동의생리병리학회지제 22 권 5 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(5):1158 1162, 2008 강원도재배참당귀및일당귀의활성에대한비교연구 이선구 * 상지대학교한의과대학병리학교실 Comparison of Activity of Angelica Gigas and Angelica Acutiloba from Kangwon Seon Goo Lee* Department of Oriental Pathology, College of Oriental Medicine, Sangji University In genus Angelica, three species have been used and cultivated for medical material in orient, A. gigas in korea, acutiloba in Japan and sinensis in China. The plant material of Angelica spp. is used for the treatment of women`s disease as a hematic. The extracts from A. gigas and acutiloba were fractionated aqueous partitions. And study was performed to examine DPPH scavenging activities, BSA degradadion, anti-apoptosis and NO scavenging. DPPH radical scavenger activity was measureed by DPPH method, it was shown dose-dependently effect. and BSA degradadion was shown same result. Treatment of cells with hydrogen peroxide, a reactive oxygen species was to indiced cell death and pretreatment with Angelica gigas and angelica acutiloba extract attenuated the occurrence of H 2O 2-induced cell death. In vitro nitric oxide (NO) scavenging effect on Angelica gigas and angelica acutiloba extracts. All extracts effectively reduced the generation of NO radicals in a dose-dependant manner. Key words : Angelica gigas, Angelica acutiloba, DPPH, BSA, apoptosis, NO 서론 당귀 ( 當歸 ) 의본초학적기록은신농본초경중품에 味甘溫主欬逆上氣溫瘧寒熱洗洗在皮膚中婦人漏下絶子諸惡瘡瘍金瘡煮汁飮之一名乾歸 라고 1) 수록된이래역대문헌에서補 ), 養血, 調經의유효한약으로광범위하게사용되었다. 우리나라의경우鄕藥採取月令에그채취시기가수록된이후에鄕藥集成方에효능과활용에대한기록이나타났으며, 그후오늘날까지가장많이쓰이는약재중하나이다 2). 미나리과 (Umbelliferae) 에속하는다년생초본 (2-3년) 인당귀는동양각국에서기원이다른식물을약으로사용하고있으며, 중국에서는 Angelica(=Ligusticum) sinensis Dielis, 일본은일당귀 Angelica acutiloba Kitagawa, 북해도당위 A. var. sugiyamana Hikino의 2종류가대표적이며, 우리나라당귀는참당귀 Angelica gigas Nakai로봄과가을에채취하여건조한후사용하며 3), 절단면이일당귀와중국당귀에비하여하얗다. 국내에서사용되는당귀는참당귀, 일당귀, 중국당귀등 3 * 교신저자 : 이선구, 강원도원주시우산동 660, 상지대학교한의과대학, E-mail : returnto@sangji.ac.kr, Tel : 033-730-0664 접수 : 2008/09/08 수정 : 2008/09/24 채택 : 2008/10/08 종류가있으며 4), 사용부위별로두 ( 頭 ), 신 ( 身 ), 미 ( 尾 ) 등을구분이있으나, 유통과정에서는명확한기준이마련되어있지않다. 당귀의연구는기원, 성분, 활성물질, 효능등다양하게이루어졌다. 최근의연구를중심으로살펴보면, 참당귀, 일당귀, 중국당귀등생육특성이나감별법에대한연구 5-8), 활성성분에대한연구 9-13), 간기능에미치는영향 14,15), 혈관이나혈액에미치는영향 16-24), 항산화활성 25-27), 면역활성 28-30), 항염증 31) 등에대한보고가있었다. 또한, 당귀를이용한식품개발 32) 등의연구가있었다. 대부분의연구에서는기원이나원산지를표기하였으나, 간혹명확하지않거나기재하지않은경우들도있었다. 원산지와기원의명확성은기초연구뿐만아니라, 한약재를이용한산업화과정중에서도매우중요한자료가될것이다. 이에본연구는생산지와기원을알수있는 3종의당귀를사용하여항산화, Apoptosis, NO 억제등의활성을측정하여그결과를보고하는바이다. 1. 시료 실험 - 1158 -
강원도재배참당귀및일당귀의활성에대한비교연구 본실험에사용한당귀는홍천군재배참당귀, 홍천군재배일당귀, 정선군재배참당귀를사용하였다. 본실험을위하여재배지역과기원을확인하여준비한당귀재료 100 g을각각 3시간동안물과함께전탕한후여과액을동결건조시켜시료를얻었으며, 실험에필요한농도별로 PBS에희석하여본실험에사용하였다. 2. DPPH 라디칼소거효과 DPPH 라디칼소거효과는 DPPH(1, 1-dipheny1-2- picrylhydrazyl) 와시료를 1:1로반응시켜, DPPH의짙은보라색이무색으로변하는색깔변화를조사하여항산화능을측정하는방법이다. 96 well plate를사용하여 DPPH 100 μl (150 μm in Methanol) 에 PBS에각농도별로희석시킨당귀추출물 100 μl씩혼합한후 30분간실온에서빛을차단시키며방치하였다. 대조군은 100 μl의 PBS를사용하였다. 반응이종료된후 ELISA 측정기에서 540 nm로흡광도를측정한후 0 mg / ml에서의값을 0% 로하여각농도별억제능을계산하였다. 3. Bovine serum albumin(bsa) degradation 본실험은직접적으로과산화수소가시험관내에서 BSA(Bovine serum albumin) 를공격하는것을항산화물질이방어하는것을측정하는실험이다. 항산화물질을처리하지않은경우는과산화수소가 BSA를공격하여 BSA가분해되는데, 전기영동과염색의과정을거쳐확인할수있다. 이때항산화물질을처리하면과산화수소에의한 BSA의공격이방해되어진한염색이나타나므로비교가가능한검증방법이다. BSA 12.5 μl (0.5 mg / ml in PBS), H 2O 2 5μl (2.5 mm), CuSO 4 5 μl (100 μm), 농도별당귀추출물 10 μl를넣고최종부피가 60 μl가되게 PBS로조정하였다. 그후 2시간동안실온에방치한후 1.2% SDS-PAGE를실시하여 coomassie blue로염색과탈염색처리후젤을스케닝하였다. 4. Apoptosis에미치는영향본연구에사용된항산화모델은세포사 (apoptosis) 시생체내에서유발되는활성산소종의하나인과산화수소 (H 2O 2) 를이용하였다. 여러가지세포외인자에의하여세포사가유발될경우결정적인요소인미토콘드리아내막과외막에있는세포사멸유전자에영향을미쳐 Bax와 Bcl-2에의하여 cytochrome C가미토콘드리아에서빠져나와 Caspase-3 효소를활성화하여세포가죽음에이르게된다. 이러한세포사모델을이용하여과산화수소로유발시킨후시료가세포사를억제하는지확인하였다. 1) 세포배양및당귀시료처리본실험에사용된세포는사람신경세포주 SK-N-MC 세포를 DMEM(GibcoBRL, USA) 에 5% FBS와 Fungizone를첨가하여 37, 5% CO 2 에서배양하였다. 배양된세포에과산화수소 400 μ M 을넣고, 각종류별당귀추출물의농도를 0.625와 2.5 mg / ml으로조정하여 10 μl씩처리한후 24시간경과뒤이하실험을진행하였다. 2) 단백질추출당귀추출물이처리된 SK-N-MC세포에서단백질을추출하 기위하여 1 10 7 의세포당 lysis buffer(10 mm Tris HCl, ph7.6, 150 mm NaCl, 1% SDS) 100 μl로현탁시켜얼음위에서한시간동안방치하여완전히 lysis시켜단백질을추출하였다. 12,000 Xg에서 15분간원심분리하여상층액을새튜브에옮겨다음실험을수행하였다. 3) 단백질농도측정단백질정량은 Bicinchoninic Acid(BCA, Sigma, USA) 용액과 bovine serum albumin(bsa, Sigma, USA) 으로표준곡선으로산출하여측정하였다. BSA를농도별로 0, 1, 2, 4, 8, 16 μg / μl로정한후 96 well plate에 20 μl씩넣고, BCA 용액 100 μl를첨가하여 20분간 37 에서방치한다음흡광도 540 nm에서측정하여표준곡선을작성하였다. 추출된단백질상층액 2 μl와 PBS 18 μl를섞고, BCA 용액 100 μl을혼합후 20분간 37 에서방치한후 540 nm에서측정하여표준곡선을이용하여단백질농도를계산하였다. 4) 전기영동및 Western blot 추출한단백질 50 μg을이용하여 caspase-3, Bcl-2, Bax, cytochrome C, Actin을확인하기위하여 12.5% SDS-polyacrylamide gel에전기영동하여 nitrocellulose membrane으로 transfer 하였다. 이 Membrane을 5% skimmilk을함유한 PBS-Tween(0.01%) 에서 1시간동안상온에서 hybridization 하였다. 이 membrane에 caspase-3(cell Signalling, USA), Bcl-2(Santa Cruz, USA), Bax(PharMingen, USA), cytochrome c(pharmingen, USA), Actin(Santa Cruz, USA) 의항체를사용하여하루밤동안상온에서 shaking하면서 hybridization 시키고난후 PBS-Tween 20으로세척하였다. membrane을 horseradish peroxidase으로 conjugated된 antimouse IgG 또는 antirabbit IgG 로다시 1시간동안상온에서 hybridization 하였다. Membrane을 PBS-Tween으로네번세척한후 chemiluminescence 시약 (Pierce, USA) 으로반응시킨후 Fugi X-ray film으로감광시켜단백질을가시화하였다. 5. RAW264.7에서 nitric oxide(no) 측정 NO를측정하기위하여 RAW264.7(KCBL 40071) 세포를사용하였다. RAW264.7은 DMEM(GibcoBRL, USA) 에 5% FBS와 Fungizone를첨가하여 37, 5% CO 2 에서배양하였다. 배양된세포를 24 well plate에 well에 5 10 5 cells/ ml세포로조정된세포 1 ml을분주한후배양하다가, LPS 16 μl (200 ng/ ml ) 와당귀를농도별로 10 μl씩처리한후 12시간배양하였다. 배양종료후 96 well plate에배지 100 μl와동량의 Griess 용액 (1% sulfanilamine in 5% phosphoric acid + 0.1% naphthylethylenediamine dihydrochloride in H 2O) 을섞어 540 nm에서흡광도를측정하였다. 이때표준용액으로 NaNO 2 를사용하여농도를측정하였다. 1. DPPH 라디컬소거효과 결과및고찰 - 1159 -
이선구 식물추출물의항산화효과를측정하는방법으로대표적으로 DPPH 라디칼소거효과를이용한다. 본연구의경우각종류의당귀농도를 0.078, 0.156, 0.313, 0.652, 1.25, 2.5, 5, 10 mg / ml까지사용하였으며, 0 mg / ml를 100% 로하여각농도별 DPPH 소거효과를나타내었다. 각각의시료는농도가증가함에따라소거효과를 50% 80% 까지나타냈는데, 홍천산참당귀와홍천산일당귀는 2.5 mg / ml에서최대소거능력을보였으며, 정선산참당귀는 1.25 mg / ml에서최대의소거효과를보였다 (Fig. 1). 홍천산참당귀와일당귀의경우는강 26) 등의논문결과와유사하게나타났으며, 최등 33) 의결과에의한현미녹차, 홍차, 녹차등의다류와비교할때당귀를이용한다류의개발에관심을가질수있다. 100.0 90.0 80.0 70.0 60.0 e 50.0 g n e v a 40.0 c S % 30.0 20.0 10.0 0.0 0.00 0.078 0.156 0.313 0.625 1.25 2.5 5 10 Concentration (mg/ml) Ag-J Ag-H Aa-H Fig. 1. Effects of Angelica gigas and Angelica acutiloba on DPPH free radical Scavenging activity Ag-J : Angelica gigas from jeongsun. Ag-H : Angelica gigas from Hongcheon. Aa-H : Angelica acutiloba from Hongcheon. 2. BSA degradation 각당귀시료가과산화수소 (H 2O 2) 에의해유도되는 BSA의분해를억제하는지측정하였다. H 2O 2 를처리하지않은경우 BSA가모두확인되나, H 2O 2 를처리하면분해되어 BSA가보이지않는다. 그러나당귀시료를처리하면, 홍천산참당귀는 0.625 mg / ml에서, 홍천산일당귀는 0.313 mg / ml, 정선산참당귀는 1.25 mg / ml에서항산화효과가나타나기시작하였다 (Fig. 2). 유해물질이나약물등에폭로되었을때나병적상태에서는세포내에 superoxide radical(o 2), hydroxyl radical(oh-) 및 hydrogen peroxide(h 2O 2) 가다량생산되어조직에치명적인손상을입힐수있는데 34), 본연구에서당귀의종류별로농도의존적으로산화억제를보였다. 본실험에서과산화수소에의한 BSA 의분해를홍천산일당귀가가장낮은농도에서나타내었다. DPPH 소거능과 BSA degradation의결과에서홍천군재배참당귀와일당귀가정선군재재참당귀에비하여비교적좋은결과를나타내었다. 이런결과를같은기원의시료라도생육조건이다르기때문에활성에차이가있는것으로생각된다. 3. Apotosis에미치는영향 Apoptosis는고등세포가외부의자극에대해서능동적으로대처하는프로그램된세포사멸기작이며, 대부분의동물조직에서손상되거나감염된불필요한세포와과잉생산된세포를제거하는과정으로배발생과종양의퇴화및면역시스템에서중요한역할을한다. 여러가지세포외인자에의하여세포사가유발될경우결정적인요소인미토콘드리아내막과외막에있는세포사멸유전자에영향을미쳐 Bax와 Bcl-2에의하여 cytochrome C가미토콘드리아에서빠져나와 Caspase-3 효소를활성화하여세포가죽음에이르게된다. 이러한세포사모델을이용하여과산화수소로유발시킨후당귀가세포사를막을수있음을증명하였다. 사용된과산화수소의농도는 400 μm이며당귀는앞의실험에서가장항산화효과가있는 0.625와 2.5 mg / ml을사용하였다. 결과는 Fig. 3에서보여주는바와같이 0.625 mg / ml이상에서세포사를막는것으로나타났다. 과산화수소를처리한군에서 caspase-3 효소활성화가일어났으며, 세포질내 Bcl-2가감소하였고 Bax와 cytochrome C는증가하였으나, 당귀처리에의하여세포사가방지됨을확인할수있었다 (Fig. 3). Fig. 3. Anti-apoptosis effects of Angelica gigas and Angelica acutiloba on SK-N-MC neuroblastoma cell Ag-J : Angelica gigas from jeongsun. Ag-H : Angelica gigas from Hongcheon. Aa-H : Angelica acutiloba from Hongcheon. Fig. 2. Protection effects of Angelica gigas and Angelica acutiloba on BSA degradation against H 2O 2 Ag-J : Angelica gigas from jeongsun. Ag-H : Angelica gigas from Hongcheon. Aa-H : Angelica acutiloba from Hongcheon. 4. RAW264.7 에서 nitric oxide(no) 측정 일산화질소 (nitric oxide, NO) 는염증반응의중요한인자로 - 1160 -
강원도재배참당귀및일당귀의활성에대한비교연구 박테리아의세포벽성분인 lipopolysaccharide(lps) 에의해세포의 inducible nitric oxide synthase(inos) 효소가활성화가되면세포에 NO의농도가증가하게된다. 과도한 NO 생성은급만성염증에관여하며세포의파괴와염증조직의상해를초래하는것으로알려져있다. 그러므로당귀에의하여이 NO가감소될수있는지알아보기위하여당귀를각각 0.078, 0.156, 0.313, 0.652, 1.25, 2.5, 5, 10 mg / ml농도로 RAW264.7에 LPS와같이처리하였다. Fig. 4에서보여주는바와같이 LPS만을처리한세포에서는 NO가증가하였으며, 당귀처리농도에따라각각 NO의농도가감소함을보여주었다. 이는당귀가염증반응의중요한원인인 NO를감소시킴으로서염증반응을막을수있음을제시하는것이다 (Fig. 4). Fig. 4. Inhibit the production of NO in RAW264.7 macrophages by Angelica gigas and Angelica acutiloba Ag-J : Angelica gigas from jeongsun. Ag-H : Angelica gigas from Hongcheon. Aa-H : Angelica acutiloba from Hongcheon. 결 론 원산지와기원을확인할수있는 3종의당귀를이용하여항산화효과, Apoptosis 억제, NO제거등의효과를측정하였다. 항산화효과의경우홍천산참당귀, 홍천산일당귀, 정선산참당귀순으로항산화능이나타났다. Apoptosis의경우는모든시료에서비슷한결과를타내었다. NO억제의경우모두농도의존적인결과를나타내었다. 특히, 참당귀의경우재배지에따라다른결과를보일수있음을알수있었다. 향후재배지가다른동일기원의당귀를대상으로성분및효능에대한추가적인연구가필요할것으로생각된다. 감사의 글 본논문의상지대학교 2005년후반기교내연구비와정선군농업기술센터의지원으로수행되었으며, 이에감사드립니다. 참고문헌 1. 신농본초경. 한림사, p 40, 1971. 2. 이동진, 강병수. 당귀의산지및부분별 Lipid 함량에관한연구. 대한본초학회지 4(1):23-33, 1989. 3. 윤혜란, 육장수. 토당귀성분연구. 경희약대논문집. 23(1):55-71, 1995. 4. 최돈우, 김상기, 김두한. 참당귀의유통경로별효율성분석. 식품유통연구, 20(2):23-44, 2003. 5. 유홍섭, 박충헌, 박춘근, 김영국, 박희운, 성낙술. 당귀의종별생육특성및생산성비교. 한약잡지, 12(1):43-36, 2004. 6. 이미영, 임성희, 주영승, 한경식, 정계진, 안덕균, 강헌철, 고병섭. RAPD 분석과뿌리의내부구조비교를통한당귀류의감별. Korean J. Medicinal Crop Sci. 8(3):243-249, 2000. 7. 노봉수, 오세연, 김수정. SAW센서를바탕으로한 GC를이용한국내산및수입산당귀의향기패턴분석. 한국식품과학회지 35(1):144-148, 2003. 8. 방경환, 유홍섭, 구달회, 조준형, 박희운, 성낙술, 방상일, 김홍식. 당귀내추대성품종및건재약재판별을위한 RAPD marker 선발. Korean J. Medicinal Crop Sci. 10(1):46-50, 2002. 9. 조민구, 방진기, 채영암. 참당귀와일당귀의부위별휘발성정유성분비교. Korean J. Medicinal Crop Sci. 11(5):352-357, 2003. 10. 성정숙, 방경환, 방축헌, 박춘근, 유홍섭, 박희운, 성낙술. 당귀의해부형태학적특징에따른기원판별. Korean J. Medicinal Crop Sci. 12(1):67-72, 2004. 11. 인문교, 강찬구, 정남일, 장우현, 뢰영조, 육장수. 중국산당귀, 천궁의정유성분 (Ⅱ). 경희약대논문집 28: 33-43, 2000. 12. 박종희, 이유진, 권성재. 한국산당귀의생약학적연구. Kor. J. Pharmacogn. 36(2):141-144, 2005. 13. 함문선, 김성우, 홍종수, 이진하, 정을권, 박영식, 이현용. 강원도산참당귀와일본산일당귀의생리활성성분탐색. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechol. 24(5):624-629, 1996. 14. 이문희, 윤수홍. 당귀수침액이흰쥐간기능장해에미치는영향. 한국위생과학회지 9(2):77-87, 2003. 15. 오석홍, 차연수, 최동성. 당귀의첨가식이가흰쥐의지방대사와알콜대사및간기능에미치는영향. 한국농화학회지 42(1):29-33, 1999. 16. 김형환, 이주호, 이제현, 안덕균, 박성규. 당귀의종류에따른사물탕이백서의흉부대동맥혈관이완에미치는영향. 대한본초학회지 16(2):29-34, 2001. 17. 강순아, 장기효, 이지은, 안덕균, 박성규. 한국, 중국, 일본당귀가 cyclophosphamide로유발된흰쥐의빈혈에미치는영향의차이. Korean J. Food Sci. Technol. 35(6):1204-1208, 2003. 18. 한진아, 장기효, 강순아, 조여원. Cyclophosphamide로유발된빈혈흰쥐에서참당귀열수추출물이혈액학적빈혈지표에미치는영향. 한국영양학회지 36(10):1013-1021, 2003. 19. 오하식, 김형환, 안덕균, 최호영. 당귀류가혈관신생에미치는영향에대한비교연구. 대한본초학회지 16(2):19-27, 2001 20. 송승현, 서부일, 김호경, 박지하. 토당귀, 일당귀및중국당귀가 Hydrocortisone acetate로유발된어혈병태모형에미치는영향. Kor. J. Herbology 19(1):13-21, 2004. 21. 한상균, 이병렬. 대한침구학회지. 당귀약침의혈해자입이 Intraluminal Filament 삽입술에의해유발된백서의허혈성 - 1161 -
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