J Physiol & Pathol n Med 29(2):168~173, 2015 * 정수진 이미영 서창섭 신현규 한국한의학연구원한약연구본부한약방제연구그룹 In vitro Anti-allergic Effects of Bangpungtongseong-san in Human Keratinocytes and Primary Mouse Splenocytes Soo-Jin Jeong, Mee-Young Lee, Chang-Seob Seo, Hyeun-Kyoo Shin* Herbal Medicine Formulation Research Group, Herbal Medicine Research Division, Institute of Oriental Medicine Bangpungtongseong-san(BPTSS, Fangfengtongsheng-san in Chineses) is a traditional herbal formula comprising 18 medicinal herbs. In the present study, we performed the simultaneous analysis for four compounds of BPTSS and examined anti-allergic effects in human keratinocytes and mouse splenocytes. The column for separation of four compounds was used Luna C18 column and maintained at 40. The mobile phase for gradient elution consisted of two solvent systems. The analysis was carried out at a flow rate of 1.0 ml/min with PDA detection at 254 and 280 nm. To evaluate production and expression of Th2 chemokines, ELISA and RT-PCR were conducted in tumor necrosis factor (TNF)-α and interferon (IFN)-γ-stimulated HaCaT cells with or without BPTSS or silymarin, a positive control for skin inflammation. To measure Th2 cytokines, primary mouse splenocytes were treated with BPTSS and performed ELISA for interleukin (IL)-4, 5, 13. Calibration curves were acquired with r2>0.9999. The contents of geniposide, liquiritin, baicalin, and glycyrrhizin in BPTSS were 5.06 mg/g, 7.33 mg/g, 27.56 mg/g, and 7.81 mg/g, respectively. BPTSS reduced TARC and RANTES production and mrna expression in TNF-α and IFN-γ-treated HaCaT cells. BPTSS inhibited IL-4, 5, and 13 production in mouse splenocytes. Our data will be a helpful information to upgrade quality control and anti-allergic effects of BPTSS. keywords : Bangpungtongseong-san, Allergy, Th2 chemokine, Th2 cytokine 서 경제발전및문명의서구화로인한생활환경및식생활의변화로인하여, 전세계적으로알러지질환의발병률이급격하게증가하는추세이다. 이중가장대표적인것이아토피성피부염(atopic dermatitis) 과천식(asthma) 으로재발률이매우높은것으로알려져있다 1). 특히알러지질환중소아환자의 50-70% 가아토피성피부염에서시작하여천식이나알러지성비염으로진행되어이에대한치료법구축이시급한실정이다 2). 현재사용되고있는대부분의알러지질환약물들은일시적인증상완화제로서는효능이있으나, 여러가지부작용이동반되며매년건수가증가하고있음이보고되었다 3). 이들문제점해결을위하여최근에는천연물을이용한의약품개발연구가꾸준히증가하고있으며, 한약을이용한연구도 론 이에포함된다. 최근일본에서소쳥룡탕, 시령산등한약처방의항천식효능및스테로이드감량효과등을보고하였으며, 이는알러지질환치료약물개발에한약의유용성을제시하였다 4). 방풍통성산 ( 防風通聖散 ; Bangpungtongseong-san, Fangfengtongsheng-san in Chinese and Bofu-tsusho-san in Japanese) 은한국과일본에서많이사용되고있는한약처방중하나이며, 송대 (1172 년) 의 선명론방 ( 宣明論方 ) 에처음수록되었다. 방풍통성산은활석( 滑石 ), 감초( 甘草 ), 석고( 石膏 ), 황금( 黃芩 ), 길경 ( 桔梗 ), 방풍( 防風 ), 적작약( 赤芍藥 ), 천궁( 川芎 ), 당귀( 當歸 ), 대황( 大黃 ), 마황( 麻黃 ), 박하( 薄荷 ), 연교( 連翹 ), 망초( 芒硝 ), 형개( 荊芥 ), 백출( 白朮 ), 치자( 梔子 ), 생강( 生薑 ) 의 18 가지한약재로구성된다. 본처방은풍열( 風熱 ) 의옹성( 壅盛 ) 으로표리( 表裏 ) 가함께실( 實 ) 하여증한장열( 憎寒壯熱 ) 하고, 두목혼현( 頭目昏眩 ), 목적정통( 目赤睛痛 ), * Corresponding author Hyeun-Kyoo Shin, Herbal Medicine Formulation Research Group, Herbal Medicine Research Division, Institute of Oriental Medicine, 1672 Yuseongdae-ro, Yuseong-gu, Daejeon, 305-811, Republic of E-mail : hkshin@kiom.re.kr Tel : +82-42-868-9464 Received : 2014/11/07 Revised : 2015/01/30 Accepted : 2015/02/22 c The n Society of Oriental Pathology, The Physiological Society of n Medicine pissn 1738-7698 eissn 2288-2529 http://dx.doi.org/10.15188/kjopp.2015.04.29.2.168 Available online at http://society.kisti.re.kr/sv/sv_svjscj03l.do?method=list&poid=ksomp&kojic=drsrdh&svnc=v28n5&menuid=1&subid=13
S. J. Jeong et al 169 구고구건( 口苦口乾 ), 인후불리( 咽喉不利 ), 흉격비민( 胸膈痞悶 ), 해구천만( 咳嘔喘滿 ), 체타조점( 涕唾稠粘 ), 대변비결( 大便秘結 ), 소변적삽 ( 小便赤澁 ), 창양종독( 瘡瘍腫毒 ), 장풍치루( 腸風痔漏 ), 단반은진( 丹斑癮疹 ) 등을치료하며, 소풍해표( 疏風解表 ), 사열통변( 瀉熱通便 ) 등의효능이있다 5). 현재방풍통성산은살사라진이라는제품명으로시판 6) 되고있으며, 비만환자치료에널리사용되어지고있다. 방풍통성산의약리효능과관련된현대과학적연구의결과로는항비만활성을비롯하여, 항동맥경화, 항고혈압, 항알러지성비염효능이보고되었다 7-10). 본연구에서는방풍통성산의품질관리를위하여표준화를실시하였다. 방풍통성산을구성하는한약재의분석대상성분 12가지를선정하고, 광다이오드어레이(photodiode array, PDA) 가결합된고성능액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC) 를이용하여성분들의동시분석을실시하였다. 주요성분인치자의 geniposide, 감초의 liquiritin과 glycyrrhizin 및황금의 baicalin만이검출되어이결과를제시하고자한다. 또한김등의논문 10) 에서제시한방풍통성산의항알러지성비염에대한효능결과와관련하여, 본연구에서는항알러지성질환중특히알러지성피부염과천식에대한효능을검색하고자하였다. 각질세포와비장세포를이용하여, Th2 케모카인및사이토카인생산에대한영향을측정하였으며, 특히각질세포의연구에서는알러지성피부염 ( 아토피성피부염) 효능약물로알려진 silymarin을 positive control 로사용하였다 11). 재료및방법 1. 약재본실험에사용된방풍통성산의구성한약재는 옴니허브 (Youngcheon, ) 와 HMAX(Jecheon, ) 에서구입하여동국대학교이제현교수(Gyeongju, ) 로부터감별을받은후사용하였으며, 각각의구성한약재들의표본(2008-KE-23-1~ KE-23-18) 은한국한의학연구원한약방제연구그룹에보관하였다. 2. 방풍통성산추출물및검액의조제방풍통성산의구성한약재를 Table 1과같이무게비율로배합한시료약 10.0 kg을추출기(cosmos 660; Kyungseo Machine Co., Incheon, ) 에넣고, 물을시료의 10배로첨가하여 10 0 에서 2시간전탕한후동결건조하여 17.7% 의수율로추출물 1.7 kg을얻었다. HPLC 분석을위해동결건조된추출물 200 mg을정확히측정한후물을넣어 20 ml로맞춘후혼합하였다. Baicalin 의정량분석을위하여, 검액을다시증류수로 2.5 배희석하고, SmartPor GHP syringe filter(0.2 μm, Woongki, Seoul, ) 로여과하여검액으로하였다. 3. HPLC 분석 Geniposide, liquiritin, baicalin 및 glycyrrhizin 4종의표준품은모두 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan) 로부터구입하였으며, 각표준품의순도는 98% 이상이었다. HPLC 분석을 위한 methanol, acetonitrile 및 water는 J.T. Baker(Philipsburg, NJ, USA) 에서 구입하였으며, glacial acetic acid는특급시약으로 Junsei(Tokyo, Japan) 에서구입하여사용하였 다. 방풍통성산 내 주요 구성 성분의 함량을 분석하기 위하여 LC-20A 시스템(Shimadzu Co., Kyoto, Japan) 을사용하였으며, 데 이터분석은 LCsolution software(version 1.24) 를이용하여처리 하였다. 4종성분의분리를위해 Phenomenex사의 Luna C18(5 μm, 4.6 250 mm, Torrance, CA, USA) 칼럼을사용하였고, 칼럼온 도는 40 로 유지하였다. 이동상은 1.0% acetic acid가 함유된 water (A) 와 1.0% acetic acid가함유된 acetonitrile (B) 을사용하 여 다음과 같이 흘려주었다 : (A)/(B)=95/5 (0 min) (A)/(B)=30/70 (40 min) (A)/(B)= 0/100 (45 min; hold for 5 min) (A)/(B)= 95/5 (55 min; hold for 15 min). 유속은 1.0 ml/min으로흘려주었으며주입량은 10 μl로하였고, 검출파장은 190-400 nm 에서하였다. 4. HaCaT 세포배양및세포독성펑가 HaCaT 세포는 American Type Culture Collection(Rockville, MD, USA) 로부터분양받아사용하였다. 세포배양은 10% fetal bovine serum이포함된 DMEM 배지를사용하였으며, 37, 5% CO2 조건에서실시하였다. 세포독성평가를위하여 96 well microplate에 1 10 3 cells/well 의농도로세포를분주하여, 방풍통성산을농도별(0, 10, 20, 50, 100, 200, 500 μgml / ) 로처리하여 24 시간배양하였다. Cell counting kit(cck)-8 solution을 10 μl씩첨가하여 4 시간동안반응시킨다음, microplate reader(benchimark Plus, Bio-Rad, MN, USA) 를사용하여 450 nm에서흡광도를측정하였다. 측정값은대조군과비교를통해상대적인세포생존율(% of control) 을계산하였다. 5. 마우스비장세포분리및배양 8-10 주령의수컷 BALB/c 생쥐 (Orient Bio, Seongnam, ) 를경추탈골하여희생한후비장을적출하였다. 비장으로부터단일세포를분리한후 RBC lysis buffer(sigma-aldrich, St. Louis, MO, USA) 로적혈구를제거하였다. 세포배양은 10% fetal bovine serum, 25 mm HEPES, 2 mm glutamine, 100 unit/ ml penicillin, 100 mgml / streptomycin(gibco BRL, Carlsbad, CA, USA) 을함유하는 RPMI 1640 배지에부유하여 37, 5% CO2 조건에서실시하였다. 6. Th2 케모카인및사이토카인분비측정 Tumor necrosis factor(tnf)-α와 interferon(ifn)-γ으로자극한 HaCaT 세포에방풍통성산을처리한후배양상등액을수거하였다. Th2 케모카인(thymus and activation regulated chemokine; TARC, regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted ;RANTES) 측정키트 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA) 를사용하여배양액중포함된함량을측정하였다.
170 S. J. Jeong et al 마우스비장세포를 p-hydroxycinnamic acid methyl ester로 1시간전처리한다음 concanavalin A(Con A; 1 μg/ml) 로 3일간자극한세포에방풍통성산을처리한다음배양상등액을수거하였다. Th2 사이토카인(IL-4, IL-5, IL-13) 측정키트(BioSource International, Camarillo, CA, USA) 를사용하여생성량의변화를측정하였다. 7. Th2 케모카인발현분석 TNF-α와 IFN-γ로자극한 HaCaT 세포에방풍통성산을처리한세포로부터 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을이용하여 total RNA 를분리하였다. iscript cdna Synthesis kit(bio-rad, Hercules, CA, USA) 를이용하여 cdna를합성하였다. 실험에사용된 primer 염기서열은 Table 2 와같으며, PCR의조건은 94 30 초, 64 1 분, 72 1분 30초를 1 cycle로총 25회반응시키고, 최종적으로 72 에서 10분간 DNA 합성을연장시킨후 1.5% agarose gel 상에서전기영동하여발현을확인하였다. 8. 통계처리실험결과의통계처리는 Graphpad Instat Ver. 3.10 (Graphpad software, Inc., San Diego, CA, USA) 을이용하여일원배치분산분석(one-way ANOVA) 을실시하였으며, 각군간의차이는 Dunnet s test에의해 p < 0.05 수준에서사후검정을실시하였다. Table 1. Composition of Bangpungtongseong-san (BPTSS) Amount H erbal m edicine Scientific nam e Supp lier Source (g) Talcum Talcum HMAX China 6.375 Glycyrrhizae Radix Glycyrrhiza HMAX China 4.5 et Rhizoma uralensis Gypsum Fibrosum Gypsum HMAX China 2.625 Scutellaria Jeong seon, Scutellariae Radix HMAX 2.625 baicalensis Platycodon Yeongcheon, Platycodi Radix Omniherb 2.625 grandiflorum Saposhnikoviae Radix Ledeb ouriella seseloides HM AX China 1.6875 C nidii Rhizom a Cnidium officinale Omniherb Yeongcheon, 1.6875 Angelicae Gig antis P y eongchang, Angelica gigas Omniherb Radix 1.6875 Paeoniae Radix Paeonia lactiflora Omniherb Hwasun, 1.6875 Rhei Rhizoma Rheum undulatum HM AX China 1.6875 Ephedrae Herba Ephedra sinica HM AX China 1.6875 Menthae Herba Mentha pulegium Omniherb China 1.6875 Forsythiae Fructus Forsythia koreana HM AX China 1.6875 N atrii Sulfas Erigeron canadensis HM AX China 1.6875 Schizonepetae Schizonepeta Spica tenuifolia Omniherb China 1.3125 Atractylodis Atractylodes Rhizoma Alba jap onica HMAX China 1.31 Gardeniae Fructus Gardenia jasm inoides Omniherb Muju, 1.3 Zingiberis Rhizom a Yeongcheon, Zingiber officinale Omniherb Crudus 6.25 44.125 Table 2. Sequences of the oligonucleotide primers used for PCR amplification Target Primer sequences TARC sense 5 -ACT GCT CCA GGG ATG CCA TCG TTT TT-3 antisense 5 -ACA AGG GGA TGG GAT CTC CCT CAC TG-3 RANTES sense 5 -CCC CGT GCC GAG ATC AAG GAG TAT TT-3 antisense 5 -CGT CCA GCC TGG GGA AGG TTT TTG TA-3 GAPDH sense 5 -GTG ATG GCA TGG ACT GTG GT-3 antisense 5 -AAG GGT CAT CAT CTC TGC CC-3 결 1. HPLC 동시분석결과 HPLC-PDA를이용하여방풍통성산을구성하는 18종의생약중치자의 geniposide, 황금의 baicalin 및감초의 liquiritin과 glycyrrhizin 등 4 종의성분에대하여동시분석조건을설정하였다. 설정된최적의 HPLC-PDA 분석법을이용하여 4종의성분들을 35 분이내에분리능 5.79 이상으로양호한분리가이루어졌으며, 검량선작성결과상관계수값이 0.9999 이상으로우수한직선성을나타내었다. 검액에서각성분의 peak는표준용액에서의표준품 peak의 retention time과 UV 흡수파장을통해비교확인하였으며, geniposide, liquiritin, baicalin 및 glycyrrhizin 등 4종의성분은 14.1 분, 17.3 분, 22.5분및 31.7 분에각각검출되었다(Fig. 1). 확립된분석법을이용하여치자의 geniposide, 황금의 baicalin 및감초의 liquiritin과 glycyrrhizin 등 4종에대하여방풍통성산추출물을동시분석한결과 5.06-27.56 mg/g 으로검출되었으며, 그중황금의주요성분인 baicalin이 27.56 mg/g으로다른성분에비해많이함유되어있음을확인하였다 (Table 3). Fig. 1. Three-dimensional chromatogram of Bangpungtongseong-san (BPTSS) by HPLC-PDA. Table 3. Contents of marker compounds in Bangpungtongseong-san (BPTSS) by HPLC (n=3) Compound Mean (mg / g ) SD RSD (% ) Source Geniposide 5.06 0.02 0.31 Gardenia jasm inoides Liquiritin 7.33 0.01 0.20 Gly c y rrhiza uralensis B aicalin 27.56 0.20 0.74 Scutellaria b aicalensis Glycyrrhizin 7.81 0.20 0.20 Gly c y rrhiza uralensis 과
S. J. Jeong et al 171 Fig. 2. Cytotoxicity of Bangpungtongseong-san (BPTSS) in HaCaT cells. Cells were seeded into 96-well plates and treated with various concentrations of BPTSS (0, 10, 20, 50, 100, 200 or 500 μg / ml ) for 24 h. C ell viability w as assessed using a C C K-8 assay. The values w ere expressed as mean ± S.D of three independent experiments. 2. 방풍통성산의항알러지효능방풍통성산의 Th2 케모카인생성에대한효과를확인하기위하여인간상피세포주인 HaCaT 을이용하였다. 다양한농도(0, 10, 20, 50, 100, 200 or 500 μgml / ) 의방풍통성산을 24 시간동안세포에처리한후세포생존율을측정하였다. 최고농도인 500 μgml / 처리시에도세포독성이관찰되지않았다(Fig. 2). 방풍통성산이상피세포의 Th2 케모카인생산에미치는영향을연구하기위하여, HaCaT 세포에 TNF-α와 IFN-γ를처리하여케모카인생산을유도하고, 다양한농도(0, 125, 250, or 250 μg/ml) 의방풍통성산을처리하였다. 방풍통성산은 TNF-α와 IFN-γ에의한 TARC와 RANTES 의분비를농도의존적으로억제시키는경향을나타내었다 (Fig. 3). 이와함께방풍통성산처리시 TNF-α와 IFN-γ에의하여유도된 TARC 및 RANTES mrna 발현을감소시켰다(Fig. 4). 방풍통성산의 Th2 사이토카인분비억제효과를확인하기위하여,BALB/c 마우스로부터분리한비장세포를사용하였다. 비장세포에방풍통성산(0, 50, or 100 μgml / ) 을 24 시간동안처리한다음 ELISA 법에의하여 IL-4와 IL-5 의함량변화를측정하였다. 그결과, 방풍통성산은 IL-4와 IL-5의분비량을감소시키는경향이있었다 (Fig. 5). (A) Fig. 4. Effect of Bangpungtongseong-san (BPTSS) on TNF-α and IFN-γ -stim ulated chemokine expression at the mrna level in HaCaT cells. RT-PCR was performed to determine the mrna expression levels of TARC, RANTES, and GAPDH. (A ) (B) (B) Fig. 3. Effects of Bangpungtongseong-san (BPTSS) on TNF-α and IFN- γ -stimulated productions of chemokines in HaCaT cells. Productions of TARC (A) and RANTES (B) were measured using the culture supernatant from cells co -treated w ith B PTSS (0, 125, 250 o r 500 μg / ml ), and TN F-α and IFN- γ (each 10 ng/ ml, TI) for 24 h. Silymarin (6.25, 12.5, or 25 μg / ml ) was used as a positive control. Values were expressed as mean ± SEM of three independent experiments. Fig. 5. Effect of Bangpungtongseong-san (BPTSS) on Th2-type cytokine production in ConA-stimulated in splenocytes. Productions of IL-4 (A) and IL-5 (B) were measured using the culture supernatant from cells treated in the presence (50 or 100 μg / ml ) or absence of BPTSS, and the cytokine levels were measured with ELISAs. Values were expressed as mean ± SEM of three independent experiments. 고 찰 알러지질환은알러지유발물질이항원이되어체내에침입하
172 S. J. Jeong et al 였을때유전적요인또는면역력약화등으로인하여나타나는면역계의과민반응이다 12). 한의학에서알러지의원인은폐, 비장, 신장등장기의기능약화로인하여정기( 正氣 ) 가허하여발생된다고하였다. 특히고전한의서에서아토피성피부염은선( 癬 ), 태선( 苔癬 ), 태렴창( 胎斂瘡 ), 습진( 濕疹 ), 습창( 濕瘡 ), 음창( 陰瘡 ) 등으로언급되었으며 13), 풍열혹은혈열, 식적등이원인으로비위의운화기능저하로생기는내부습열과외부풍습열이기부에온조되어형성된것으로설명되었다 14). 한약처방을이용하여이와같은증상들에대한치료가이루어지고있으며, 임등 15) 은생혈윤부음 ( 生血潤膚飮 ) 의아토피피부염치료에대한예비임상결과를발표하기도하였다. 본연구에서는인간피부상피세포와마우스비장세포를사용하여방풍통성산의항알러지효능을검색하였으며, 이에앞서방풍통성산의품질관리를위한성분동시분석을실시하였다. 이들구성성분들에대한 HPLC 분석결과가이전의여러논문 16-18) 에서발표된바있으며, 이들을참고하여분석하였다. 그결과구성한약인치자의 geniposide가 5.06 mg/g, 황금의 baicalin이 27.56 mg/g, 그리고감초의 liquiritin과 glycyrrhizin이각각 7.33 mg/g, 7.81 mg /g 으로검출되었다. 면역반응에서 Th2 세포는 immunoglobulin E(IgE) 생산을촉진하는역할을하여알러지반응에주요역할을한다 19). 아토피피부염과같은염증성피부질환은 Th2 케모카인과관련이있다. 피부상피세포에 TNF- α, IFN-γ 등의자극으로생성된 TARC, RANTES와같은케모카인들은 c-c chemokine receptor type 4(CCR4)-positive Th2 세포에결합하여이들을염증조직으로유도한다 20). 본연구결과방풍통성산은 TNF-α와 IFN-γ에의한 TARC와 RANTES 의분비를억제시키는경향이있음을확인하였다. 또한방풍통성산은 TNF-α와 IFN-γ에의하여유도된 TARC 및 RANTES mrna 발현을감소시켰다. Positive control로사용된 silymarin 11) 의효능과비교하였을때, 케모카인의분비억제효능은방풍통성산이우수하였으나, mrna 발현감소에대해서는 silymarin 이더우수하였다. 이와같은결과는방퐁통성산은한약복합처방인반면 silymarin 은단일성분인차이점으로인한것으로사료되며, 향후처방의효능을동등한기준에서비교하기위한대조군의확보가필요할것으로생각된다. Th2 사이토카인은천식의병리생리학적측면에서필수인자이다. 이들중 IL-4와 13은 IgE의 B 세포로의전환, 점액과다분비, 호산구의폐침투등에중요한역할을한다 21). 호산구는염증매개인자분비를유도하는 IL-5에의하여활성화된다 22). 본연구의결과방풍통성산은마우스비장세포에서 Th2 사이토카인인 IL-4와 IL-5 의분비량의감소를확인하였다. 이상의결과들은방풍통성산이 Th2 케모카인및사이토카인분비억제시키는경향이있으며, 향후아토피피부염과천식특이적실험모델을활용한추가실험을통하여보다확실한효능검증이필요할것으로사료된다. 현재까지성분동시분석에서확인한 4가지성분의항알러지또는항알러지성피부염효능에대해발표된논문은없으며, 이들성분들중항알러지효능에대한활성성분(active compound) 을확인하기위한추가실험이요구된다. 결 본연구는한약처방방풍통성산을대상으로품질관리를위한 HPLC 동시분석과 in vitro 항알러지효과를다음과같이확인하였다. HPLC 분석결과방풍통성산의구성한약인치자의 geniposide가 5.06 mg/g, 황금의 baicalin이 27.56 mg/g, 그리고감초의 liquiritin과 glycyrrhizin이각각 7.33 mg/g, 7.81 mg/g으로검출되었다. 방풍통성산은피부상피세포의 TARC와 RANTES 분비및발현억제효과를나타내었다. 방풍통성산은마우스비장세포의 Th2 IL-4, 5, 13의분비억제효과를나타내었다. 이상의결과들은방풍통성산의품질관리를위한기초자료로사용할수있을것으로사료된다. 또한방풍통성산은 Th2 케모카인과사이토카인의생성억제를통하여항알러지효능을나타내는것이며, 이와같은결과는향후한약을이용한알러지치료제개발연구의기초자료로활용될수있을것으로사료된다. 론 감사의글 본연구는한국한의학연구원에서지원하는 한약처방의과학적근거기반구축사업(K14030) 에의해수행되었으며, 이에감사드립니다. References 1. National Institute of Health. Health Statistics 2012: National Health and Nutrition Examination Survey (KNHANES V-3). 2012. 2. Kim, D.I., Yang, H.J., Park, Y.M., Rha, Y.H., Choung J.T., Pyun, B.Y. Clinical Manifestations Patterns of Allergic Disease in n Children under the Age of 6: Multi-center Study. Kor J Pediatr 51(5):640-645, 2008. 3. Institute of Drug Safety & Risk Management, Drug Safety Information Reporting Trend 2013. No. 4. 2013. 4. Umesato, Y., Iikura, Y., Inui, H. Effect of Shoseiryu-to on asthmatic children and guinea PIG tracheal smooth muscle. Acta Paediatr Jpn 25(4):361-369, 1983. 5. The n Medicine Society for the Herbal Formula Study. Herbal Formula Prescription. Seoul, Younglim-sa. pp 263-264, 1999. 6. Choi, E.K., Ryu, E.K. Effects of Bang-Pung-Tong-Seoung-San on obese patients. J Kor Orient Assoc Study Obesity 1(1):57-62, 2001. 7. Ohno, K., Chung, H.J., Maruyama, I., Tani, T. Bofutsushosan, a traditional Chinese formulation, prevents intimal thickening and vascular smooth muscle cell proliferation induced by balloon endothelial denudation in rats. Biol
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