Polymer(Korea), Vol. 33, No. 6, pp 515-519, 29 Folate 가수식된 Poly((R)-3-hydroxy butyrate)-poly(ethylene glycol) 나노입자를이용한표적지향형약물전달체 권승호ㆍ김영진 충남대학교공과대학바이오응용화학과 (28년 9월 3일접수, 29년 9월 11일수정, 29년 9월 14일채택 ) Targeted Drug Delivery Carriers Using Folate Conjugated Poly((R)-3-hydroxy butyrate)-poly(ethylene glycol) Nanoparticles Seung Ho Kwon and Young Jin Kim Department of Applied Chemistry & Biological Engineering, Chungnam National University, 79, Daehangno, Yuseong-gu, Daejeon 35-764, Korea (Received September 3, 28; Revised September 11, 29; Accepted September 14, 29) 초록 : 생분해성고분자인 poly((r)-3-hydroxy butyrate) 와 poly(ethylene glycol) 을결합시켜양친성이중블록공중합체를형성하였고, 표적인자인 folate 를수식하여특정암세포에표적화하도록설계하였다. 이공중합체는수용액상에서미셀을이루며, DLS 로측정한결과, 125 156 nm 의크기였고, 동결건조하여 SEM 으로관찰한결과구형임을확인하였다. 여기에소수성약물인 griseofulvin 을사용하여, 35 56% 의봉입률을나타내었다. 약물은 in vitro 상에서 24시간동안지속적으로방출되었다. 세포생존율을측정하여, folate 가수식된입자가그렇지않은입자보다약 1% 더낮은세포생존율을보임으로써표적지향효과가있다는것을알수있었다. Abstract: Biodegradable poly((r)-3-hydroxy butyrate) and poly(ethylene glycol) was conjugated to make amphiphilic di-block copolymer. Folate was conjugated at di-block copolymer to target the cancer cells. Copolymer was ready to form the self-assembled micelle whose size was 125 156 nm in aqueous solution. Griseofulvin as a hydrophobic drug was loaded in nanoparticles. Their loading efficiencies were 35 56%. Hydrophobic drug was continuously released for 24 h. Cell viability test showed that folate attached particles were 1% more efficient than the particles without targeting ligands. Keywords: PHB, PEG, folate, targeting, drug delivery. 서 현재암치료에사용되는항암제의대부분은강한독성, 항암제내성등의문제점을가지고있다. 항암제는세포독성약물로서암세포뿐만아니라, 정상세포에도독성을끼치는부작용을나타낸다. 세포의증식이활발히일어나는골수, 모낭, 위장관내피세포등은항암제의영향을많이받기때문에약물치료를받는환자들은골수에서만들어지는면역에관계되는세포들에대한부작용이크다. 면역에관계된백혈구의감소, 혈액응고에관련한적혈구, 백혈구및혈소판의감소등으로, 세균감염, 자연출혈, 메스꺼움및구토등의부작용을겪게된다. 1,2 따라서, 기존항암제의부작용을줄이고효능을극대화하기위하여암세포의특정 receptor 에달라붙는 targeting ligand 를수식하여표적화가가능한약물전달체의개발이필요하다. 3.4 본연구에서는블록공중합체고분자미셀을이용한약물전달체를개발하려고한다. 고분자미셀은수용액상에서양친성고분자에의해형 론 To whom correspondence should be addressed. E-mail: kimyj@cnu.ac.kr 성되는직경 2 nm 이하의입자로써양친성공중합체가수용액상에서자기회합하여내부의소수성영역과외부의친수성영역으로구성되는데, 이소수성내부영역에소수성물질을봉입하는시스템이다. 고분자미셀은난용성약물의가용화및특정부위로의약물수송개선을목적으로하는유용한수단으로많은주목을받고있다. 5 본연구에서는표적지향형약물전달시스템을개발하기위하여생분해성고분자인 poly((r)-3-hydroxy butyrate)(phb) 와양쪽말단기가 -NH 2 기로치환된 poly(ethylene glycol)(peg) 을결합시켰다. 이이중블록공중합체에암세포의표면에많이존재하는 folate receptor 에대한표적인자인 folate( 엽산 : folic acid) 를수식하여, 미사일이표적을향해곧바로날아가듯이약물이체내에들어갔을때, 정상세포에는영향을미치지않고, 암세포에만영향을미치는약물전달시스템을개발하고자하였다. 실 재료. Poly((R)-3-hydroxy butyrate) 를 Sigma-Aldrich 에서 험 515
516 권승호 ᆞ 김영진 H 2 N n PEG-diamine DMAP, DCC, RT, N 2 Chloroform H 2 N NH 2 + H C n PHB-PEG-amine CH 2 PHB NH CH 3 CH C H m CH 3 CH 2 CH H m Figure 1. Reaction mechanism of PHB and PEG-diamine. Table 1. Amount of Copolymer and GF for the Drug Loading Experiment Samples Copolymer GF 1) PHB(1 k)-peg(3.4 k)-folate 5 mg 5 mg 2) PHB(3.5 k)-peg(3.4 k)-folate 5 mg 5 mg 3) PHB(5 k)-peg(3.4 k)-folate 5 mg 5 mg Table 2. CMC of PHB-PEG-Folate Nanoparticle(n=5) Samples CMC Values(g/L) 1 5 1-2 2 1 1-2 3 5 1-1 Figure 2. Reaction mechanism of PHB-PEG-NH 2 and folate. 구입후, 가수분해하여분자량을조절하여사용하였다. 6 NH 2 기로치환된 poly(ethylene glycol)(m.w.=3.4 k) 은 Sunbio(Korea) 에서구입하였다. Folate 와 doxorubicin 은 Sigma 에서구입하였다. 1,3- Dicyclohexyl carbodiimide(99%)(dcc), griseofulvin(95%, HPLC grade), 1-pyrene-carboxaldehyde(99%), 4-demetylaminopyridine(99%)(DMAP), N-hydroxy-succinimide(98%)(NHS) 은 Sigma-Aldrich 에서구입하였다. PHB 와 PEG-Diamine의결합. 미생물에의해생산되는 PHB 는분자량이매우높기때문에그대로사용하기에적합하지못하다. 7 그래서, 산촉매를이용한가수분해를통하여분자량을조절하였다. 6 가수분해한시간에따라분자량이달라지며, PHB 의분자량이 1 k와 3.5 k, 그리고 5 k인것을사용하였다. PHB(5 mg) 를 5 ml 의 chloroform 에녹인다음, DCC(125 mg) 를넣고, 질소가스상태에서하룻밤동안활성화시켰다. PEG-diamine(5 mg) 을 5 ml의 chloroform 이담긴플라스크에넣고, DMAP( mg) 를넣어주었다. 8,9 플라스크를교반시키면서활성화된 PHB 를천천히넣어준다음, 상온에서질소가스상태에서 8시간동안반응시켰다. 이반응물을차가운 hexane 에침전시킨다음, 진공건조하여분말형태의결과물을얻었다. 1-13 PHB-PEG-amine 은양이온의흡착을선택적흡착을통하여제조하였다. 14 Figure 1에 PHB와 PEG-diamine의반응식을나타내었다. PHB-PEG-NH 2 와 Folate의결합. PHB-PEG-NH 2 (5 mg) 와 folate(7 mg) 를 5 ml 의 DMS 가담긴플라스크에 DCC(13 mg) 와 NHS(4 mg) 를함께넣어주었다. 질소가스상태에서상온에서 8시간동안반응시켰다. 이반응물을증류수에넣고, 3 rpm에서원심분리하여증류수로다시세척후, 동결건조하였다. Figure 2 에 PHB-PEG-NH 2 와 folate 의반응도를나타내었다. 나노입자의 CMC 측정과크기관찰. 임계미셀농도 (critical micelle concentration)(cmc) 는소수성형광염료인 pyrene을사용하여, 형광분석기로측정하였다. 형광분석기의 excitation 파장은 3 3 nm 이고, emission 파장은 39 nm이다. 15,16 투석방법 (dialysis) 을사용하여나노입자의형성을알아보았다. 고분자를 CMC 이상의농도 (Table 2) 에서수용액에녹인다음, dynamic light scattering(photal, ELS-Z)(DLS) 로수용액상에서입자의크기를측정하였다. 5,17 이입자들을동결건조하여 scanning electron microscope(hitachi, S-43)(SEM) 으로형태와크기를측정하였다. 소수성약물의봉입. 약물봉입률을알아보기위하여모델약물로써 griseofulvin(gf) 을사용하였다. GF 는피부사상균치료에쓰이는약물로소수성성질을가지고있다. 이약물을봉입하기위하여투석방법을사용하였다. 5 mg 의 GF 를물과아세톤을 1:9 비율로섞은 1 ml의용매에용해시키고, 5분간초음파분쇄후, 2분간균질화시켰다. 5 mg 의 PHB-PEG-folate 공중합체를 1 ml 의아세토니트릴에용해시켰다. 두용액을섞어준다음, 투석막 (M.W. cut off: ) 에넣고, 2차증류수에 24 시간동안상온에서투석시켰다. 5 약물봉입률은 high performance liquid chromatography(shimadzu, LC-6A)(HPLC) 로측정하였다. 4.6 15 mm 의크기에내경 5 μm 의 C18 컬럼 (MU cleocil -5) 을사용하였다. 이동상 (mobile phase) 은 45 mm potassium 을넣고, 물과아세토니트릴을 55:45 의비율로섞어서사용하였고, phosphoric acid 를사용하여 ph 3으로맞추어 1 ml/min 의속도로흘려주었다. GF 의전형적인체류시간은 5분이었고, 파장은 293 nm에서측정하였다. 18 Tabel 1에약물봉입실험에사용한각각의담체에넣어준 GF 의양을정리하였다. In vitro 상에서의약물방출거동. 약물의방출거동을알아보기위하여약물을농도별로 HPLC 로측정한다음, 방출되어나오는약물의농도를비교하였다. 약물을넣은고분자를 1 ml 의투석막 (M.W. cut off: ) 에넣고, PBS 용액 ml 에서 37, 9 rpm 에서 1 시간간격으로투석막밖으로빠져나온양을측정하였다. 매번 PBS 용액을갈아주면서시간별로방출되는양을측정하였다. Cell Viability 측정. 약물전달체의세포독성과표적지향성을알아보기위하여 GF 대신항암제인독소루비신 (doxorubicin)(dox) 을봉입하여 MTT assay를사용하였다. 폴리머, 제 33 권제 6 호, 29 년
Folate 가수식된 Poly((R)-3-hydroxy butyrate)-poly(ethylene glycol) 나노입자를이용한표적지향형약물전달체 517 HeLa cell 을배지에서 24시간동안배양하여.25% trypsin- EDTA 로처리하여세포를플라스크에수집하여세포수를각각 2 cells/ml 농도로조절하여 96 well plate 의각 well 에 μl 씩접종하여 37, C 2 배양기안에서 24 시간동안배양하였다. 여기에약물을각각 1 g/l 의농도로 1 μl 씩접종하여 37, C 2 배양기에서시간별로배양후, MTT assay 을이용하여세포생존율을측정하였다. 이때, 배양이끝나기 4시간전에 MTT 시약을 PBS 용액에녹인후, 여과멸균하여제조한 MTT 용액 26 μl 을각각의 well 에첨가한후, 37, C 2 배양기에서 4시간추가배양하여 formazan 형성반응을시키고나서, 상층액을제거하고남은자주색의 formazan 침전에 PBS 완충액 5 μl와이것을용해시키기위하여 dimethyl sulfoxide(dms) 를각 well당 μl 씩첨가하여반복적인피펫팅으로완전히녹인후, plate 를교반기에서 2 분간교반하였다. 19-21 이후, ELISA microplate 판독기를이용하여 57 nm 에서흡광도를측정하였다. 이때, 측정된흡광도는생존하는세포의미토콘드리아에함유된탈수소효소에의해 formazan 이란 crystal 로전환된양을나타내며, 생존하는세포의수와비례한다고할수있다. 22 세포의생존율은다음과같은식으로나타내었다. 23 Figure 4의 FT-IR 분석결과에서, PEG-diamine 의 -NH 2 피크가 1 cm -1 부근에서나타났는데, 합성후, -NH 2 기가사라졌음을확인하였다. 1 H-NMR 분광법과 FT-IR 분광법을통하여 PHB 가 PEG-diamine 과 folate 와합성되었음을알수있었다. PHB-PEG-Folate 입자의임계미셀농도. 합성된 PHB-PEG- Absorbance PHB-PEG-folate PHB PHEG-bis-amine 2 18 1 1 12 8 Wavelength(cm -1 ) Figure 4. FT-IR spectra of PHB-PEG-folate block copolymer. Absorbance of treated cell Cell viability(%) = Absorbance of untreated cell.5 g/l 결과및토론 PHB-PEG-Folate의분석. PHB, PEG, folate 의구조분석을위해 1 H-NMR 분광법과 FT-IR 분광법을사용하였다. PEG-diamine 의양쪽말단에있던두개의 -NH 2 기중에서한쪽은 PHB 와결합하고다른한쪽은 folate 와결합하게된다. PHB 말단의 -CH 기와 folate 의 -CH 기가 PEG-diamine 의 -NH 2 기와반응하여결합하고, H 2 가떨어져나간다. 그결과, Figure 3의 1 H-NMR 스펙트럼의 8.2 ppm 부근에서 5번피크가나타났음을알수있었다. Intensity 3 32 3 3 38 Wavelength(nm) (a).1 1-4 g/l I339/I334 8 6 4 2 Figure 3. 1 H-NMR of PHB-PEG-folate block copolymer. -7-6 -5-4 -3-2 -1 Log C(g/L) (b) Figure 5. CMC measurement of PHB-PEG-folate(sample 3) at 24. (a) Excitation spectra of pyrene with various concentration(.1 1-4.5 g/l); (b) Plot of fluorescence intensity of pyrene vs logarithmic concentration in I 339 /I 334. Polymer(Korea), Vol. 33, No. 6, 29
518 권승호 ᆞ 김영진 folate 입자의임계미셀농도 (CMC) 를측정하였다. CMC 란양친성공중합체가수용액상에서서로자기조립 (self-assembly) 에의하여구형의미셀을이루기시작하는농도라고할수있다. 24 Figure 5(a) 는농도별로형광분석기의파장을나타낸것이다. (b) 는 intensity 값을로그로취한값을나타냈다. 그래프에서갑자기증가한것을볼수가있는데, 이값이 CMC 값이라고할수있다. Table 2에각각의입자에따른 CMC 값을나타내었다. 나노입자의크기및모양확인. 나노입자의크기를 DLS 로측정한결과, 고분자사슬의길이에따라나노입자의크기가달라졌음을확인할수있었으며, 약물봉입후나노입자의크기가약간씩증가한것을알수있었다. 분자량에따란샘플의크기변화를 Table 3에정리하였다. 나노입자의크기뿐만아니라, 형태도알아보기위하여동결건조후 SEM 으로측정해보았다. Figure 6에서보이는바와같이구형의형태를이루고있었다. SEM 의측정결과가 DLS 의측정결과보다약간작게나온것을알수있었다. PHB-PEG-Folate 입자의약물봉입률. 소수성약물인 GF은물에잘녹지않기때문에유기용매에녹여수용액상태의고분자담체에섞어준다음, 초음파분쇄를한후, 다시균질화시켰다. 그런다음투석막에넣고, 하루동안투석시켰다. 용매를교체해주게되면, 봉입되지않은약물은삼투압현상에의해밖으로빠져나오게된다. 봉입된약물은투석막속에남게되며, 시간이지나면서서서히빠져나오게된다. 봉입률은약물을미셀에넣은양을기준으로실제적으로미셀속으로들어간양을퍼센트로나타내었다. 식은다음과같다. 25 Drug loading efficiency(%)= Amount of loaded in micelles Amount of drug added in micelles 봉입률을측정한결과, 각샘플마다봉입률이다름을확인하였다. 그 Table 3. Sizes of PHB-PEG-Folate Nanoparticles (n=5) Samples Blank(nm) Drug loaded(nm) 1 125 131 2 1 149 3 15 161 Figure 6. SEM image of PHB-PEG-folate nanoparticles (sample 3). 이유는소수성부분의사슬에따라약물과소수성상호작용이더강하여미셀속으로더많은양이봉입되는것이다. Table 4는각각의담체에따른봉입률을나타내었다. In vitro 상에서 PHB-PEG-Folate 입자의방출거동. 투석막을이용하여 PBS 용액속에서약물의방출시간을조사하였다. 각샘플을투석막에 CMC 이상의농도로 1 ml 씩넣고, ml의 PBS 용액이들어있는비커에넣고, 37 에서 9 rpm 으로교반하면서매시간마다용액을바꾸어주면서방출된양을 HPLC 로측정하였다. 약물은처음에는미셀안쪽에있다가삼투압현상에의하여시간이지나면조금씩밖으로나온다. 실험결과, 소수성부분의사슬이길수록소수성상호작용이강하여약물이밖으로빠져나오는것을방해하는것을알수있다. Figure 7과같이충분히소수성블록의길이가길때, 약물이지속적으로 24시간동안나오는것을확인하였다. Table 4. Drug Loading Efficiency of GF with Various Block Ratios (n=5) Cumulative released amount(%) 8 2 Sample1 Sample2 Sample3 4 8 12 16 2 24 28 32 Figure 7. In vitro release behavior of PHB-PEG-folate nanoparticles(n=5, S.D.<5). Cell viability(%) 1 12 8 2 Samples Drug loading efficiency(%) 1 35 2 48 3 56 Dox PHB-PEG-folate Sample 1 + Dox Sample 2 + Dox Sample 3 + Dox 4 8 12 16 2 24 Figure 8. Cell viability of various samples on HeLa cell(n=5, S.D.<11). 폴리머, 제 33 권제 6 호, 29 년
Folate 가수식된 Poly((R)-3-hydroxy butyrate)-poly(ethylene glycol) 나노입자를이용한표적지향형약물전달체 519 Cell viability(%) 11 9 8 7 5 3 2 1 Sample 3 + Dox PHB-PEG + Dox 4 8 12 16 2 24 Figure 9. Comparison of cell viability to verify the targeting effect of folate(n=5, S.D.<8). Folate 의표적지향성확인. Figure 8에서보는바와같이항암제를봉입하지않은 PHB-PEG-folate 입자의경우세포가죽지않고번식했음을알수있다. 반면, 항암제를봉입했을경우, 각샘플의봉입률에따라세포생존율이다르게나타났음을확인할수있었다. 항암제의봉입양에따라세포가더많이죽은것을확인할수있었다. 또한, Figure 9에서같은블록비를가지는 PHB-PEG 입자에 doxorubicin 를봉입하였을때, 표적인자인 folate 를수식한샘플 3가표적화의영향으로더많은약물이전달되어세포생존율이더낮음을확인할수있었다. Folate 의유무에따라표적세포에전달되는정도가달라져약물의항암효과가높아지는것을확인할수있었다. 결 표적지향형약물전달체를개발하기위하여생분해성고분자인 PHB 와 PEG-diamine 을이중블록공중합체로결합시켰다. 이중블록공중합체에암세포에표적화 (targeting) 할수있도록 folate 리간드를수식하였다. Folate 가리간드수용체에달라붙는성질을이용하여약물이몸속에들어갔을때, 정상세포에는영향을주지않고, 특정부위에만도달할수있도록설계하였다. 이공중합체는수용액상에서자기조립에의해미셀을이루며, 나노입자를형성하였다. 수용액상에서 DLS 로측정한결과, 125 165 nm 의입자를형성하였고, 동결건조하여 SEM 를측정한결과, 구형의나노입자가형성되었음을확인할수있었다. 이나노입자의약물봉입률과방출거동을알아보기위하여 griseofulvin 이라는소수성약물을봉입하였다. 이소수성약물은 35 56% 의봉입률을나타내었다. In vitro 상에서방출거동을확인한결과, 고분자의블록비에따라방출률이달라졌으며, 소수성블록이가장큰샘플3에서 24 시간동안약 8% 의약물이지속적으로빠져나오는것을확인하였다. 이나노입자의 folate 의표적지향성효과를알아보기위하여항암제인 doxorubicin 을봉입하여 HeLa cell 에세포생존율실험을하여 folate 가수식된입자의항암효과가더크다는것을확인할수있었다. 본실험으로제조된 folate 가수식된 PHB-PEG 나노입자는표적 론 지향성약물전달체로의사용가능성을보여주었다. 감사의글 : 이논문은 27 년도충남대학교학술연구비지원에의하여연구되었으며, 이에감사드립니다. 참고문헌 1. H. S. Kim, S. B. Hong, H. J. Sung, G. A. Moon, and Y. Yoon, Korean Journal of Pharmacognosy, 34, 145 (23). 2. N. J. Kim, S. B. Sim, J. K. Kim, D. H. Won, and N. D. Hong, Korean Journal of Pharma, 29, 93 (1998). 3. A. C. Antony, The Journal of The American Society of Hematology, 79, 287 (1992). 4. C. J. Mathias, S. Wang, P. S. Low, D. J. Waters, and M. A. Green, Nucl. Med. Biol., 26, 23 (1999). 5. G. Gaucher, M. Dufresne, V. P. Sant, N. Kand, D. Maysinger, and J. Leroux, J. Control. Release, 19, 169 (25). 6. K. H. Jeong and Y. J. Kim, Polymer(Korea), 3, 512 (26). 7. A. J. Anderson and E. A. Dawes, Microbiol. Rev., 54, 45 (199). 8.. Schiavon, G. Pasut, S. Moro, P. rsolini, A. Guiotto, and F. M. Veronese, Eur. J. Med. Chem., 39, 123 (24). 9. S. Zalipsky, M. Qazen, J. A. Walker Ⅱ, N. Mullah, Y. P. Quinn, and S. K. Huang, Bioconjugate Chem., 1, 73 (1999). 1. Z. Jedliński, P. Kurcok, and R. W. Lenz, Macromolecules, 31, 6718 (1998). 11. Q. Zhan, G. Cheng, H. Li, X. Ma, and L. Zhang, Polymer, 46, 1561(25). 12. J. Li, X. Li, X. Ni, and K. W. Leong, Macromolecules, 36, 2661 (23). 13. H. S. Yoo and T. G. Park, J. Control. Release, 96, 273 (24). 14. E. Chambers, M. Diane, D. Wagrowski, L. Ziling, R. Jeffery, and Mazzeo, J. Chromatrogr. B, 852, 1 (27). 15. J. Li, X. Li, X. Ni, X. Wang, H. Li, and K. W. Leong, Biomaterials, 27, 4132 (26). 16. H. Hyun, M. S. Kim, G. Khang, and H. B. Lee, Polymer (Korea), 3, 146 (26). 17. A. N. Lukyanov, Z. Gao, and V. P. Torchilin, J. Control. Release, 91, 97 (23). 18. H. Liu, S. Farrell, and K. Uhrich, J. Control. Release, 68, 167 (2). 19. B. P. Ram, and P. Tyle, Pharmaceut. Res., 4, 181 (1987). 2. E. S. Lee, K. Na, and Y. H. Bae, J. Control. Release, 91, 13(23). 21. Y. H. Bae, K. M. Huh, Y. Kim, and K.-H. Park, J. Control. Release, 64, 3(2). 22. Y. Lu and P. S. Low, Cancer Immunol. Immun., 51, 153 (22). 23. E. K. Park, S. Y. Kim, S. B. Lee, and Y. M. Lee, J. Control. Release, 19, 158 (25). 24. C. Allen, D. Maysinger, and A. Eisenberg, Colloid Surface B, 16, 3 (1999). 25. H. M. Aliabadi, S. Elhasi, A. Majmud, R. Gulamjusein, P. Mahdipoor, and A. Lavasanifar, Int. J. Pharm., 329, 158 (27). Polymer(Korea), Vol. 33, No. 6, 29