제 5 장 벡터
벡터 (vector); 의학적의미의전달자예 ; 말라리아병원균을옮기는모기 분자생물학이나유전공학에서의벡터플라스미드나박테리오파지와같은 DNA 로서, 세포형질전환을통해특정유전자나 DNA 를자신에삽입시켜재조합 DNA 를만든후, 이것을숙주세포로전달하여많은수로복제될수있도록하거나또는단백질로발현될수있도록하는 DNA 운반체 클로닝벡터 (cloning vector) 재조합 DNA 제작이나염기서열결정과같은목적으로순수 DNA 를증식시켜분리및정제를필요로할때사용되는벡터 발현벡터 (expression vector) 특정유전자를숙주세포안으로도입한다음, 이유전자에의해암호화되어있는단백질을숙주세포의전사와번역기구에의해생성하는목적으로이용
그림 5.1 대장균과플라스미드벡터.
그림 5.2 pbluescript 벡터롤본박테리아플라스미드 DNA 구성.
pbr322; 최초로개발 pmb1(rep); 복제원점 rop; 사본수조절 - 세포하나당 15-20 개사본수 그림 5.3 플라스미드벡터 pbr322 의구조.
puc18; lacz(β-galactosidase) 에제한효소자리가있어서유전자삽입비활성화에의한색선발방법으로형질전환체선발세포하나당 500-700 개높은사본수 puc118; 단일가닥의생성을위해 M13 파지의복제원점포함 그림 5.4 플라스미드벡터 puc18 과 puc118 의구조.
박테리오파지벡터박테리오파지 ; 대장균에기생하는바이러스유전체라이브러리나 cdna 라이브러리제작및생물유전체염기서열결정등의연구를위한클로닝벡터로사용 박테리오파지 λ 벡터 48.5 kb DNA 선형으로된이중가닥 DNA 생활사 ; 감염, 복제, 조립 ( 또는성숙 ), 방출 그림 5.5 박테리오파지 λ 의모식도.
용균성주기 (lytic cycle) 박테리아숙주세포를파괴하는파지의생활사 용원성주기 (lysogenic cycle) 감염과복제및파지입자조립후즉시박테리아를파괴하는대신자신의 DNA 를박테리아의 DNA 에삽입시켜프로파지 (prophage) 의형태로숙주 DNA 와함께복제되면서증식하는생활사 박테리아세포층 (bacterial lawn) 에서용균회로에의해숙주세포를파괴함으로써생기는투명한부분 ; 용균반 (plaque) 그림 5.6 잠재성파지 (temperate phage) 인박테리오파지 λ 의생활사.
그림 5.7 단일균주조립및이중균주조립체계.
생체외조립 (in vitro packaging) 시험관내에서 λ 파지입자로조립하는과정 그림 5.8 생체외조립과정.
박테리오파지 λ 벡터 DNA 를클로닝하고증폭하기위한벡터로서박테리오파지 λ 를이용하기위해용원성주기가아니라용균성주기를가지도록함파지 λ DNA 에서용원성주기에해당되는부분제거중앙의큰 DNA 절편 ; 비필수지역 (stuffer region) 그림 5.9 박테리오파지 λ 에감염된대장균의용해와용균반.
삽입벡터 ; 10 kb 정도의크기의 DNA 까지삽입가능 cdna 클로닝과발현라이브러리제조사용치환벡터 ; 23 kb 까지의외부 DNA 삽입이가능하므로유전체 DNA 클로닝에이용 그림 5.10 삽입벡터 (A) 와치환벡터 (B) 로의외부 DNA 클로닝모식도.
그림 5.11 박테리오파지 λ 벡터로의 DNA 클로닝모식도.
그림 5.12 λ gt11 벡터의구조.
그림 5.13 λ ZAP 벡터의구조와생체내절단 (in vivo excision) 에의한파지미드벡터로의전환.
λ FIX 벡터 ; 치환벡터 20 kb 정도의큰크기의 DNA 를삽입유전체라이브러리제작에사용 Spi 표현형을이용한선발 (Spi selection) Spi(sensitive to P2 inhibition) 선발 ; 활성을가지는 red 와 gam 유전자를가지는비재조합파지는 XL-1 Blue MRA(P2) 와같이 P2 프로파지를가지고있는박테리아숙주세포에서증식할수없는원리 그림 5.14 λ FIX 벡터의구조와 DNA 삽입과정.
그림 5.15 λ EMBL3 벡터의구조.
박테리오파지 M13 벡터 6,400 bp 길이의단일가닥 DNA 를가지고있는선형박테리오파지단일가닥의특성으로위치지정돌연변이, 사슬종결법에의한염기서열결정과가닥특이탐침의주형으로사용일부외피단백질이다른단백질과융합된형태로발현될수있어파지디스플레이법사용최대 1,500 bp 크기까지의단편만을삽입할수밖에없는단점 그림 5.16 박테리오파지 M13 의구조와 DNA.
그림 5.17 감염된박테리아내에서의박테리오파지 M13 의복제과정.
코스미드벡터코스미드 (cosmid) 벡터는박테리아플라스미드와박테리오파지 λ DNA 가혼성된벡터플라스미드의자가복제능력및항생제저항유전자와파지입자로의조립에필요한파지 cos 자리를혼합시킨벡터 λ 파지유전자의일부만가지므로용균성주기 (lytic cycle) 를가지지못하므로파지로번식하지못함플라스미드복제원점과항생제저항성유전자가있으므로플라스미드처럼증식이가능하며삽입체의평균크기는 45 kb 정도 그림 5.18 전형적인코스미드벡터의구조 (A) 와코스미드벡터로의클로닝모식도 (B).
박테리아인공염색체 (BAC) 박테리아인공염색체 (Bacterial artificial chromosome); 대장균의 F 인자 (fertility factor, 수정인자 ) 에근거한합성벡터 F 인자 ; 적은사본수 ( 세포당 1-2 개 ) 를가지며세포분열중에딸세포로정확히나누어들어가게하는유전자 (para, parb) 재조합방지, 매우큰 DNA 단편을삽입시킬수있다. 300 kb 이상의거대한 DNA 절편의클로닝가능평균 100-140 kb 그림 5.19 전형적인 BAC 벡터인 pbac10bl 의구조. para 와 parb 는세포분열중에딸세포로정확히나누어들어가게하는기능을가지며, oris 와 repe 는복제원점이며 Cm R 은클로람페니콜저항성유전자를나타낸다.
그림 5.20 BAC 벡터로거대 DNA 분자를클로닝하는과정의순서모식도. BAC 벡터에외부 DNA 를삽입하기위해서는먼저거대 DNA 를 HindIII 나 EcoRI 같은제한효소로부분절단한후, 전기영동을통해적정한크기 (100-300 kb) 의 DNA 절편을선발하고, 동일한효소에의하여절단된 BAC 벡터와결합한후, 대장균반응능세포 (competent cell) 로도입 ( 형질전환 ) 하여증식한다.
효모벡터진핵생물에적합한벡터고안 RNA 가공, 글리코실화 (glycosylation), 인산화, 아세틸화, 아실화등단백질변형효모 (Sacaromyces cerevisiae) 2 μm 원형 ; 6 kb 의크기에약 70-200 사본수 그림 5.21 효모 2 μm 원형의구조. ori 는복제원점이며, rep1 과 rep2 는세포분열동안복제된플라스미드를딸세포로균등하게나누어들어가게하며, flp 는 DNA 재조합과관련된유전자이다.
YEP 벡터효모에피솜플라스미드 (yeast episomal plasmid); 독립적인플라스미드로서복제할수있으며, 효모염색체중하나로삽입이일어날수있다. -2 μm 원형의복제원점인 ori 뿐만아니라 pbr322 의복제원점인 ORI 를포함하므로효모와대장균모두에서복제가가능 - 항생제저항성선발유전자는대장균에서선발가능하며영양소합성유전자인선발표지자는효모에서선발가능 His3, Leu2, Ura3 등 - 제한효소부위집단 (multiple Cloning site) 을가지고있어원하는유전자를삽입 그림 5.22 효모의대표적인클로닝벡터인 YEP24 의구조.
그림 5.23 Leu2 표지자와효모형질전환체의선발.
YIP(yeast integrative plasmid); 효모삽입플라스미드로 Amp 와 Tet 등의박테리아선택표지자와 Ura3 과효모의선택표지자를가지고있으며, 또한제한부위를포함. 그러나 2 μm 원형을포함하지않으므로플라스미드로서자유롭게복제할수없고다만효모의염색체에삽입되어복제된다. YRP(yeast replicative plasmid); 효모복제플라스미드로서복제원점인 ARS (autonomously replicating sequence) 부위가포함된벡터로써독립적인플라스미드형태로복제및번식이가능한벡터 YCP(yeast centromere plasmid); 효모동원체플라스미드로 YRP 벡터에효모의동원체부위 (CEN) 가포함된벡터 그림 5.24 YIP(A) 과 YRP(B) 의구조.
그림 5.25 대표적인 YAC 인 pyac3 의구조.
효모인공염색체 (Yeast Artificial Chromosome, YAC) YAC 는플라스미드 pbr322 에효모염색체의필수부위를포함시킨벡터로서효모에삽입되었을때염색체처럼활동하므로수백 kb 의삽입체를클로닝할수있다. 동원체 (centromere) 와말단체 (telomere) 를가지는것이특징 - 복제원점을가진다 (ori). - 동원체부위의 DNA 를가진다 (CEN4). - 말단체를가진다 (TEL). - 영양소합성유전자를선발표지자로가진다 (TRP1, URA3). -DNA 삽입선택표지자인 Sup4 를가진다. 삽입체존재시효모콜로니가흰색으로, 비재조합체는붉은색을띈다.
그림 5.26 YAC 벡터로의 DNA 클로닝과정.