Cone voltage (V) 30 (10 for IS) Collision energy voltage (ev) 20 (10 for IS) Collision gas (mbar) 4.0 10 3 2.3. 표준검량선작성및분석법검증염산레르카니디핀표준품을메탄올에녹여농도를레르카니디핀으로서 1,000 µg/ml로만들어냉장보관시키고, 이용액을냉동보관하였던공혈장으로희석하여레르카니디핀의혈장중농도가각각 0.05, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 20 ng/ml 농도가되도록표준혈장을만들었다. 또한내부표준물질인암로디핀은메탄올에녹여 1,000 µg/ml가되도록한후 50 % 아세토니트릴로희석하여 2 µg/ml가되도록제조하여 4 o C에서보관하였다. 각각의표준혈장 300 µl를 1.5 ml 튜브에넣고여기에내부표준물질용액 20 µl( 암로디핀, 2 µg/ml) 와아세토니트릴 600 µl를가하여 60 초간잘섞었다. 잘섞인시료를 13,000 rpm에서 5 분간원심분리한후, 상징액을깨끗한튜브에옮기고, 40 질소기류로완전히건조시켰다. 여기에 50 % 아세토니트릴 200 µl를가하여재용해시키고, 이중 20 µl를취하여 LC-MS/MS에주입하였다. 여기에서얻은내부표준물질의피크면적에대한레르카니디핀의피크면적비를가지고검량선을작성하였다. 하루에실험을 5 번시행하여일내재현성과정확성을구하였고, 5 일간실험을반복수행하여일간재현성과정확성을구하였다. 2.4. 혈장시료의처리및생체이용률파라미터계산 19-30세사이의건강한남자지원자 36 명에게 20 mg의염산레르카니디핀을 240 ml의물과함께경구투약하였다. 채혈시간은반감기의 3 배이상인 36 시간동안으로하였고, 채혈횟수는약물투약직전과투약후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24 및 36 시간에서채혈하여영하 70 o C에서보관하였다. 각피험자의혈장중레르카니디핀의정량을위하여, 시간별로채취하여영하 70 C에보관했던혈장시료를실온에방치하여녹인후, 3 초간진탕한다음이혈장 300 µl를취하고, 위검량선작성시와동일한방법으로처리하였다. 얻어진크로마토그램으로부터내부표준물질의피크면적에대한레르카니디핀의피크면적비를구하여미리작성한검량선으로부터혈장중레르카니디핀의농도를구하였다. 약물동력학적파리미터는 LC-MS/MS 분석방법에의하여얻은혈장중약물농도-시간곡선으로부터구하였다. 최고혈장중농도 (C max ) 와최고혈장중농도도달시간 (T max ) 은실측치로부터직접구하였고, 투약후마지막채혈시간인 36 시간까지의혈장중농도-시간곡선 Analytical Science & Technology
LC-MS/MS 를이용한혈장중레르카니디핀의분석 37 Fig. 1. Product ion mass spectra of [M+H] + ions of (A) lercanidipine and (B) amlodipine (IS). 하면적 (AUC t ) 은사다리꼴공식에의하여 BA Calc 2002 (Ver. 1.1.1, KFDA, Seoul, Korea) 프로그램을이용하여산출하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 혈장중레르카니디핀의분석법개발및검증레르카니디핀과내부표준물질인암로디핀의 product ion mass spectrum과각각의 fragment ion에대한가능한분자구조를 Fig. 1에나타내었다. 레르카니디핀은 positive ion mode에서 precursor ion으로 [M+H] +, m/z 612로검출되었으며 collision cell에서충돌에의해 ester bond가끊어져 m/z 315와 m/z 298 로분해되고, 이중 m/z 298 ion은물분자를잃어 (-H 2 O, 18 amu) m/z 280 ion을형성한다. 15 m/z 612의 fragment ion m/z 387은 N-dealkylation 반응에의해 alkylamine 부분 (-CH 3 -NH-CH 2 CH 2 CH(Ar) 2, -225 amu) 을잃어형성된것으로추정된다. 암로디핀은 positive mode에서 precursor ion으로 [M+H] +, m/z 409로검출되며 collision cell에서충돌에의해 m/z 392, 377, 294 및 238을생성한다. [M+H] + ion과 17 amu의질량차이를보이는 m/z 392는암모니아분자 (-NH 3 ) 를잃어형성되며, m/z 377은 [M+H] + ion과 32 amu 차이를보이는데이는메탄올분자 (-CH 3 OH) 를잃는경우에나타나는특징적인질량차이이다 19. m/z 238과 294의생성에대해서 Gibbons 등 19-20 은수소화된암로디핀 ion의 molecular rearrangement mechanism이나 retro-diels-alder 반응에의하여형성된다고제안하였다. 각각의 product ion scan을통해, MRM mode에서의정량을위한레르카니디핀과암로디핀의 product ion으로가장감도가큰 m/z 280과 238을각각선정하였다. 건강한성인의공혈장과공혈장에레르카니디핀과내부표준물질을함께가한것및레르카니디핀제제 20 mg을투여한후 1.5 시간후에채혈한혈장을본시험방법에따라전처리한후, LC-MS/MS로분석하여얻은크로마토그램을 Fig. 2에나타내었다. 레르카 Vol. 21, No. 1, 2008
38 장문선 나숙희 장규영 강승우 한상범 이경률 이희주 니디핀피크의유지시간은약 2.3 분, 내부표준물질암로디핀의피크의유지시간은약 1.8 분이었으며, MS/MS의높은선택성때문에분석물질에방해되는물질은나타나지않았다. 공혈장시료, 내부표준물질만가한혈장시료및 0.05, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 20 ng/ml의검량선용표준혈장시료를각각전처리한후 LC-MS/MS 로분석하였을때, 혈장시료로부터구한레르카니디핀검량선의계산식은 Y( 레르카니디핀 / 내부표준물질피크면적의비율 ) = 0.220425 ( 레르카니디핀농도, ng/ml) + 0.00186629 (r = 0.9994) 로 0.05-20 ng/ml 범위에서양호한직선성을나타내었다혈장중레르카니디핀의최저정량한계는크로마토그램상에서신호대잡음비 (S/N ratio) 를 10 이상으로하고정밀성이 20 %(CV) 이하이고, 정확성이 80-120 % 인조건을만족하는 0.05 ng/ml로하였다. 최저정량한계를포함한검량선농도범위에서레르카니디핀의일내및일간변동계수 (CV) 는 11.7 % 이하로나타났고, 정확성은 94.4-114.8 % 이었다 (Table 2). 이로부터혈장중레르카니디핀에대한본 LC-MS/MS 분석법은인체에대한생체이용률시험에이용될수있는충분한감도와특이성, 직선성, 정밀성및정확성을가지고있음을확인할수있었다. Fig. 2. Chromatograms of (A) blank human plasma, (B) blank human plasma spiked with lercanidipine (10 ng/ml) and internal standard (IS, amlodipine) and (C) plasma sample at 1.5 hr after oral administration of 20 mg lercanidipine tablets. 3.2. 분석감도비교생체시료중레르카니디핀의분석에관한많은연구에서 2000년도이전에는 HPLC에자외선검출기 (UVD) 를사용하거나, TLC-radiometer를사용하여분석하였다. 이러한고전적인방법은간섭물질과피크가겹치면정량이불가능하였으므로, 복잡한시료매트릭스에서정량할경우에는이동상의조성을조절하여최대한의분리도가유지되도록하였다. 그결과 1개의시료당분석시간이 10-20분이상이되어야분석의정확성과정밀성을확보할수있었다. 전임상또는임상시험에서의약품의생체이용률연구와약물동력학연 Table 2. Intra-day and inter-day precision and accuracy for determination of lercanidipine in human plasma (n=5) Norminal concentration (ng/ml) Intra-day Inter-day Precision (CV, %) Accuracy (%) Precision (CV, %) Accuracy (%) 0.05 3.0 114.8 6.7 111.7 0.3 9.5 101.3 10.3 94.4 3 5.5 107.8 10.6 101.2 20 6.2 98.8 11.7 97.2 Analytical Science & Technology
LC-MS/MS 를이용한혈장중레르카니디핀의분석 39 구를수행하기위해서는수백-수천개의생체시료분석이이루어져야하는데, 고전적인 HPLC-UV, TLC 방법으로분석을하기에는낮은선택성과긴분석시간으로인하여적용하기가매우어려웠다. 이를해결하기위하여 2000년대초반부터 LC-MS 또는 LC-MS/MS를이용한생체시료중의의약품분석이매우활발하게진행되었으며, 레르카니디핀또한 LC-MS, LC-MS/MS (triple quadrupole과 ion trap 방식 ) 에의한분석법이보고되었다. 이중 Kalovidouris 등 16 은 human plasma 시료 0.5 ml에서 LLE로전처리하고 LC-MS/MS (triple quadrupole) 로분석하여정량한계 0.05 ng/ml의결과를보고하였고, Salem 등 15 은 human plasma 시료 1.0 ml에서복잡한 LLE로전처리하고 ion trap 방식의 LC-MS/MS로분석하여정량한계 0.1 ng/ml를, Jabor 등 17 은 human plasma 시료 1.0 ml에서역시 LLE로전처리하고 normal phase (NP) LC-MS/MS로분석하여정량한계 0.025 ng/ml 를보고하였다. 하지만본연구에서 human plasma 시료 0.3 ml를취하였고, 전처리로는제단백 (protein precipitation, PPT) 방식을선택하여 LC-MS/MS로분석한결과, 정량한계가 0.05 ng/ml이었다. 따라서, 본분석법은전처리방법의효율성측면과시료량에대한분석감도면에서기존에보고된방법에비하여매우향상된결과를나타내었다. 3.3. 레르카니디핀제제의약물동력학적연구 36 명의건강한남성지원자에게레르카니디핀 20 mg을경구투여한후일정시간마다채혈하여얻은혈장중평균레르카니디핀의농도-시간곡선을 Fig. 3 에나타내었다. 본분석조건에의해서레르카니디핀 20 mg을경구투여한후반감기의 3배이상인 36 시 Fig. 3. Mean plasma concentrations of lercanidipine after oral administration of lercanidipine tablet (20 mg) to 36 healthy volunteers. Each point represents the mean± S.D. 간까지레르카니디핀의혈장중농도를측정할수있었다. 레르카니디핀의혈장중농도-시간곡선하면적 (AUC) 는 24.3±16.0 ng hr/ml, 최고혈장중농도 (C max ) 는 6.8±3.7 ng/ml, 최고혈장중농도도달시간 (T max ) 는 1.9±1.0 hr이었다. 외국에서보고된자료 6,9,17,21-22 에의하면, 레르카니디핀 20 mg을경구투여하였을때 C max 는 2.44-14.93 ng/ ml, AUC t 는 11.82-28.57 ng hr/ml, T max 는 1.0-3.0 hr, 그리고 t 1/2 은 2.0-5.0 hr인것으로되어있어, 본연구에서산출한약물동력학적파라미터와크게차이가없음을확인할수있었다. 4. 결론본연구에서는 LC-MS/MS를이용하여보다시료전처리가간편하고, 높은감도와짧은분석시간을갖는레르카니디핀의생체시료분석법을확립하였으며, 이분석법에대한검증 (validation) 을실시하였다. 본분석법을혈장중의레르카니디핀정량및한국인을대상으로한약물동력학연구에성공적으로적용하여약물동력학적파라미터를제시하였으며, 향후임상시험등의관련분야에도적용될수있으리라사료된다. 참고문헌 1. C. Venkata and S. Ram, Am. J. Cardiol., 89(2), 214-215 (2002). 2. L. G. Herbette, M. Vecchiarelli, A. Sartani and A. Leonardi, Blood Press Suppl., 2, 10-17(1998). 3. K. J. McClellan and B. Jarvis B, Drugs, 60(5), 1123-1140(2000). 4. M. Epstein, Heart Dis., 3(6), 398-407(2001). 5. L. M. Bang, T. M. Chapman and K. L. Goa, Drugs. 63(22), 2449-2472(2003). 6. P. A. Meredith, Expert Opin. Investig. Drugs, 8(7), 1043-1062(1999). 7.V. Barrios, C. Escobar, Á. Navarrp, L. Barrios, J. Navarro-Cid and A. Calderón, Int. J. Clin. Pract. 60(11), 1364-1370(2006). 8. A. Cherubini, F. Fabris, E. Ferrari, D. Cucinotta, I. R. Antonelli and U. Senin, Arch. Gerontol. Geriatr., 37(3), 203-212(2003). 9. S. Omboni and A. Zanchetti, J. Hypertens., 16(12 Pt 1), 1831-1838(1998). Vol. 21, No. 1, 2008
40 장문선 나숙희 장규영 강승우 한상범 이경률 이희주 10. A. Corsini, M. Bonfatti, P. Quarato, M. R. Accomazzo, M. Raiteri, A. Sartani, R. Testa, S. Nicosia, R. Paoletti and R. Fumagalli, J. Cardiovasc. Pharmacol., 28(5), 687-694(1996). 11. S. Bellosta, F. Bernini, Curr. Atheroscler. Rep., 2(1), 76-81(2000). 12. L. A. De Giorgio, F. Orlandini, P. Malasoma and A. Zappa, Curr. Ther. Res., 60(10), 511-520(1999). 13. A. B. Baranda, C. A. Mueller, R. M. Alonso, R. M. Jiménez and W. Weinmann, Ther. Drug Monit., 27(1), 44-52(2005). 14. A. B. Baranda, R. M. Alonso, R. M. Jiménez and W. Weinmann, Forensic Sci. Int., 156(1), 23-34(2006). 15. I. I. Salem, J. Idrees, J. I. Al Tamimi and P. Farina, J. Chromatogr. B, 803(2), 201-207(2004). 16. M. Kalovidouris, S. Michalea, N. Robola, M. Koutsopoulou and I. Panderi1, Rapid Commun. Mass Spectrom., 20(19), 2939-2946(2006). 17. V. A. P. Jabor, E. B. Coelho, D. R. Ifa, P. S. Bonato, N. A. G. dos Santos and V. L. Lanchote, J. Chromatogr. B, 796(2), 429-437(2003). 18. V. A. P. Jabor, E. B. Coelho and V. L Lanchote, J. Chromatogr. B, 813(1-2), 343-346(2004). 19. J. Gibbons, J. Pugh, G. Dimopoulos-Italiano and R. Pike, Rapid Commun. Mass Spectrom., 20(11), 1715-1723(2006). 20. T. Yasuda, M. Tanaka and K. Iba, J. Mass Spectrom. 31(8), 879-884(1996). 21. M. Barchielli, E.Dolfini, P. Farina, B. Leoni, G. Targa, V. Vinaccia and A. Tajana, J. Cardiovasc. Pharmacol., 29(Suppl. 2), S1-S15(1997). 22. Martindale, The complete drug reference, 32nd Eds., p. 897(1999). Analytical Science & Technology