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cdna Microarray Experiment: Design Issues in Early Stage and the Need of Normalization Byung Soo Kim, Ph.D. 1, Sunho Lee, Ph.D. 2, Sun Young Rha, M.D., Ph.D. 3,4 and Hyun Cheol Chung, M.D., Ph.D. 3,4 1 Department of Applied Statistics, Yonsei University, Seoul 120-749, Korea; 2 Department of Applied Mathematics, Sejong University, Seoul 143-747, Korea; 3 Cancer Metastasis Research Center, College of Medicine, Yonsei University, Seoul 120-752, Korea; 4 Brain Korea 21 Project for Medical Science, College of Medicine, Yonsei University, Seoul 120-752, Korea Purpose: The cdna microarray has become a useful tool for observing the expression of thousands of genes simultaneously. However, obtaining good quality microarray data is not easy due to the inherent noise at various stages of the experiment. Therefore, it is essential to understand the source of the variation in the microarray experiment and its size as an initial step of the data analyses. Materials and Methods: The total RNA extracted from HT-1080 fibrosarcoma and normal rat tissues were hybridized to the cdna microarrays with 0.5 K human and 5 K rat genes, respectively. A homotypic reaction and dye swap experiments were used to identify the sources of the variation. Results: The relative fluorescent intensities of the microarray, if unnormalized, have a large variation, particularly in the lower intensity region. The distribution of the log intensity ratios also exhibit some departure from a band around zero, which is the distribution pattern expected when the majority of genes in the microarray are not regulated. Normalization of the log ratios is usually required as a means of preprocessing the data. We claim that a within-print tip group, an intensity-dependent normalization through a loess fit adjustment will be useful for this purpose, particularly in the initial stages of the microarray experiment. Conclusion: For proper data analysis, an understanding the source of the variation and preprocessing of data with a suitable normalization method will be important. It is important to have an interactive cooperation between a researcher and a statistician from the early stages of the study design and to the final stages of data analysis. (Cancer Research and Treatment 2003;35:533-540) Key Words: cdna microarray, Homotypic experiment

Byung Soo Kim, et al Variations of cdna Microarray and Adequate Normalization Method 539 Fig. 6. M-A plots of 5 K rat cdna microarray. (A). Black and orange circles denote M values before and after within-print tip group intensity-dependent normalizations. (B) and (C) represent box plots of M values with respect to 16 print tips before and after within-print tip group intensity-dependent normalizations. We may note in (B) that print tips corresponding to 4, 8, 12 and 16 yield lower M values relative to the other print tips. These four blocks are located at right edges of the array and thus this effect is referred to as the edge effect, a special type of the spacial effect. 위상관 계수를 사용하였다. 색하고자 하는 차이(δ), 제1종 오류의 확률(α), 제2종 오류 의 확률(β), 그리고 관찰치의 분산이 주어졌을 때 결정된 고 찰 다. 그러나, 한 마이크로어레이에 점적되어 있는 수천 수 만개의 유전자들의 발현 정도의 분산이 일정하지 않고, 그 cdna 마이크로어레이 실험은 전술한 바와 같이 여러 단 계를 거치며 각 과정마다 오차가 개입될 수 있으므로 우선 크기가 또한 알려져 있지 않으므로 현재까지의 이론으로 n을 계산하는 것은 어렵다(16,20,21). 적절하게 설계된 초기 실험에서 각 단계별 오차의 크기를 파악하고, 그 유형과 의미를 파악하는 것이 중요하다. 우선 결 론 마이크로어레이 실험을 통하여 해결하려는 생물학적 질문 을 통계적 질문으로 전환하는 과정이 있어야 한다. 이 과정 cdna 마이크로어레이 실험은 여러 단계의 과정을 거치 에서 각 단계별 오차를 줄일 수 있는 실험설계 및 분석방법 고, 매 단계마다 오차가 개재될 수 있으므로, 재현성 있는 선정이 필수적이므로 통계전문가와 미리 상의하고, 진행 실험 결과를 얻기까지는 상당한 시간이 소요되는 실험이 과정에서 지속적인 의견교환이 바람직하다. 다. 초기 실험에서는 변동원과 그 크기를 파악하는 것이 매 복제관찰치의 크기를 어느 수준으로 하여야 하는가는 아 우 중요하고, 이를 위하여 1 1 상동 실험과 복제관찰 실험 직 미해결의 문제로 남아있다. 일반적으로 표본크기 n은 검 을 시행하여야 한다. 이러한 과정에서 적절한 표준화가 필