연 / 구 / 실 / 탐 / 방 동국대학교약학대학분자신경유전학연구실 고혁완 동국대학교약학대학 E-mail: kohw@dongguk.edu 연구실개요분자신경유전학 (MNG) 연구실은동국대학교약학대학소속으로원발섬모 (primary cilia) 를기반으로일어나는헷지혹 (Hedgehog) 신호전달에대한연구및섬모의구조적, 기능적이상으로발병하는섬모질환 (Ciliopathy) 에대한연구를진행하고있다. 대부분의생명체에서는다양하고복잡한신호전달경로가존재하며신호전달계들의복합적인상호작용에의해생명체들은환경의변화에반응하고적절한생리작용을할수있게된다. 척추동물에서관찰되는섬모는세포주기상휴지기상태대부분의조직세포에서단일구조로서세포막에서돌출되어있는안테나형태의세포소기관으로존재한다. 최근연구결과에의해서섬모는세포외부환경에서유입되는자극을받아들이고세포내주요신호를처리하는신호전달센터로작용한다는사실이밝혀졌다. 따라서섬모의정상적인구조와기능을유지하는것은수많은세포내신호를조절하는데필수적이다. 그중에서가장잘알려진예는헷지혹신호전달계이다. 헷지혹은발생과정에서는장기형성및몸체패턴화그리고성체에서는조직세포항상성유지에중요하다. 섬모세포소기관과헷지혹신호전달의밀접한연관성은섬모의구조적기능적이상에의해서헷지혹신호전달이상을유발하고그결과로장기형성및다양한생체기능이상이나타나는선천성유전질환을유발한다. 따라서섬모의구조와신호처리기능에관한연 구는섬모내주요신호전달이상과섬모질환의병리적특성을이해하고치료하는데중요하다. 이와동시에최근의연구결과에따르면발생과정이후성체에서과도한헷지혹신호전달활성이암을유발한다는연구결과들이급증하고있어서발암과정에서의섬모의역할에대한연구의중요성도더욱크게부각되고있다. 본연구실에서는섬모의구조적기능적조절에필요한섬모유전자를발굴하고질병동물모델을제작하여이유전자의섬모내에서의기능을분자수준부터개체수준에걸쳐서규명하고궁극적으로섬모질환의병인을분자적수준에서규명하고자한다. 또한헷지혹신호전달교란에의해발생하는암의새로운항암제를개발하기위해저분자화합물및천연물을이용한스크리닝을통해신약후보물질을발굴하고자한다. 연구배경및연구내용 1. 섬모세포소기관은세포주기동안에염색체이동에중요한역할을하는중심체를기반으로, tubulin 복합체인미세소관 (microtubule) 로이루어진 axoneme이라는내부구조가막으로둘러싸여져있는세포소기관이다. 세포주기동안특히 G0/G1기에일시적으로세포막에형성된다 ( 그림1). 섬모세포소기관은미세소관이 9+2 형태로구성되어있는 01 분자세포생물학뉴스레터
molecular and cellular Biology Newsletter 1. 섬모세포소기관형성섬모는세포주기에서 G0 에진입할때생성되기시작함. 먼저 mother centriole 이 distal appendage 를통하여세포막에안착하고난후에 tubulin 중합작용에의해서생성되는미세소관인 axoneme 이성장과다양한섬모구조단백질과막성분이 vesicle 형태로중심립측면에서유입되면서섬모와섬모막이점차적으로성장하면서섬모가커지게됨. Garcia-Gonzalo FR and Reiter JF (2012) J Cell Biol. 논문 Figure 1 을참고해서수정함 운동성섬모와 9+0로이루어진비운동성섬모가존재한다. 운동성섬모는체액의순환을유발하는조직인호흡기기관지세포, 뇌실세포등에일부존재하고 200-300여개의섬모가각각의단일세포에존재한다. 반면에대부분의척추동물의세포는하나의단일섬모가존재하는비운동성섬모형태를띄고있고이는진화적으로보았을때운동성이있는편모의퇴화된세포소기관으로여겨졌고그기능이불명확했었다. 하지만최근일련의염색체염기서열변이를유발하는 ENU mutagenesis genetic screening을통해서생쥐의척수신경관발생과정에서운동신경세포가정상적으로생성되지않는돌연변이마우스가동정이되었고이마우스에서헷지혹신호전달이제대로이루어지지않음에의해서이런현상이발생한다고밝혀졌다. 놀랍게도헷지혹신호전달감소원인은섬모형성에필요한운동성수송단백질중의하나인 IFT88 또는 KIF3A의돌연변이에의해서섬모가짧아지거나생성되지않음에의해서일어난다는사실을보고하게 되었다. 이는미지의섬모가척추동물발생에중요한역할을한다는섬모기능에관한최초의연구결과이다. 후속연구를통하여척추동물에서섬모세포소기관은무척추동물의헷지혹신호전달과정에서신호전달단백질들을모으는 scaffold protein으로중요하게작용하는 costal2의기능을대신해일어나는신호처리센터일것으로추측되었고이후섬모유전자돌연변이생쥐연구를통하여척추동물의발생에서많은역할을하는헷지혹신호전달이섬모소기관에서일어난다는사실이검증이되었다. 추가적으로세포증식이나분화에많은기여를하며조직의항상성유지에중요한기능을하는 Wnt, mtor, PDGF, Notch 신호전달이섬모를경유해서일어난다는사실이밝혀졌다. 그뿐만아니라세포내에서신호전달에관여하는신호전달단백질과 G protein coupled receptor(gpcr), 사이토카인, 호르몬수용체가섬모에위치한다는연구결과들이보고가되면서섬모는세포내신호전달조절의중추기관으로부상하게되었다. 웹진 2015 ㅣ 2 02
연 / 구 / 실 / 탐 / 방 섬모가형성되는과정을요약하면다양한신호전달계가일어나는센터인섬모는크게 ciliary tip, axoneme, transition zone, basal body로이루어져있다 ( 그림1). 세포주기중 G0기에 mother/daughter centriole이세포막으로이동하고 mother centriole에서형성되는 distal appendage를통해세포막에고정이되면서안착을하게된다. 세포막에안착을하면서섬모의 axoneme과섬모막을구성하는인지질을함유한소포 (vesicle) 과구성단백질들이섬모로모이면서미세소관중합작용과섬모막이형성되면서섬모가만들어지게된다. 현재까지섬모세포소기관을형성하는데관여하는유전자는게놈상에 800-1,000여개로알려져있고각각의유전자의기능이상은섬모질환을유발한다. 본연구실에서는이렇게많은유전자가관여하는섬모세포소기관의구조적 / 기능적측면에서각섬모유전자들의특정한역할을규명하는연구를진행중에있다 발병에헷지혹신호전달과다활성에의해서일어난다고많이알려져있다 ( 그림 2). 참고로헷지혹유래암종을치료하는약물로서 Smo 수용체와섬모의기능을조절하는항암제개발이활발하게진행이되고있는데 1세대약물로서 Smo 의기능을억제하는 Vismodegib이라는약물이개발되었다. 이약물은피부기저세포암에탁월한효능을보이는것으로보고가되었으나최근점진적으로저항성을보이는암이증가하고있는추세이다. 본실험실에서는 Vismodegib 저항성암과헷지혹신호전달하위단계에서암발생을억제할수있는신규항암제를섬모기반신호전달을바탕으로약물스크리닝을통해개발하고있다. 2. 섬모세포소기관에서일어나는대표적인신호전달인헷지혹신호전달을세포수준에서설명하면척추동물에서는헷지혹리간드와 Ptch1 수용체의결합이신호전달을유발한다. 헷지혹이 Ptch1에결합하지않을때는 Ptch1 수용체가섬모에위치하며 GPCR 계열인 Smo 의활성을막고있어하위신호전달체계가비활성화상태가된다. 헷지혹이분비되어 Ptch1 수용체와결합하면 Smo 수용체가활성화되고섬모로이동하게된다. 섬모에위치한 Smo는섬모말단 (ciliary tip) 에서전사억제인자인 Sufu의활성을억제함으로써헷지혹신호작용타겟유전자를발현하게해주는 Gli 전사인자를활성화하게된다. 섬모의말단부에서 Gli 전사인자의활성화처리를통해세포핵에서타겟유전자의발현에영향을주고섬모가생성이잘안되거나길이변화또는구조적이상이생기면 Gli 전사인자의활성화과정또한잘일어나지않게된다. 섬모에서일어나는대표적인헷지혹신호전달은동물발생과조직항상성조절에중요한역할을하는세포내신호중하나로써알려져있으며기저세포암 (Basal cell carcinoma), 뇌암 (Medulloblastoma) 같은암 2. 섬모를경유해서유입되는대표적인세포내신호전달계는 Hh, Wnt, PDGF 신호전달이있음. 섬모막또는섬모말단부에신호전달단백질들이진입하고위치하면서활성화과정을통하여세포내핵으로외부신호가입력이되는과정을보여줌. Irigoin F and Badano JL (2011) Current Genomics 논문 Figure 3 을참고해서수정함. 03 분자세포생물학뉴스레터
molecular and cellular Biology Newsletter 3. 섬모질환은대표적인희귀유전질환으로서섬모세포소기관의구조적기능적이상에의해서발생하는질병을의미한다. 대표적인섬모질환으로 Bardet-Biedl syndrome, Joubert syndrome, Alström syndrome, Nephronophthisis Meckel syndrome, Oral-facialdigit syndrome을포함해서현재까지 70여개의유전자이상이인체에서발견되었다. 섬모질환들의임상적특징들은역위증 (situs inversus), 다낭신장 (Polycystic kidney), 다지증 (Polydactyly), 뇌량형성부전 (Agenesis of corpus callosum), 정신지체 (Mental retardation), 수뇌증 (Hydrocephalus), 시신경퇴화 (Retinal degeneration), 비만 (Obesity), 간섬유화 (Liver fibrosis) 등다양한장기에구조적기능적이상이발생하는증후들이다양한형태로발병된다. 그러나이렇게다양한섬모질환과관련한체계적인임상적특성분류와각각의원인유전자에의한구체적인분자적병인기전연구는미흡한상황이다. 본연구실에서는섬모길이를조절하는다양한마우스동물모델을통해섬모질환의분자유전학적인원인과증상, 병리학적인상관관계에대해연구를진행하며최근선천성유전질환으로알려진 ECO 증후군 (Endocrine-Cerebro-Osteodyplasia syndrome) 의발병원인을규명하였다. ECO 증후군원인유전자인 ICK의질병유발기전을규명하기위하여연구를진행하던중 ICK 유전자가원생생물에서부터고등생물에이르기까지진화적으로잘보존이되어있다는사실을알게되었다. 그리고녹조류원생생물인클라미도모나스에서 ICK 유사유전자가클라미도모나스편모생성에중요하게작용한다는선행연구보고에착안하여인체에서도 ICK 유전자가대부분의인체세포에존재하는편모유사세포소기관인섬모의생성과기능이상을유발할가능성에대하여연구를진행하게되었다. 먼저배양한세포에 ICK 유전자를과다발현했을때섬모의길이가짧아지거나만들어지지않았고이와반대로 ICK 유전자의효소활성을제거했을때섬모의길이가반대로길어진다는사실을밝히게되었다. 이결과를통하여 ICK 유전자의기능이세포내섬모의길이를적절하게조절하는기능을담당할가능성을밝히게되었다. 이결과를토대로 ICK 유전자의섬모길이조절기능이 ECO 증후군을유발하는지를알아보기위하여 ICK 유전자가제거된마우스동물모델을제작하여발생과정이상을분석한결과 ICK 유전자적중마우스에서 ECO 증후군과동일한수뇌증, 다지증, 구순열과같은발생이상증후군을관찰하게되었다. 이를통하여 ICK 유전자적중마우 3. ICK 유전자결손마우스동물모델에서의표현형분석및섬모길이조절희귀유전질환인 ECO 증후군을유발하는 ICK 유전자를제거한 ICKtm1a KO 마우스에서섬모질환에서관찰되는병리적인특징이관찰되고궁극적으로섬모길이이상에의한발생과정에서의장기형성이상이병인으로작용함을보여주는예. 이는병인이불명확한 ECO 증후군도섬모형성이상에의한섬모질환임을의미함. Moon et al. (2014) Proc Natl Acad Sci 논문 Figure 1 과 3 을참고해서수정함 웹진 2015 ㅣ 2 04
연 / 구 / 실 / 탐 / 방 스가 ECO 증후군을연구하는데적절한질환동물모델임을입증하였다. 최근에발달장애, 감각계기능이상, 줄기세포유지, 비만및암발생과같은다양한세포기능에관여한다는사실이밝혀지면서많은관심을받고있는세포소기관인섬모가다양한세포내신호전달을조절한다는사실로부터 ECO 증후군의발병기전을질환동물모델인 ICK 유전자적중마우스에서규명하기위하여섬모의기능과장기발생신호의영향을관찰한결과 ICK 유전자결손에의한비정상적인섬모의크기가생체내중요한세포내신호인헷지혹신호전달을감소시킨다는사실을밝혀내게되었다. 그리고 ECO 증후군을유발하는동일한 ICK 유전자염기서열변화가섬모의길이를크게하고헷지혹신호전달을감소시킨다는사실도입증하였다. 이연구는 ICK 유전자의기능이진화적으로잘보존이되어있고인체발생과정중에서헷지혹신호전달조절을통한다양한장기발생에관여한다는사실을밝히게되었다. 최종적으로 ECO 증후군원인이 ICK 유전자활성감소에의한섬모의기능저하가원인임을규명하게되었다. 이는병인이불분명했던선천성유전질환인 ECO syndrome이섬모형성이상에의한섬모질환임을최초로규명하였다. 본실험실에서는섬모를구성하는단백질들의기능및역할에대해동물모델마우스를제작하여규명하고좀더나아가다양한신호전달에어떠한영향을미치는지연구를진행하고있다. 이러한연구는섬모의결함으로생기는희귀유전질환에대한병인을제공해줄수도있으며다양한신호전달의문제로일어나는질병에대한치료에도움을줄수있다. [ ] 1. Moon H. *, Song J. *, Shin J.O., Lee H., Kim H.K., Eggenschwiler J.T., Bok J. and Ko H.W. (2014) Intestinal cell kinase, a protein associated with endocrine-cerebro-osteodysplasia syndrome, is a key regulator of cilia length and Hedgehog signaling. Proc. Natl. Acad. Sci., 111:8541-6. 2. Han Y.M., Kang G.M., Byun K., Ko H.W., Kim J., Shin M.S., Kim H.K., Gil S.Y., Yu J.H., Lee B., Kim M.S. (2014) Leptin-promoted cilia assembly is critical for normal energy balance. J Clin Invest, 124:2193-7. 3. Bao C., Namgung H., Lee J., Park H.C., Ko J., Moon H., Ko H.W., Lee H.J. (2014) Daidzein Suppresses Tumor Necrosis Factor-α Induced Migration and Invasion by Inhibiting Hedgehog/ Gli1 Signaling in Human Breast Cancer Cells. J Agric Food Chem, 62:3759-67 4. Kim Y.K., Kim J.H., Yu Y.S., Ko H.W., Kim J.H. (2013) Localization of primary cilia in mouse retina. Acta Histochem, 115:789-94 5. Ko H.W. (2012) The primary cilium as a multiple cellular signaling scaffold in development and disease. BMB Rep, 45:427-32 6. Chiu J.C., Ko H.W., Edery I. (2011) NEMO/NLK phosphorylates PERIOD to initiate a time-delay phosphorylation circuit that sets circadian clock speed. Cell, 145:357-370 7. Qin J., Lin Y., Norman R.X., Ko H.W., Eggenschwiler J.T. (2011) Intraflagellar transport protein 122 antagonizes Sonic Hedgehog signaling and controls ciliary localization of pathway components. Proc. Natl. Acad. Sci., 108:1456-1461 8. Ko H.W. *, Kim E.Y. *, Chiu J.C., Vanselow J.T., Kramer A., Edery I. (2010) A hierarchical phosphorylation cascade involving prolinemediated kinases and GSK3-β/SGG regulates the timing of PERIOD nuclear entry. J. Neurosci., 30:12664-12675 (*co-first author) 9. Ko H.W., Norman R.X., Tran J., Poole K.P., Fukuda M., Eggenschwiler J.T. (2010) Broadminded links cell cycle-related kinase to cilia assembly and Hedgehog signal transduction. Dev. Cell, 18:237-247 05 분자세포생물학뉴스레터
molecular and cellular Biology Newsletter 10. Ko H.W., Liu A., and Eggenschwiler J.T. (2009) Analysis of Hedgehog signaling in mouse intraflagellar transport mutants. Methods Cell Biol., 93:347-369 11. Norman R.X., Ko H.W., Huang V., Eun C.M., Naggert J.K., Abler L.L., Zhang Z., Sun X., Eggenschwiler J.T. (2009) Tubby-like(TULP3) regulates embryonic patterning in the mouse through inhibition of Hedgehog signaling. Hum. Mol. Genet., 18:1740-1754 12. Low K.H., Lim C., Ko H.W., Edery I. (2008) Natural variation in the splice site strength of a clock gene and species-specific thermal adaptation. Neuron, 60:1054-1067 13. Cho A., Ko H.W., Eggenschwiler J.T. (2008) FKBP8 cell-autonomously controls neural tube patterning through a Gli2- and Kif3a-dependent mechanism. Dev Biol., 321:27-39 14. Kim E.Y.*, Ko H.W.*, Yu W., Hardin P.E., Edery I. (2007) A DOUBLETIME kinase binding domain on the Drosophila PERIOD protein is essential for its hyperphosphorylation, transcriptional repression, and circadian clock function, Mol Cell Biol., 27:5014-5028 (*co-first author) 15. Ko H.W., Jiang J., and Edery I. (2002) Role for Slimb in the degradation of Drosophila Period protein phosphorylated by Doubletime, Nature, 420:673-678 저 자 약 력 고혁완 1989 1996 연세대학교이과대학생화학과, 학사 1998 2004 미국뉴저지주립대 (Rutgers University) 신경과학, 박사 2005 2009 프린스턴대, 박사후연구원 2010 2012 경희대학교신경퇴화제어연구센터, 조교수 2012 현재동국대학교약학대학, 조교수 연 구 진 구 성 박사과정 석사과정 송지은, 이한규 이수진, 이나영, 정주현 웹진 2015 ㅣ 2 06