(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2013-0123080 (43) 공개일자 2013년11월12일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 31/728 (2006.01) A61K 47/48 (2006.01) A61P 29/00 (2006.01) A61P 31/04 (2006.01) (21) 출원번호 10-2012-0046219 (22) 출원일자 2012 년 05 월 02 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 16 항 2012 년 05 월 02 일 (71) 출원인 주식회사제네웰 경기도성남시중원구사기막골로 62 번길 37, 스타타워 6 층 ( 상대원동 ) (72) 발명자 이영우 경기도용인시수지구신봉동 LG 신봉자이 1 차아파트 113 동 1901 호 장지연 경기도성남시수정구신흥 3 동 2534-1 블루힐하우스 A 동 602 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 (54) 발명의명칭히알루론산에폭사이드가교체및그제조방법 (57) 요약 특허법인충현 본발명은히알루론산에폭사이드가교체에관한것으로서, 보다상세하게는히알루론산에폭사이드가교체에천연히알루론산을혼합하여, 조성에따라점탄성과같은유변학적특성과분해기간을용이하게조절하고생체조직에대한부착성을향상시킬수있는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체에관한것이다. 본발명의천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체는우수한생체적합성, 생분해성, 물리적안정성등을가지고있어치과용충전제, 정형외과용보조제, 성형외과용필러, 유착방지제, 세포지지체또는약물전달체등다양한용도로사용될수있다. 대표도 - 도 1a - 1 -
(72) 발명자 임세환 서울특별시동작구사당동 1009-23 301 호 조완진 경기도부천시원미구중 1 동무지개마을아파트 1212 동 1204 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체. 청구항 2 제1항에있어서, 상기히알루론산은히알루론산, 히알루론산염, 또는히알루론산과히알루론산염의혼합물인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체. 청구항 3 제2항에있어서, 상기히알루로산염은히알루론산나트륨, 히알루론산칼륨, 히알루론산칼슘, 히알루론산마그네슘, 히알루론산아연, 히알루론산코발트및히알루론산테트라부틸암모늄으로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체. 청구항 4 제1항에있어서, 항균또는함염증성천연물질을더욱포함하는것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체. 청구항 5 제4항에있어서, 항균또는함염증성천연물질은로즈마리, 정향, 백자인, 강황, 녹차, 검정콩종피, 장미꽃잎, 작약근, 도라지, 콩나물, 유색보리종피, 동백꽃잎, 메밀, 자몽, 감초, 황련, 황기, 황백, 황금, 계피, 목초, 복분자, 오배자, 향나무, 개나리, 고추잎, 박하, 뱀딸기, 뽕나무, 삼백초, 소나무, 약쑥, 어성초, 왕벚꽃나무, 조릿대및양대줄기추출물로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체. 청구항 6 제1항의천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체를함유하는치과용충전제, 정형외과용보조제, 성형외과용필러, 유착방지제, 세포지지체또는약물전달체. 청구항 7 (i) 히알루론산또는히알루론산염을알칼리수용액에용해시키는단계 ; (ii) 상기히알루론산또는히알루론산염용액에에폭사이드가교제를첨가하여가교반응시키는단계 ; (iii) 상기가교반응물을수회세척하여미반응물을제거하는단계 ; (iv) 상기세척된생성물을분쇄하여입자크기를조절하는단계 ; 및 (v) 천연히알루론산을첨가하여혼합하는단계 ; 를포함하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 8 제7항에있어서, 상기히알루론산에폭사이드가교체는비드젤, 스펀지, 분말, 멤브레인또는시트의형태로제조되는것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 9 제7항에있어서, 상기에폭사이드가교제는 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1,6-헥산디올디글리시딜에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르 (poly(propylene glycol)diglycidyl - 3 -
ether), 폴리테트라메틸글리콜디글리시딜에테르 (poly(tetramethylene glycol)diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르 (glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르 (trimethylpropane polyglycidyl ether), 1,2-( 비스 (2,3-에폭시프로폭시) 에틸렌 (1,2-(bis(2,3- epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨폴리글리시딜에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 또는소르비톨폴리글리시딜에테르 (sorbitol polyglycidyl ether) 중에서선택된 1종이상인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 10 제7항에있어서, 상기히알루론산에폭사이드가교체의가교밀도가 1 mol% 내지 100 mol% 인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 11 제7항에있어서, 상기히알루론산에폭사이드가교체의최종반응농도는 0.05 mg/ml 내지 50 mg/ml인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 12 제7항에있어서, 천연히알루론산의농도는히알루론산에폭사이드가교체의최종반응농도대비 0.01% 내지 80% 인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 13 제7항에있어서, 상기단계 (ii) 에서히알루론산또는히알루론산염용액에히알루론산과에테르공유결합을형성할수있는고분자를부가하여에폭사이드가교제에의하여반응시킴으로써히알루론산에폭사이드유도체를얻는것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 14 제13항에있어서, 상기히알루론산과에테르공유결합을형성할수있는고분자는콜라겐, 알긴산, 헤파린, 젤라틴, 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 더마탄설페이트및케라탄설페이트로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 15 제13항에있어서, 상기히알루론산과에테르공유결합을형성할수있는고분자는폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌옥사이드, 폴리비닐알콜, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리프로필렌옥사이드공중합체, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리락틱산공중합체, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리락틱글리콜산공중합체, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리카프로락톤공중합체, 폴리부틸렌옥사이드, 폴리옥시에틸렌알킬에테르류, 폴리옥시-에틸렌케스터오일유도체류, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스터류및폴리옥시에틸렌스테아레이트류로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 청구항 16 제7항에있어서, 상기에폭사이드가교제의중량비는히알루론산의반복단위 100 중량부에대하여 1 내지 100 중량부인것임을특징으로하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법. 명세서 [0001] 기술분야본발명은히알루론산에폭사이드가교체및그제조방법에관한것으로, 보다상세하게는히알루론산에폭사이드가교체에천연히알루론산을혼합하여, 조성에따라점탄성과같은유변학적특성과분해기간을용이하게조절하고생체조직에대한부착성을향상시킬수있는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교 - 4 -
체및그제조방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] 배경기술히알루론산은 N-아세틸-글루코사민과 D-글루쿠론산으로구성된반복단위가선형으로연결되어있는다당류의일종으로서생체고분자물질이며, 동물의안구를채우고있는액체에서처음으로분리된 [Meyer K. et al., Journal of Biology and Chemistry 107 629-34 (1934)] 이래, 동물의태반, 관절의윤활액 (synovial fluid), 늑막액 (pleural fluid), 피부, 수탉의벼슬등에많이존재하는것으로알려져있고, Streptococcus 속미생물 Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemecus 등에서도생산된다. 히알루론산은생체적합성이우수하고용액상태에서높은점탄성의특성으로화장품첨가제등의화장품용도뿐만아니라안과용수술보조제, 관절기능개선제, 약물전달물질및점안제등의다양한의약용도에대해서도널리사용되고있다. 하지만, 히알루론산자체만으로는생체내 (in vivo) 또는산, 알칼리등의조건에서쉽게분해되어사용이제한적이다. 따라서구조적으로안정된히알루론산가교체를개발하기위한많은노력이진행되고있다 (Laurent, T.C., et al., Portland Press Ltd, London, 1998). 이러한히알루론산가교체는성형보조물, 수술후의유착방지제, 관절기능개선제, 약물전달체, 세포배양지지체등의다양한용도로개발되고있는바, 히알루론산가교체제조방법의하나로서, 가교제를첨가하여히알루론산을상호결합시킨히알루론산가교체는우수한생체적합성, 물리적안정성및생분해성을가지고있으며, 미국특허제4,716,154호, 4,716,224호, 4,963,666호, 5,827,937호등에그제조방법들이제시되어있다. 그러나이들특허에서의방법으로제조되는히알루론산가교체의점탄성과같은유변학적특성이나분해기간을조절하기위해서는가교체제조시반응하는히알루론산의농도와첨가되는가교제의비율자체를처음부터조절해야만한다. 또한, 일반적으로유변학적특성이나분해기간을향상시키기위해서는반응농도를증가시키거나가교제를많이첨가해야하는데, 이경우고농도로제조하기용이하지않으며다량으로첨가된가교제를정제과정에서완벽하게제거하기어렵다는문제점이있다. 발명의내용 [0006] 해결하려는과제따라서, 본발명의목적은상기종래기술의문제점을해결하여조성에따라점탄성과같은유변학적특성과분해기간을용이하게조절하고, 생체조직에대한부착성을향상시킬수있는히알루론산에폭사이드가교체및그제조방법을제공하는것이다. [0007] 과제의해결수단 본발명은히알루론산에폭사이드가교체에, 천연히알루론산을첨가하는방식으로천연히알루론산을혼합사 용함으로써천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체및그제조방법을제공한다. [0008] [0009] 발명의효과본발명을통해서히알루론산에폭사이드가교체의점탄성과같은유변학적특성, 체내안정성등을용이하게조절할수있으며, 생체조직에대한부착성및생체적합성등을개선할수있다. 또한, 본발명의천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체는우수한생체적합성, 생분해성, 물리적안정성등을가지고있어치과용충전제, 정형외과용보조제, 성형외과용필러, 세포지지체, 약물전달체등다양한용도로사용될수있다. [0010] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의시험예 1 에따라, 히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산함유유무에의한복합점 도와 tanδ 값을비교하여나타낸그래프이다. 도 2 는본발명의시험예 2 에따라, 히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산함유유무에의한부착력 (tack) 을나타낸그래프이다. 도 3 은본발명의시험예 3 에따라, 히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산의조성에따른복합점도 - 5 -
를비교하여나타낸그래프이다. 도 4는 in vivo 분해성능을평가한시험예 4의동물실험에있어서, 본발명의천연히알루론산을포함한실험군 (3종) 과천연히알루론산을함유하지않은가교체 ( 비교군1) 의분해정도를나타낸그래프이다. 도 5는골재생정도를평가한시험예 5의동물실험에있어서, 본발명의천연히알루론산이포함된히알루론산에폭사이드가교체를사용한실험군 6과천연히알루론산이포함되지않은가교체 ( 비교군 1) 및골결손부에아무런처치를하지않은대조군에서의골재생정도를나타낸사진이다. 도 6은항균성능을확인하기위한시험예 6의미생물실험에있어서, Bacillus subtillis, Escherichia coli, Candida albicans의균주에대해서항균활성을나타낸사진이다. [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체를제공한다. 이하본발명을상세하게설명한다. 구체적으로, 본발명은히알루론산을 2개이상의에폭시반응기를갖는에폭사이드가교제를이용하여히알루론산을가교화시킨가교체에천연히알루론산을첨가한것이다. 본명세서에서사용된용어 " 히알루론산 " 은히알루론산, 히알루론산염, 또는히알루론산과히알루론산염의혼합물을모두포함하는의미이다. 상기히알루론산염은히알루론산나트륨, 히알루론산칼륨, 히알루론산칼슘, 히알루론산마그네슘, 히알루론산아연, 히알루론산코발트및히알루론산테트라부틸암모늄으로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것을특징으로하며, 바람직하게는히알루론산나트륨을사용하나, 이에한정되는것은아니다. 또한, 본발명은 (i) 히알루론산또는히알루론산염을알칼리수용액에용해시키는단계 ; (ii) 상기히알루론산또는히알루론산염용액에에폭사이드가교제를첨가하여가교반응시키는단계 ; (iii) 상기가교반응물을수회세척하여미반응물을제거하는단계 ; (iv) 상기세척된생성물을분쇄하여입자크기를조절하는단계 ; 및 (v) 천연히알루론산을첨가하여혼합하는단계 ; 를포함하는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조방법을제공한다. 본발명에서사용되는에폭사이드가교제는 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르 (ethylene glycol diglycidyl ether, EGDGE), 1,6-헥산디올디글리시딜에테르 (1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르 (propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르 (poly(propylene glycol)diglycidyl ether), 폴리테트라메틸글리콜디글리시딜에테르 (poly(tetramethylene glycol)diglycidyl ether), 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르 (neopentyl glycol diglycidyl ether), 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르 (polyglycerol polyglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르 (diglycerol polyglycidyl ether), 글리세롤폴리글리시딜에테르 (glycerol polyglycidyl ether), 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르 (trimethylpropane polyglycidyl ether), 1,2-( 비스 (2,3-에폭시프로폭시) 에틸렌 (1,2-(bis(2,3- epoxypropoxy)ethylene), 펜타에리스리톨폴리글리시딜에테르 (pentaerythritol polyglycidyl ether) 또는소르비톨폴리글리시딜에테르 (sorbitol polyglycidyl ether) 중에서선택된 1종이상인것을특징으로하며, 보다바람직하게는 1,4-부탄디올디글리시딜에테르를사용하나, 이에한정되는것은아니다. 상기둘이상의에폭시작용기를포함하는가교제는히알루론산의알코올기와반응하여에테르결합을형성하여가교가이루어진다. 상기히알루론산에폭사이드가교체의가교밀도는 1 mol% 내지 100mol% 일수있으며, 더욱바람직하게는 5 mol% 내지 50 mol% 일수있다. 가교밀도가 1 mol% 미만일경우물성이낮아지는문제점과물흡수력이높아져정제의어려움이있고, 100 mol% 를초과할경우다량의가교제가잔존해있을가능성이높아진다. 상기히알루론산에폭사이드가교체의최종반응농도는 0.05 mg/ml 내지 50 mg/ml인것이바람직하다. 즉, 최종반응농도가 0.05 mg/ml 미만일경우가교반응이잘이루어지않아만족스러운가교체를얻기어렵고, 50 mg/ml 를초과할경우에는농도가너무높아제조공정이원활하지않은문제점이발생한다. 또한, 상기첨가되는천연히알루론산의농도는특별히제한되지않으나, 필요이상으로많이첨가될경우물리적점탄성이매우낮아지는문제점이있으므로히알루론산에폭사이드가교체의최종반응농도대비 0.01% 내지 - 6 -
80%, 보다바람직하게는 0.1% 내지 40% 인것을특징으로한다. [0020] [0021] [0022] [0023] [0024] 본발명의천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체를제조하는방법의상기단계 (ii) 에서히알루론산또는히알루론산염단독, 또는히알루론산또는히알루론산염용액에히알루론산과에테르공유결합을형성할수있는고분자를부가하여에폭사이드가교제에의하여반응시킴으로써히알루론산에폭사이드가교체를얻을수도있다. 상기히알루론산과에테르공유결합을형성할수있는고분자는천연고분자계의콜라겐, 알긴산, 헤파린, 젤라틴, 엘라스틴, 피브린, 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 헤파란설페이트, 콘드로이틴설페이트, 더마탄설페이트및케라탄설페이트로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것임을특징으로한다. 또한, 상기히알루론산과에테르공유결합을형성할수있는고분자는생체적합성이우수한것으로알려진합성고분자계의폴리에틸렌옥사이드, 폴리비닐알콜, 폴리프로필렌옥사이드, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리프로필렌옥사이드공중합체, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리락틱산공중합체, 폴리에틸렌옥사이드- 폴리락틱글리콜산공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리카프로락톤공중합체, 폴리부틸렌옥사이드, 폴리옥시에틸렌알킬에테르류, 폴리옥시-에틸렌케스터오일유도체류, 폴리옥시에틸렌소르비탄지방산에스터류및폴리옥시에틸렌스테아레이트류로이루어진군으로부터선택된 1종이상인것임을특징으로한다. 본발명의히알루론산이에폭사이드가교제에의해서가교체화되는과정은하기의반응식 1에도시하였다. ( 반응식 1) [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 상기히알루론산에폭사이드가교제의중량비는상기히알루론산의반복단위 100 중량부에대하여 1 내지 100 중량부, 보다바람직하게는 5 중량부내지 50 중량부인것을특징으로한다. 상기히알루론산에폭사이드가교제의중량비가 1 중량부미만일경우물성이낮아지는문제점과물흡수력이높아져정제의어려움이있고, 100 중량부를초과할경우다량의가교제가잔존해있을가능성이높아진다. 본발명에의한히알루론에폭사이드가교체는수화된후그수득방법에따라비드젤, 스펀지, 분말, 멤브레인또는시트등의다양한형태로제조될수있는것을특징으로하며, 바람직하게는하기실시예와같이비드젤형태로제조하나, 이에한정되는것은아니다. 본발명에서는수득된히알루론산에폭사이드가교체에천연히알루론산을첨가함으로써점탄성및분해기간을개선할수있다. 뿐만아니라, 천연히알루론산이포함된히알루론산에폭사이드가교체는부착력이높아서생체조직과잘결합하여우수한생체적합성을갖는다. 또한, 분해효소에대한안정성을갖추고있기때문에, 일정시간동안체내에서부피를유지하고, 그후완전히분해되어생체에흡수된다. 이러한특성들로인하여본발명에서제조되는천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체는치과용충전제, 정형외과용보조제, 성형외과용필러, 유착방지제, 세포지지체또는약물전달체등의용도로사용될수있다. 또한, 본발명의천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체는항균또는항염증성천연물질을더욱포함할수있으며, 상기항균또는항염증성천연물질은로즈마리, 정향, 백자인, 강황, 녹차, 검정콩종피, 장미꽃잎, 작약근, 도라지, 콩나물, 유색보리종피, 동백꽃잎, 메밀, 자몽, 감초, 황련, 황기, 황백, 황금, 계피, 목초, 복분자, 오배자, 향나무, 개나리, 고추잎, 박하, 뱀딸기, 뽕나무, 삼백초, 소나무, 약쑥, 어성초, - 7 -
왕벚꽃나무, 조릿대또는양대줄기추출물일수있다. 이하, 본발명의실시예를구체적으로설명한다. [0031] [0032] [0033] ( 실시예 ) 실시예 1: 천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의제조히알루론산을 0.25N NaOH 용액에 10 중량 % 로녹인히알루론산용액을각각 4개의반응기에준비하였다. 상기용액의히알루론산 100 중량부에대해가교제인 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE) 를 20 중량부의비율로첨가하고실온에서 30 시간반응시켰다. 반응물은인산완충용액으로여러번세척하여미반응물을제거하고, 세척된생성물을분쇄하여입자크기를 100 μm ~ 500 μm로조절하였다. 반응물에포함된히알루론산에대해 0.5 중량 %, 1.25 중량 %, 2 중량 %, 2.75 중량 % 의천연히알루론산을추가로첨가하였다. 제조된모든샘플은 121 에서 20 분간멸균하였고, 천연히알루론산의첨가량에따라실험군 1 (0.5 중량 %), 실험군 2 (1.25 중량 %), 실험군 3 (2 중량 %), 실험군 4 (2.75 중량 %) 로명명하였다. [0034] [0035] 비교예 1: 천연히알루론산을포함하지않은히알루론산에폭사이드가교체의제조히알루론산을 0.25N NaOH 용액에 10 중량 % 로녹인히알루론산용액을준비하였다. 상기용액의히알루론산 100 중량부에대해가교제인 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE) 를 20중량부의비율로첨가하고실온에서 30 시간반응시켰다. 반응물은인산완충용액으로여러번세척하여미반응물을제거하고, 세척된생성물을분쇄하여입자크기를 100 μm ~ 500 μm로조절한후, 121 에서 20 분간멸균하였다. 상기비교예 1에서제조된가교체는비교군 1로명명하였다. [0036] [0037] 실시예 2: 천연히알루론산의조성에따른히알루론산에폭사이드가교체의제조히알루론산을 0.25N NaOH 용액에 10 중량 % 로녹인히알루론산용액을각각 5개의반응기에준비하였다. 상기용액의히알루론산 100 중량부에대해가교제인 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (1,4-butanediol diglycidyl ether, BDDE) 를 20 중량부의비율로첨가하고실온에서 30 시간반응시켰다. 반응물은인산완충용액으로여러번세척하여미반응물을제거하고, 세척된생성물을분쇄하여입자크기를 100 μm ~ 500 μm로조절하였다. 반응물에포함된히알루론산에대한천연히알루론산조성비가 15%, 20%, 40%, 60%, 80% 가되도록조절한후, 121 에서 20 분간멸균하였다. 반응물은조성에따라실험군 5(15%), 실험군 6(20%), 실험군 7(40%), 실험군 8(60%), 실험군 9(80%) 로명명하였다. [0038] [0039] [0040] [0041] ( 시험예 ) 시험예 1: 천연히알루론산의첨가량에따른유변학적특성실시예 1과비교예 1에서각각제조된히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산의농도에따른유변학적특성을비교하기위하여레오미터 (rheometer) 를사용하여 0.02 Hz 내지 1 Hz의진동수범위에서복합점도 (complex viscosity) 및 tanδ를측정하였다. 도 1은본발명에서제조된천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산첨가량에따른물성을비교한것으로서, 실시예 1에서제조된천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의복합점도가비교예 1에서제조된천연히알루론산을포함하지않는히알루론산에폭사이드가교체에비하여약 1.4 ~ 2.7배높게나타나, 천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체는우수한복합점도값을갖는것을확인하였다 ( 도 1a 참조 ). 또한, tanδ 값에있어서도실시예 1에서제조된천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체가비교예 1에서제조된천연히알루론산을포함하지않는히알루론산에폭사이드가교체에비하여최대 2.5배높은것으로나타나, 천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체가높은안정성을지닌구조로형성되어있음을알수있다 ( 도 1b 참조 ). [0042] 시험예 2: 천연히알루론산의첨가량에따른부착성 - 8 -
[0043] 실시예 1 과비교예 1 에서제조된히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산의농도에따른택크 (tack) 값을측정하기위하여, 레오미터의 plate-plate 에로딩 (loading) 한후, 0.1 초동한 10-1 의전단속도 (shear rate) 로회전을시키고 0.1 mm/s 의속도로상부플레이트를떨어뜨렸을때걸리는수직력 (normal force) 의값 을측정하였다. [0044] 도 2는실시예 1에서제조된천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의농도에따른택크값을비교한것으로서, 천연히알루론산의첨가량이높을수록히알루론산에폭사이드가교체의택크값이높아지는것을확인하였다. 즉, 본발명의천연히알루론산이포함된히알루론산에폭사이드가교체가비교군보다높은조직부착성이있음을확인하였다. [0045] [0046] [0047] 시험예 3: 천연히알루론산의조성에따른히알루론산에폭사이드가교체의유변학적특성실시예 2와비교예 1에서각각제조된히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산의조성에따른유변학적특성을비교하기위하여레오미터 (rheometer) 를사용하여 0.02 Hz 내지 1 Hz의진동수범위에서복합점도 (complex viscosity) 를측정하였다. 도 3은실시예 2에서제조된천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산의조성에따른물성을비교한것으로서, 천연히알루론산의조성에따라물성을조절할수있음을나타낸다. [0048] [0049] [0050] 시험예 4: 천연히알루론산의조성에따른히알루론산에폭사이드가교체의in vivo 분해특성평가실시예 2에서제조된천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의천연히알루론산의조성에따른분해특성을평가하기위하여동물모델 (SD rat) 을이용하였다. 마취제를쥐의하복부에주사하여마취하고, 마취된쥐의등부에 0.5 ml의샘플을주입하고, 4주후와 12주후의잔존량을측정하였다. 비교예 1에서제조된비교군 1과실시예 2에서제조된실험군 6, 7 및 8을비교관찰하였다. 도 4로부터천연히알루론산의첨가량에따라천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의분해기간을용이하게조절할수있음을확인하였다. [0051] [0052] [0053] 시험예 5: 히알루론산에폭사이드가교체의골재생정도평가실시예 2에서제조된실험군 6과비교예 1에서제조된비교군 1의골재생효과를확인하고비교하기위해, 8주령 SD rat을모델동물로사용하였다. 실험동물을마취한후이마부분중앙의피부를 4cm 정도절개하고, 골막 (periosteum) 을절개하여옆으로제쳐놓은상태에서뇌경막과두개정중부를지나는혈관의손상을주의하면서직경 8mm 치과용드릴을이용하여임계결손크기 (critical size defect) 인지름 8mm 크기 [J. P Schmitz et al., Clin. Orthop. Relat. Res., 205, 299(1986)] 의결손부를형성시킨후, 실험군 6과비교군 1을 Φ8mm * 2mm로모양을만들어결손부위를채워주고, 골막과피부를각각봉합하였다. 또한, 골결손부에어떠한처리도하지않고봉합한대조군도함께실험하였다. 12주동안사육한후, 동물을희생하여골결손부를채취하여 micro-ct, soft X-ray를통해골재생효과를평가하였다. 도 5에서나타난바와같이, 비교군 1과실험군 6이대조군에비해골재생이우수함을관찰할수있었으며, 천연히알루론산이함유되지않은비교군 1에비해천연히알루론산이함유된실험군 6에서우수한골재생효과를나타내었다. 이러한결과를토대로천연히알루론산을포함하는히알루론산가교체가우수한골재생능력을가지는것을확인하였다. [0054] [0055] 시험예 6: 천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교체의항균성능평가실시예 2에서제조된실험군 6에천연항균물질인정향추출물및백자인추출물을각각 1 mg/ml의농도로혼합하고동결건조하여시트형태로제조한후, paper disc method로항균성능을평가하였다. 항균물질이첨가된히알루론산에폭사이드가교체시트를지름 8 mm으로잘라각각 1 x 10 6 ~10 7 cfu/ml의균주 ( 세균 - Bacillus subtillis, Escherichia coli ; 진균 - Candida albicans) 가배양된배양접시위에올려놓고, 세균배양은 24시 - 9 -
간, 진균배양은 48 시간후에형성된항균 zone 을확인하였다. [0056] 도 6 에서나타난바와같이, 천연항균물질이함유된천연히알루론산을포함하는히알루론산에폭사이드가교 체시트가 Bacillus subtillis, Escherichia coli, Candida albicans 의균주에서항균활성을가짐을확인하였 다. [0057] 도면 도면 1a 도면 1b - 10 -
도면 2 도면 3 도면 4-11 -
도면 5 도면 6-12 -