특별기획 생체물질 - 당의중요성및응용 차형준 POSTECH 화학공학과교수해양수산부해양바이오산업신소재연구단단장 hjcha@postech.ac.kr 생체물질중현재까지 DNA 및단백질의중요성은많이언급이되어왔고, 이와관련된연구분야들이 genomics, proteomics로불리면서다양하게연구가진행되어왔다. 하지만, 다른중요한생체물질인당 (glycan) 또는탄수화물 (carbohydrate) 은그중요성이상대적으로덜부각되었다. 실질적으로당은포도당 (glucose) 및글루코겐 (glycogen) 의형태로생체의가장중요한에너지원으로사용될뿐아니라렉틴 (lectin) 과의상호작용을통하여면역반응에중추적인역할을하는생체물질이고, 세포벽을구성하는데있어서필수적인요소이다. 또한, 세포벽의구성성분으로존재하면서다른세포나단백질등과상호작용을하는역할을하고있다. 이러한다양한형태로의당에관한연구는 glycomics라불리며당단백질 (glycoprotein), 당지질 (glycolipid) 등과같이다른물질에결합 (conjugation) 이된형태로많이존재를하게된다. 최근에많이연구가되고이슈가되고있는바이오시밀러 (biosimilar) 도인간유래당단백질을의약품으로사용을하는것이다. 이에당의기본적인작용및생체내에서의기작에대한이해뿐만아니라 glycan-conjugation, glycosylation pattern 등당과관련된연구는무궁무진할뿐아니라, 이를통해서의약품, 바이오센서등활용범위또한광범위하다고할수있다. 본특별기획에서는당을이용한최근의연구동향및당과관련된연구에관하여간략하게소개하고자한다. 본특별기획을통하여향후당의중요성이강조됨과동시에연구자들의당연구에대한관심이증대되기를기대한다. 당사슬특이적결합렉틴 (Lectin) 이용기술 김성훈한국생명공학연구원전북분원선임연구원 seonghun@kribb.re.kr 1. 머리말 2003년휴먼지놈이완벽하게해독되었으나생명현상을설명하기엔단백질을코딩하는유전자의수가너무적다는것이밝혀짐에따라휴먼지놈해석 이후의생명현상을이해하기위한 포스트지놈 의연구로당생물학 (glycobiology) 이중요한이슈로부각되고있다. Post translational modification 중의하나인 glycosylation은세포내에서단백질, 지질, 세포표면 376 NICE, 제 34 권제 4 호, 2016
특별기획 (I) 에당사슬 (glycan) 의부착및탈착으로단백질의활성이나세포내의신호전달, 세포간의상호작용등과같은세포내의생명현상에직, 간접적으로관여하며이들중특정반응은질병을일으키는핵심메커니즘으로알려져있다. 생명자원으로부터다양한저분자및고분자천연물에대한다양한생리활성물질, 단백질, 천연신약개발의연구가활발히이루어져왔으나, 최근다양한질병및미생물, 바이러스감염시당사슬이매개되는것이밝혀짐에따라, 이들천연물중당성분포함하는당단백질 (glycoprotein), 당지질 (glycolipid), 올리고당 (oligosaccharide) 등의당사슬 (glycan) 및당복합체 (glycoconjugate) 와결합하는렉틴 (lectin) 등의신규소재에대한관심이고조되고있다. 2. 특이적당사슬구조에결합하는렉틴렉틴 (Lectin) 은미생물에서고등동물에이르기까지존재하는당사슬에결합할수있는단백질의하나로, 생명체에있어당사슬과의특이적인결합을통해 protein quality control, host-pathogen interaction, cell-cell communication, inflammation, immune response, cancer progression, development등다양한생명현상에관여한다고알려져있다. 렉틴은 multivalent, 효소의활성을포함하지않고, 항체의성격을포함하지않는단백질로, 19세기말러시아의 Sillmark에의해최초로 Ricinus communis에서분리된이후, 현재까지 Concanavlain A(ConA) 를비롯하여 40여종의렉틴이연구및다양한용도로사용되고있다 [1]. 최근분자생물학및생화학의진보로염기서열및단백질구조에따라렉틴을다양한그룹으로분류하기시작했으며, 원천 (origin) 에따라크게는식물 (plant lectin families) 및동물 (invertebrate/vertebrate lectin families) 렉틴으로분류하고있으며, vertebrate lectin은다시그특성에따라 C-type ( 만노즈결합렉틴 : mannose-binding lectin, MBL), S-type (galectin: β-galactoside-binding lectin), P-type (mannose- 6-phosphate bindg lectin), I-type (selectin), 그리고단백질구조적으로 cyclic pentameric 형태를갖는 Pentraxin 으로분류한다 [1]. 고등동물에서외래의항원이침입했을때면역반응시스템에의해외래물질에선택적으로작용하는항체가외부의항원을인지하고면역시스템을발달시켜제거하는것과같이, 항체대신에렉틴이이와같은유사한작용을하는것으로추정되고있는데, 특히면역시스템 (immunsystem) 이결핍된무척추동물 (invertebrate) 이나식물, 그리고버섯등과같은생명체에면역반응의대체시스템에서잘발달되어있다. 비록미생물에서고등동물에이르기까지모든종에서다양한렉틴이존재하나, 무척추동물, 식물, 버섯등에서주로많이발견되기때문에, 현재이용가능한거의대다수의렉틴이이러한종에서분리되어왔다 [1,2]. 이중식물렉틴은식물체의잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화분등거의식물체의모든부분에존재하며수확이가능한씨와구근에서도발견되기때문에용이하게렉틴을정제할수있는장점으로많은정제가식물체를대상으로이루어졌다. 식물유래의렉틴은면역작용 (immune function), 해충으로부터자기방어, 알레르기를일으켜동물로부터자기방어, 항곰팡이성작용, 항바이러스작용, 식물및미생물간의세포간상호작용을통한공생미생물의특정부위로 colonization, 영양분및금속이온의전달및저장, 냉온으로부터식물조직체의보호, 세포내효소의활성증대를위한파트너로써의작용, 그리고당단백질의 trafficking 등다양한기능이알려져있는데, 이들모든작용은당사슬과의선택적결합을통한렉틴의작용으로이루어진다고보고되어있다 [1-3]. 3. 렉틴이용한당사슬측정및응용기술개발동향 렉틴은당사슬의구조를인지하여결합하기때 NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 34, No. 4, 2016 377
특별기획 (I) 문에항체와같이다양한응용기술개발에활용될수있다. 당사슬과렉틴의상호결합력을이용하여 ELISA, mutant cell selection, blood typing, histochemical staining, glycosyltransferase/glycosidase assay, cell sorting, glycoconjugate purification 등다양한당복합체가관련된생체분자의인지와분리정제에활용가능하다 ( 그림 1). 특히단클론항체 (monoclonal antibody, mab) 가인지하지못하는 N-결합당사슬 (N-linked glycan)/o-linked glycan(o-linked glycan) 의당사슬구조를측정할수있을뿐아니라 mab에비해가격이저렴하고, 비동물성유래의소재로인하여동물윤리적측면에서단백질소재의이용에자유롭다고할수있다 [4]. 특이적당사슬구조결합을하는렉틴특성을이용하여, 특정질병발병시세포표면에존재하는당단백질, 당지질, 올리고당의변화를다양한렉틴을이용하여조기측정하고, 질병을일으키는핵심세포표면의당사슬이나바이러스및미생물표면의당사슬을렉틴을이용해 aggregation 시켜신체내에면역시스템에의해질병을퇴치하는방법이현재동물실험을통해연구되고있다 [4-7]. 스위스연방공과대학교 (ETH Zürich) 미생물연구소의 Prof. Dr. Abei, M./Dr. Künsler, M. 그룹에서는버섯종류인 Coprinopsis 유래의 galectin을대상으로연구가진행되고있다 [8]. Coprinopsis 유래의 galectin family인 CGL-2, CGL-3 등을발굴하고생화학적특성및단백질구조규명을통해당사슬결합선택성을확인한후, 이를꼬마선충 (C. elegans) 모델을통해 CGL-2가선충의장 (gut) 내존재하는당사슬에결 합하여대사작용및선충의운동성을저해시킨다는것을규명해냈다 ( 그림 2). 이결과를바탕으로 2010 년 5월 ETH Zürich spin-off 기업으로 Malcisbo를설립하였으며, 당해 11월에는스위스기술대상 (Swiss Technology Award) 을수상하였다. 이기술은당사슬결합특이적렉틴을이용하여초기에박테리아및바이러스표면에결합을갖는렉틴을이용하여초기에항생제없이병원체의감염을제어하는기술로각광받고있다. 영국임페리얼컬리지 (Imperial college) 의 Prof. Dr. Ten Feizi 교수그룹은형광라벨링된렉틴을이용하여병원성미생물, 바이러스, 암세포특이적인당사슬이포함되어있는 carbohydrate array를측정하는기술을개발하였다 ( 그림 2)[9]. 이기술은질병을일으키는감염성질환및암세포특이적인당사슬마커를렉틴의선택적인결합력으로측정하는방법으로 glycan array 개발을위한최초의시도로평가되고있다. 이후미국의 CFG (Consortium for functional glycomics) 는이기술을진보시켜현재 500여개의당사슬이포함되어있는 mammalian glycan array ver. 5.0을개발하였다. 향후다양한당사슬과해당당사슬선택적렉틴개발에따라, 이기술은빠르게진보할것으로예상되고있다. 미국의조지아대학교 (University of Georgia) 의복합탄수화물분석센터 (Complex Carbohydrate Research Center, CCRC) 에서는세포내당사슬을포함하는당사슬의당단백질, 당지질, 올리고당에서선택적당사슬을분리하기위해렉틴을특정레진에결합하여소형컬럼을제작하였고, 이를이용하 그림 1. 당사슬결합특이적렉틴의생체분자인지및당복합체정제를위한응용기술 [4] 378 NICE, 제 34 권제 4 호, 2016
특별기획 (I) 여소량의시료에서당사슬을농축하여 MS를이용해분석하는기술을개발하였다 ( 그림 2)[10]. 현재이기술은 96 well plate 렉틴컬럼을이용한 high throughput screening (HTS) 시스템으로다중당사슬분석기법으로활용되고있다. 이러한렉틴의이용기술이외에도최근에는광학현미경기술의발전과다양한형광 probe 합성과더불어렉틴의당사슬에대한선택적결합특이성을이용하여, 특정세포및바이러스, 미생물의표면에존재하는당사슬을인지하여세포를측정하여조기에암세포의발견, 세포내특정단백질의위치확인, 세포간의상호작용, 바이러스및미생물의세포내침입등을관찰하는당을매개로한생명체의이미지측정에광범위하게사용하고있다 [5-7]. 현재까지개발되어상용화되어있는렉틴은식물, 동물, 미생물등의다양한생명체로부터분리되어시알산 (Neu5Ac, Neuraminic acid), 갈락토즈 (Gal, galactose), N-아세틸갈락토사민 (N-GalNAc, N-acetylgalactosamine), 퓨코즈 (Fuc, Fucose), 만노즈 (Man, Mannose), 글루코스 (Glc, glucose) 의기본모노머를측정할수있는렉틴알려져있다 [3]. 하지만, 당사슬의구조상알파 (alpha), 베타 (beta)-결합(linkage) 의다양성과당사슬체인구성시모노머간의결합 조합 (combination) 의다양성, 또한 α-/β-linkage 및 combination으로경우수백, 수천종이상의다양한당사슬의구조가이론적으로자연계에존재하며, 실제적으로현재까지개발된렉틴의경우그수가적으며, 특정렉틴의경우추출된단백질형태이기때문에비선택적결합을보이는단점으로정확한당사슬의구조를측정하는데한계가있다. 따라서정확한당사슬의결합을구분할수있는신규렉틴의발굴과응용기술개발이필요하다고할수있다. 4. 맺음말이와같이렉틴및렉틴과당사슬을매개로일어나는생명체의생화학적, 생리학적대사작용뿐아니라, 병원성미생물감염기작이당사슬및당사슬결합렉틴과직접적인연관성이있다는것이밝혀짐에따라, adhesion 저해를통한미생물감염기작억제등과같은항생제의대체물질발굴, 당사슬의분리및분석, glycan microarray 기술, 렉틴기반의세포이미징기술등의연구와응용기술개발이더욱활발히진행될것으로예상된다. 특히현재관심이고조되고있는바이오시밀러의료용당단백질의생산, 인체내에서당사슬합성, 당사슬대사과정의문제로생기는질병, 당사슬을매개로일어나는바이러 그림 2. 렉틴의특정당사슬을결합하는메커니즘을활용한농축산분야및메디컬분야에서의응용기술개발사례 [8-10] NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 34, No. 4, 2016 379
특별기획 (II) 스, 미생물의감염기작등에광범위하게사용될것으로전망한다. 참고문헌 [1] A. Varki, M.E. Etzler, R.D. Cummings, J.D. Esko, Discovery and classification of glycan-binding proteins. In Essentials of glycobiology (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2009). [2] A. Varrot, S.M. Basheer, A. Imberty, Curr. Opin. Struct. Biol. 23, 678 (2013). [3] Y. Kobayashi, H. Kawagishi, Fungal lectins: a growing family. In Hirabayashi, J. ed. Lectins methods and protocols, Methods Mol. Biol. 1200. Humana Press, New York (2014). [4] R.D. Cummings, M.E. Etzler, Antibodies and Lectins in Glycan Analysis. Essentials of glycobiology (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, (2009). [5] D.H. Dube, C.R. Bertozzi, Nat. Rev. Drug Discov. 4, 477 (2005). [6] H. Ghazarian, B. Idoni, S.B. Oppenheimer, Acta Histochem. 113, 236 (2011). [7] H.-J. Gabius, H. Kaltner, J. Kopitz, S. André, Trends Biochem. 40, 360 (2015). [8] K. Stutz, A. Kaech, M. Aebi, M. Künzler, M.O. Hengartner, PLoS One DOI: 10.1371/journal.pone.0129381 (2015). [9] Y. Liu, A.S. Palma, T.Feizi, Biol. Chem. 390, 647 (2009). [10] D.F. Cortes, J.L. Kabulski, A.C. Lazar, I.M. Lazar, Electrophoresis 32, 14 (2011) 탄수화물마이크로어레이 (Glycan microarray) 의발전과응용 김창섭영남대학교화학생화학부조교수 cskim1409@ynu.ac.kr 1. 머리말게놈프로젝트를통해생명체내의모든기능들이유전체내에암호화되어있지않다는것을깨달은후생체내에존재하는고분자중하나인탄수화물분자에관심을가지게되었다. 생체내의탄수화물은다양한생체물질인지질및단백질과결합된형태로존재하며단백질과의상호작용을통해서다양한역할들을한다고알려져있다 ( 그림1). (1) 따라서생체내의탄수화물과단백질간의상호작용을분석함으로써탄수화물 (carbohydrate) 의생물학적인역할과생명체내의생명현상들을이해하는데에중요한정보를제공할수있다. 이상호작용을효율적으로생체외에서분석하기위해 DNA나 protein 연구에서사용된마이크로어레이기술 (microarray technology) 이제안되었다. 탄 수화물은 DNA나단백질과달리주형 (template) 없이특정한효소들에의해합성되기때문에대량생산이어렵고생체내에서높은순도로분리하는것또한쉽지않다. 이로인해소량의탄수화물을이용하여분석할수있는분석기술이절실히필요하다. 마이크로어레이 (microarray) 기술은작은양의샘플을이용하여수십개에서수천개의샘플들의상호작용들을빠르고동시다발적으로분석할수있다는장점을가지고있다. 따라서, 탄수화물의생물학적인역할을분석할수있는기술로탄수화물마이크로어레이 (carbohydrate microarray) 기술이큰관심을받고있다. 2. 본론 2-1. 탄수화물고정화 (carbohydrate immobilization) 방법 380 NICE, 제 34 권제 4 호, 2016
특별기획 (II) 그림 1. 세포내에서의탄수화물과단백질간의상호작용 (Bertozzi et al., Science, 2001 [1]) 탄수화물한분자와단백질을구성하는하나의 서브유닛 (subunit) 과의결합세기는 DNA-DNA나 protein-protein에비해매우약하다. (2) 낮은결합력은 탄수화물마이크로어레이 (carbohydrate microarray) 상에서탄수화물과관련된상호작용을분석하는것을어렵게한다. 따라서, 탄수화물과단백질을구성하는서브유닛간의다가의상호작용 (multivalent interaction) 을통해서결합세기를증가시키는것이매우중요하다. 이를위해탄수화물마이크로어레이 (microarray) 상에탄수화물을고정시킬때탄수화물의방향성과표면과탄수화물사이의거리를조절하는것이매우중요한단계이다. 즉, 적당한 linker를사용하여탄수화물과표면사이에적당한공간을부여하여단백질을구성하는서브유닛으로의접근성을높이고탄수화물을잘노출시키는것이다. 비공유결합 (noncovalent bonding) 를이용한고정화방법과공유결합 (covalent bonding) 을이용한고정화방법이이용되어왔다. (3) 비공유결합을이용하는것은소수성표면에탄수화물을소수성상호작용 그림 2. 탄수화물마이크로어레이를제작하기위한탄수화물의공유결합적고정화방법 (Park et al., Chem. Soc. Rev., 2013 [3]) NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 34, No. 4, 2016 381
특별기획 (II) 을통해고정화하는하는방법으로초기에는이방법을이용하여탄수화물을고정화하여탄수화물마이크로어레이 (carbohydrate microarray) 를제작하였지만이방법의탄수화물고정화는탄수화물의크기및분자량에영향을받는다. 다당류탄수화물을니트로셀룰로오즈 (nitrocellulose) 또는 polystyrene으로변형된슬라이드에고정화하는것이대표적인예이고작은분자량의탄수화물을사용할경우쉽게떨어질수있는단점을가지고있다. (4) 탄수화물의크기및분자량에영향없이다양한탄수화물들을효율적으로고정화하여마이크로어레이 (microarray) 를제작할수있는공유결합을이용한고정화방법이현재개발되고이용되고있다. 적당한 space와기능기를가지는 linker를이용하여탄수화물의환원당 (reducing sugar) 을변형시켜특정한반응기 (functional group) 을도입하고이반응기와결합하는기능기 (functional group) 으로처리된표면에고정화하는기술이공유결합을이용한고정화방법이다 ( 그림 2). 기존의공유결합을이용한고정화방법은고정화된탄수화물이생체물질간의접근성을높이기위해복잡한화학반응들을이용하여고정화된탄수화물과표면사이에적당한공간과탄수화물의방향성을부여하였다. 이방법은접근성을높임으로써단백질과탄수화물간의상호작용분석을용이하게 만들었다는장점을가지고있으나매우복잡한화학반응과정을이용하고있어서전문가이외에는탄수화물마이크로어레이 (carbohydrate microarray) 를이용하여단백질과탄수화물간의상호작용을분석하는데제한이있다. 따라서, 생체물질로의접근성을높이면서제작이쉬어야만탄수화물마이크로어레이 (carbohydrate microarray) 가 DNA 마이크로어레이 (DNA microarray) 나 protein 마이크로어레이 (protein microarray) 처럼다양한응용분야들에적용될가능성이높아진다. 이를위해몇가지방법들이제안되고개발되고있다. 한가지예로, 2개의 primary amine group을가진 4-(2-aminoethyl)aniline과환원성아미노화 (reductive amination) 반응을통해한번의단계로 amine group를가지는탄수화물을만들었으며, 그탄수화물을엔-하이드록시석신이미드 (N-hydroxylsuccinimide) 를가진유리슬라이드에고정화함으로써탄수화물마이크로어레이 (microarray) 를쉽게제작하였다 ( 그림 3). (5) 이방법은쉽게제작할수있고단백질-탄수화물간의상호작용을분석할수있다는장점을가지고있으나이방법또한해결하고최적화해야할부분들이존재한다. 2-2. 탄수화물마이크로어레이의응용탄수화물마이크로어레이 (carbohydrate microarray) 그림 3. 탄수화물마이크로어레이제작을위한간단하고빠른탄수화물고정화방법 (Seo et al., Nanotechnology, 2010 [5]) 382 NICE, 제 34 권제 4 호, 2016
특별기획 (II) 는탄수화물과 lectin( 당과결합하는단백질 ) 간의상호작용의 profiling, 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan) 과성장인자 (growth factor) 그리고시토킨 (cytokine) 간의상호작용분석, 병원균인지하는항체및암을인지하는항체 profiling, 탄수화물과바이러스 (virus) 나박테리아 (bacteria) 간의상호작용분석, 탄수화물기반의약개발등다양한응용분야에사용되고있다 ( 그림 4). (6)-(7) 한가지예로, 병원균이나병원균에의해분비된독소가인간세포표면에존재하는탄수화물과의상호작용을통해세포안으로침입하여질병을일으킨다는점을착안하여탄수화물마이크로어레이는이독소단백질과의상호작용을분석하고검출하는데에이용되었다. 콜레라는음식이나물을통해감염되며병원균비브리오콜레라에의해생산된콜레라독소에의해생기는질병이다. 콜레라독소는세포표면에존재하는지엠원오당류 (GM1 pentasaccharide; 5가지의단당류로이루어진탄수화물 ) 와의상호작용을통해세포안으로들어와질병을일으킨다. 콜레라독소와탄수화물간의상호작용을효율적으로분석하고이를검출하기위해지엠원오당류, 구조적으로유사한탄수화물들, 그리고지엠원오당류를구성하는이당류와단당류등 7가지의탄수화물들로구성된기능성탄수화물마이크로어레이를제작하여콜레라독소 그림 4. 탄수화물마이크로어레이의응용 (Liang et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2008) 그림 5. 탄수화물마이크로어레이상에서기질과콜레라독소간의상호작용에대한정량적인분석 (Kim et al., Aanl. Chem., 2012 [7]) 가결합하는탄수화물의선호도와콜레라독소의복합체형성에따른결합하는탄수화물의선호도및결합력의차이를효율적으로분석하였으며 23 pm의낮은농도의콜레라독소까지검출함으로써탄수화물마이크로어레이의응용가능성을보여줬다 ( 그림 5). (7) 3. 맺음말기능성탄수화물마이크로어레이의개발은질병과관련된상호작용을분석및진단할수있을뿐만아니라탄수화물기반의백신의특성분석및개발, 의약품개발그리고당과관련된효소들의특성분석등다양한응용분야들에서성공적으로사용될것으로기대된다. 4. 참고문헌 (1) C. R. Bertozzi, L. L. Kiessling, Chemical glycobiology. Science, 291, 2357 (2001) (2) M. Mammen, S.-K. Choi, G. M. Whitesides, Polyvalent interactions in biological systems: Implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew. Chem. Int. Ed., 37, 2754 (1998). (3) S. Park, J. C. Gildersleeve, O. Blixt, I. Shin, Carbohydrate microarrays. Chem. Soc. Rev. 42, 4310 (2013). (4) D. Wang, S. Liu, B. J. Trummer, C. Deng, A. Wang, Carbohydrate microarrays for the recognition of crossreactive molecular markers of microbes and host cells. Nat. Biotechnol. 20, 275 (2002). (5) J. H. Seo, C. S. Kim, B. H. Hwang, H. J. Cha, A functional carbohydrate chip platform for analysis of carbohydrate-protein interaction. Nanotechnology, 21, 215101 (2010). (6) P.-H. Liang, C.-Y. Wu, W. A. Greenberg, C.-H. Wong, NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 34, No. 4, 2016 383
특별기획 (III) Glycan arrays: biological and medical applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 12, 86 (2008). (7) C. S. Kim, J. H. Seo, H. J. Cha, Functional interaction analysis of GM1-related carbohydrates and Vibrio cholera toxins using carbohydrate microarray. Anal. Chem. 84, 6884 (2012). 당 (Carbohydrate) 의생체물질상호작용분석기술 서정현영남대학교화학공학부조교수 jhseo78@yu.ac.kr 1. 머리말세포내에서생체물질은생물학적반응을조절하고중재하는역할을한다. 일부의생체물질들은다른생체물질의도움없이독자적으로생체내에서기능을하기도하지만, 생체내에서생물학적인반응의대부분은생체물질들간의상호작용을통하여일어나게된다. 이러한상호작용의과정에서생체물질들은복합체를형성하게된다. 때문에이러한생체물질들간의상호작용에관한연구는생물학적반응을이해하는데기본적인바탕이된다. 생체내에서당 (carbohydrate) 은단백질의 folding이나단백질을안정화시키는역할을할뿐만아니라세포와세포간의 communication 혹은면역학적반응에있어서중요한역할을하는생체물질로알려지고있다. 따라서, 이러한당에관한연구는살아있는유기체의생물학적인과정에대한중요한정보를제공할뿐아니라, 잠재적인신약개발에있어서많은도움을줄수있을것으로판단된다. 당과단백질의상호작용연구를위한목적단백질로 Vibrio cholera toxin protein이가장잘알려져있을뿐아니라 GM1 pentasaccharide와의상호작용정도또한상당하다고알려져있다. 이독성단백질은 27 kda의 CtxA와 12 kda의 CtxB로이루어져있다. CtxB의경우 pentamer를형성하여세포막에위치하는 ganglioside GM1과상호작용을하게된다. Cholera toxin이 ganglioside GM1과상호작용시 CtxA 와 5개의 CtxB가복합체를형성한후 ganglioside GM1 pentasaccharide와결합한다. 이러한상호작용후세포내감염기작을일으키게된다. 상호작용의특징을간단히살펴보면 CtxB monomer 는 GM1 pentasaccharide와 1:1로결합하는특징을가지고있지만, 이러한결합만으로는세포내감염을일으키지못한다. CtxAB 복합체를형성한후감염기작이일어나는것으로알려져있다. Cholera toxin의감염기작에관한연구는어느정도보고가되어있으나, 그상호작용에관한연구는아직잘밝혀지지않았다. 한연구그룹에서는이러한상호작용에있어서 CtxB 그림 1. 당의생체내에서의다양한기능및활용 (http://www1.gifu-u.ac.jp/~kassei1/icems_gifu/newpage7.html) 384 NICE, 제 34 권제 4 호, 2016
특별기획 (III) 가 GM1과결합한것보다 CtxAB 복합체가 GM1과결합시결합정도가더강하다고보고하였다. 이러한상호작용을분석하기위하여 non-labeling system 인 surface plasmon resonance (SPR), electrochemical detection, 그리고 atomic force microscopy (AFM) 을이용한결과를소개하고자한다. 2. 당의표면고정화방법개발다양한분석방법에당을이용하기위하여새로운방법의당고정화방법이개발되었다. 그림 2에서살펴볼수있듯이여러특이적인화학결합을통하여 chip으로사용하는 glass표면에당을고정화하는연구들이많이보고가되어왔다 [2]. 하지만, 기존의보고가된당고정화방법들은당구조가복잡하고, 당의변형과정중구조가깨지는문제점들때문에복잡한구조의당들은고정화시키기어려웠다. 또한, 당지질인 ganglioside GM1을고체표면에고정화시키기위하여복잡한과정을거치고, 간접적인방법들을이용하였다 [2-4]. 본특별기고에서소개하려는당고정화방법은다양한종류의당들은직접적인방법을이용하여금표면에고정화시키기위한방법이다. 당의환원당부분의 aldehyde group과 aminophenyl sulfide의아민 (NH2-) 그룹을결합시켜서씨올 (SH-) 그룹을가질수있도록변형하였다. 이러한당은금표면에직접적으로고정화될뿐만아니라, 환원당부분을변형시켰기때문에당의활성부분은그대로유지된상태로금표면에고정화한다는특징을가지고있다. 따라서이러한당고정화방법은당과관련된연구에폭넓게이용될수있을것으로생각된다. 3. 당단백질의상호작용분석상호작용의분석결과, 우선적으로아직까지보고가되지않은 CtxA와 CtxB간의상호작용은세가지분석방법을통하여얻어진결과로볼때비록세포내감염기작을일으키기위해서 ctxa와 ctxb가복 그림 2. 공유결합을통한당의고정화방법 (Shin et al, 2005 [2]) 합체를형성해야하지만, 두단백질간의상호작용은일반적인 ligand-receptor와의상호작용과거의유사한값을구할수있었다 (184 pn). 기존의보고들은주로 CtxB와 GM1간의상호작용을 SPR이나 ITC와같은비교적정성적인분석방법들을이용하여분석하였다. 본연구에서는 CtxAB와 GM1간의상호작용을분석함과동시에상호작용시 GM1 pentasaccharide에서 monosaccharide의역할을밝히기위한연구를수행하였다. CtxB-GM1 상호작용과 CtxAB-GM1간의상호작용을분석한결과정성적인분석방법인 SPR과전기화학분석결과에서는 CtxB-GM1간의상호작용 NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 34, No. 4, 2016 385
특별기획 (III) 그림 3. 금표면에당의고정화를위한당의변형 (Seo et al. 2007, 2011 [5,6]) 이더강한 affinity를나타내는결과를보여줬다. 하지만, AFM을이용한 force의값에서는 CtxAB-GM1 간의상호작용이약 90 pn 더큰결합정도를나타냈다. 위의두분석방법에서 ctxb-gm1간의상호작용이더강하게나타난이유는사이즈가큰 CtxAB 와 GM1상호작용시 steric hindrance때문에결합의방해를일으켰다고결론지을수있다. CtxB의경우 MALDI-ToF를이용한질량의분석결과 monomer 부터 pentamer까지존재하기때문에, 상호작용시 CtxAB보다결합이쉽게이루어질수있어서이와같은결과를나타냈을것으로생각된다. 하지만이러한 steric hindrance문제가적용되지않은 AFM을이용한분석방법은직접적인분석방법이기때문에상호작용에관한정확한정보를제공하였다고생각된다. SPR의분석결과 sialic acid가없는 asialo GM1의 association rate값이가장낮게나왔기때문에상호작용시 recognition 역할을할것으로생각되고, terminal galactose가없는 GM3의경우 dissociation rate정도가크게나타났기때문에 stabilization역할을하는것으로분석되었다. Merritt의보고에따르면 X-ray crystallography분석결과 CtxB와 GM1간의상호작용시 Two fingered grip model을제시하였다 [10]. 본연구의결과에서도 GM1과유사한 two finger grip형태를가지는 LST-b의경우결합정도가높게나타남을확인하였다. 따라서 CtxAB와 GM1간의상호작용시이러한형태의구조가중요함을확인하였다. 또한, 다른당이 CtxAB와상호작용시재배열을통하여결합한다는사실도확인하였다. 전기화학의분석방법에는다른방법들과다르게 potential shift의변화를통하여상호작용의 specificity를확인하였다. 4. 맺음말본연구에서는당과단백질간의상호작용을분석하기위한기반기술로새로운방법의당고정화기술을개발하였다. 이러한당고정화방법은많은장점을가지고있기때문에당과관련된생체모방기술에다양하게이용될수있을것으로생각된다. Vibrio cholera toxin단백질과 ganglioside GM1간의상호작용분석결과에서는 CtxA가상호작용에있어서결합정도를강화시킴을확인하였다. 또한상호작용에있 386 NICE, 제 34 권제 4 호, 2016
특별기획 (III) 그림 4. 다양한당 - 단백질상호작용분석방법 (Seo et al. 2011, 2012, 2013 [7-9]) 어서 sialic acid와 terminal galactose가중요한역할을한다는것을확인하였다. 또한, 이러한상호작용시 GM1의 two fingered grip형태가상호작용에있어서중요하다는것을확인하였다. 본연구에서이용한각각의분석방법들은장점과단점을동시에가지고있으며, 분석방법마다얻을수있는정보가다르기때문에상호작용의분석시다양한분석방법을통한다면상호작용에대한보다정확한정보를얻을수있을것으로생각된다. 이러한당의고정화에대한연구및당과의상호작용에관한연구는 genomics, proteomics 연구에이어서, 최근에각광을받고있는 glycomics 연구에대한폭넓은이해를할수있을것으로여겨진다. 참고문헌 1. C.R. Bertozzi and L.L. Kiessling, Science, 291, 2357(2001) 2. I. Shin, S. Park and M.R. Lee, Chem-Eur. J., 11, 2894(2005). 3. S.J. Park, I.J. Shin, Angew. Chem. Int. Edi. 41, 3180(2002). 4. M. Lee and I. Shin, Org. Lett. 7, 4269(2005). 5. J.H. Seo, K. Adachi, B.K. Lee, D.G. Kang, Y.K. Kim, K.R. Kim, H. Lee, T. Kawai and H.J. Cha, Bioconjugate Chem. 18, 2197(2007). 6. J.H. Seo, C.S. Kim, B.H. Hwang and H.J. Cha, Nanotechnology 21, 215101(2010). 7. J.H. Seo, C.S. Kim, H.Y. Lee, T. Kawai and H.J. Cha, Anal. Chem. 83, 6011(2011). 8. J.H. Seo, H.Y. Lee and H.J. Cha, Analyst 137, 2860(2012). 9. J.H. Seo, C.S. Kim and H.J. Cha Analyst 138, 6924(2013). 10. E.A. Merritt, S. Sarfaty, F. Vandenakker, C. Lhoir, J.A. Martial and W.G.J. Hol, Protein Sci. 3, 166(1994). NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 34, No. 4, 2016 387