특허청구의범위청구항 1 단리된 T-세포폴리펩티드가서열 6 내지 58로이루어진군으로부터선택된아미노산서열로이루어진것인, 하나이상의단리된 T-세포폴리펩티드를포함하는 T-세포에피토프조성물의용도. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은신규한부류의 T- 세포에피토프조성물 (" 트레

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C07K 14/47 ( ) C07K 14/725 ( ) A61K 38/17 ( ) (21) 출원번호 ( 분할 ) (22) 출원일자 ( 국제 ) 2008 년 01 월 29 일 심사청구일자 없음 (62) 원출원특허 원출원일자 ( 국제 ) 심사청구일자 2013 년 01 월 29 일 (85) 번역문제출일자 2014 년 08 월 28 일 (86) 국제출원번호 PCT/US2008/ (87) 국제공개번호 WO 2008/ 국제공개일자 (30) 우선권주장 2008 년 08 월 07 일 2008 년 01 월 29 일 60/898, 년 01 월 30 일미국 (US) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2014년10월07일 (71) 출원인 에피백스, 인크. 미국 로드아일랜드주프로비던스클리포드스트리트 146 (72) 발명자 드그루트, 앤 미국 로드아일랜드주프로비던스모리스애비뉴 292 마틴, 윌리엄 미국 로드아일랜드주컴벌랜드다이아몬드힐로드 3650 리베라, 댄 미국 로드아일랜드주프로비던스펄스트리트 304 (74) 대리인 양영준, 양영환 전체청구항수 : 총 1 항 (54) 발명의명칭조절 T 세포에피토프, 그의조성물및용도 (57) 요약 본발명은면역글로불린불변또는가변영역의적어도일부를포함하는펩티드또는폴리펩티드를포함하는 T- 세포에피토프에관한것이다. 본발명은또한본발명의에피토프의사용방법및제조방법에관한것이다. 대표도 - 도 1

2 특허청구의범위청구항 1 단리된 T-세포폴리펩티드가서열 6 내지 58로이루어진군으로부터선택된아미노산서열로이루어진것인, 하나이상의단리된 T-세포폴리펩티드를포함하는 T-세포에피토프조성물의용도. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은신규한부류의 T- 세포에피토프조성물 (" 트레지토프 (Tregitope)" 로지칭됨 ) 에관한것이다. 본발 명은트레지토프조성물, 그의제조및사용방법을제공한다. [0002] [0003] 배경기술자가또는외래항원에대한관용의인공적인유도는자가면역, 이식알레르기및기타질환에대한치료요법의목적이며, 또한자가단백질및비-자가단백질을사용한치료요법의맥락에서도바람직하다. 최근까지, 치료적관용유도는세포소모및시토킨프로파일변동을초래하는포괄적접근법에의존해왔다. 이러한포괄적접근법은일반적으로면역계를약화시켜, 다수의대상체를기회감염, 자가면역공격및암에취약하도록만든다. 당업계에는면역관용의유도를위한덜공격적이고더표적화된접근법에대한요구가존재한다. 면역관용은 T-세포, B-세포, 시토킨및표면수용체간의복합적상호작용에의해조절된다. 초기의자가 / 비- 자가식별은신생아발육동안흉선에서발생하는데, 여기서골수상피세포는미성숙 T-세포에대한특이적자가단백질에피토프를발현한다. 자가항원을높은친화성으로인식하는 T-세포는소실되지만, 중간정도의친화성을갖는자가반응성 T-세포는때때로소실되지않고소위 ' 천연 ' 조절 T (T Reg ) 세포로전환될수있다. 이 러한천연 T Reg 세포는말초로보내져자가면역의일정한억제를제공한다. [0004] 제 2 형태의관용은말초에서발생하며, 여기서성숙 T- 세포는 IL-10 및 TGF-β 의존재하에서 T- 세포수용체를 통한활성화시에 ' 적응 ' T Reg 표현형으로전환된다. 이러한 ' 적응 ' T Reg 세포의가능한역할에는알레르기반응 또는낮은수준의만성감염에의해야기될수있는바와같은과도한염증을제어하기위해침입병원체를성공적으로소멸시킨후면역반응을약화시키는것, 또는가능하게는유익한공생박테리아및바이러스와의공존을촉진하는것이포함된다. ' 적응 ' T Reg 는또한체세포과변이가일어난인간항체의생활환을관리하는역할을할수있다. [0005] [0006] [0007] [0008] 천연조절 T-세포는말초에서의면역조절에결정적인성분이다. 그것의 TCR을통한활성화시에, 천연 Treg는종속적및독립적접촉메커니즘을통해비-관련항원에대한방관자작동 T-세포반응을억제할수있다. 또한, IL-10 및 TGF-β를비롯한, 이러한세포에의해방출된시토킨은항원-특이적적응 Treg를유도할수있다. 광범위한노력에도불구하고, 극소수의예외를제외하고는천연 Treg, 보다중요하게는임상적으로유의한양으로순환하는천연 Treg의항원특이성은아직알려지지않았다. 당업계에는 IgG와같은통상의자가단백질에함유된조절 T-세포에피토프 (" 트레지토프 ") 의확인, 및그의제조및사용과관련된방법에대한요구가존재한다. 개요본발명은조절 T-세포 (T Reg ), 특히말초에서외래및자가단백질에대한면역반응을이미조절하고있는상 기세포 ( 선재또는천연 T Reg ) 의기능을이용한다. 한측면에서, 본발명은 T- 세포에피토프폴리펩티드조성 물을제공한다. [0009] 트레지토프및트레지토프 - 항원융합체의사용을통한선재하는천연 Treg 의선택적개입및활성화는원치않는 면역반응의존재에의해나타난임의의질환또는상태에대한처치로서치료적으로가치가있다. 그예에는 제 1 형당뇨병, MS, 루푸스및 RA 와같은자가면역질환 ; 이식편대숙주질환 (GVHD) 과같은이식관련장애 ;

3 알레르기반응 ; 모노클로날항체와같은생물학적의약, FVIII 또는인슐린과같은대체단백질, 보툴리눔독소 와같은치료용독소의사용에대한면역거부 ; 및급성또는만성인전염성질환에대한면역반응의관리가 포함된다. [0010] [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] 한실시양태에서, 본발명은서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된하나이상의폴리펩티드를포함하는 T-세포에피토프폴리펩티드조성물에관한것이다. 특정실시양태에서, 본발명은본발명의폴리펩티드및제약상허용되는담체를포함하는제약조성물에관한것이다. 한실시양태에서, 본발명은서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된하나이상의 T-세포에피토프폴리펩티드를코딩하는핵산에관한것이다. 특정실시양태에서, 본발명은본발명의핵산을포함하는벡터에관한것이다. 또다른실시양태에서, 본발명은본발명의벡터를포함하는세포에관한것이다. 한실시양태에서, 본발명은치료적유효량의서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된 T-세포에피토프폴리펩티드를투여하는것을포함하는, 의학적상태의치료또는예방을필요로하는대상체에서의학적상태를치료또는예방하는방법에관한것이다. 특정실시양태에서, 의학적상태는알레르기, 자가면역질환, 이식관련장애, 이식편대숙주질환, 효소또는단백질결핍장애, 지혈장애, 암, 불임 ; 및바이러스, 박테리아또는기생충감염으로이루어진군으로부터선택된다. 한실시양태에서, 본발명은서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된하나이상의 T-세포에피토프폴리펩티드를포함하는, 대상체에서의학적상태를예방또는치료하기위한키트에관한것이다. 한실시양태에서, 본발명은 (a) 대상체로부터생물학적샘플을제공하는것 ; 및 (b) 상기생물학적샘플로부터조절 T-세포를단리하고 ; 단리된조절 T-세포를 T-조절세포가수적으로증가하여팽창된조절 T-세포조성물을산출하는조건하에서유효량의본발명의트레지토프조성물과접촉시킴으로써, 생물학적샘플에서의조절 T-세포를팽창시키는것을포함하는, 조절 T-세포의집단을팽창시키는방법에관한것이다. 한실시양태에서, 본발명은 (a) 대상체로부터생물학적샘플을제공하는것 ; 및 (b) 상기생물학적샘플로부터조절 T-세포를단리하고 ; 단리된조절 T-세포를 T-조절세포가하나이상의생물학적기능을변경시키도록자극받는조건하에서유효량의본발명의트레지토프조성물과접촉시킴으로써, 생물학적샘플에서의조절 T-세포를자극하는것을포함하는, 생물학적샘플에서의조절 T-세포를자극하는방법에관한것이다. 한실시양태에서, 본발명은치료적유효량의트레지토프포함펩티드를포함하는조성물을대상체에게투여하는것을포함하며, 여기서상기펩티드는면역반응을억제하는것인, 대상체에서면역반응을억제하는방법에관한것이다. 특정실시양태에서, 펩티드는작동 T-세포반응을억제한다. 특정실시양태에서, 펩티드는보조 T-세포반응을억제한다. 또다른실시양태에서, 펩티드는 B-세포반응을억제한다. 한실시양태에서, 본발명은특이적표적항원과공유적으로결합되거나비-공유적으로결합되거나혼합됨으로써상기표적항원에대한면역반응을축소시키는치료적유효량의하나이상의트레지토프를포함하는조성물을투여함으로써대상체에서항원특이적면역반응을억제하는방법에관한것이다. 특정실시양태에서, 억제효과는천연 Treg에의해매개된다. 또다른실시양태에서, 억제효과는적응 Treg에의해매개된다. 또다른실시양태에서, 펩티드는작동 T-세포반응을억제한다. 또다른실시양태에서, 펩티드는보조 T-세포반응을억제한다. 또다른실시양태에서, 펩티드는 B-세포반응을억제한다. 특정실시양태에서, 펩티드는서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된서열을포함한다. 한실시양태에서, 본발명은조절 T-세포에피토프의확인및제거를포함하는, 백신전달벡터의면역원성을강화시키는방법에관한것이다. 특정실시양태에서, T-세포에피토프는서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된다. 발명의내용 [0019] [0020] 해결하려는과제개론적응면역캐스케이드는가용성단백질항원이항원제시세포 (APC) 에의해포획되어 II형항원제시경로를통해처리되는경우시작된다. II형제공경로에서단백질항원은소포체에서발견되는각종프로테아제에의해분해된다. 생성된단백질단편의일부는 II형 MHC 분자에결합한다. 펩티드-로딩된 MHC 분자는세포표면에이송되어 CD4+ T-세포에의해신호를받는다. MHC 분자에결합하여 APC와순환 T-세포사이의세포대세포

4 상호작용을매개할수있는펩티드단편은 T-세포에피토프로서지칭된다. CD4+ T-세포에의한이들펩티드- MHC 복합체의인식은반응하는 T-세포의표현형및국소시토킨 / 케모킨환경을바탕으로면역활성또는면역억제반응을유도할수있다. 일반적으로, MHC/ 펩티드복합체와 T 작동세포의 T-세포수용체 (TCR) 사이의연계는 IL-4 및 IFN-γ와같은전-염증성시토킨의활성화및분비를유도한다. 반면, 천연 T 조절세포 (TReg) 의활성화는특히면역억제시토킨 IL-10 및 TGF-β의발현을유도한다 ( 문헌 [Shevach, E., Nat. Rev. Immunol., 2: , 2002] 참조 ). 이들시토킨은작동 T-세포근처에직접작용하여일부경우에서면역력저하또는세포자멸사를유도한다. 다른경우에서조절시토킨및케모킨은작동 T-세포를 T 조절표현형으로전환시키며 ; 이러한과정은본원에서 " 유도 " 또는 " 적응 " 관용으로서지칭된다. MHC 분자에결합하고, 순환 Treg를개입시켜활성화시킬수있는 T-세포에피토프는트레지토프로서지칭된다. [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] 초기의자가 / 비-자가식별은신생아발육동안흉선에서발생하는데, 여기서골수상피세포는미성숙 T-세포에대한특이적자가단백질에피토프를발현한다. 자가항원을높은친화성으로인식하는 T-세포는소실되지만, 중간정도의친화성을갖는자가반응성 T-세포는때때로소실되지않고소위천연조절 T (TReg) 세포로전환될수있다. 이러한천연 Treg 세포는말초로보내져자가면역의일정한억제를제공한다. 천연조절 T-세포는면역조절및자가관용의중요한성분이다. 자가관용은 T-세포, B-세포, 시토킨및표면수용체사이의복합적상호작용에의해조절된다. T 조절면역반응은 ( 자가이든외래이든 ) 단백질항원에대한 T 작동면역반응의균형을맞춘다. 자가반응성 T 작동세포의수또는기능의증가또는 T 조절세포의수또는기능의감소에의한자가반응성쪽으로의균형의편향은자가면역으로서표출된다. 제2 형태의관용은말초에서발생하며, 여기서성숙 T-세포는통상적으로방관자 T 조절세포에의해공급되는 IL-10 및 TGF-β의존재하에서 T-세포수용체를통한활성화시에 ' 적응 ' TReg 표현형으로전환된다. 이러한 ' 적응 ' TReg 세포의가능한역할에는알레르기반응또는낮은수준의만성감염에의해야기될수있는바와같은과도한염증의제어하기위해침입병원체를성공적으로소멸시킨후면역반응을약화시키는것, 또는가능하게는유익한공생박테리아및바이러스와의공존을촉진하는것이포함된다. ' 적응 ' TReg는또한체세포과변이가일어난인간항체의생활환을관리하는역할을할수있다. 면역글로불린의불변영역은, 주요기능이과변이된 CDR에대한면역반응을억제하는것인여러중요한트레지토프를함유하는것으로생각된다. 다량의순환 IgG로인해 IgG에함유된트레지토프에상응하는 T 조절세포도다량존재하는것으로여겨진다. 이러한주장의일부증거로서면역글로불린의 Fc 부분을포함하는키메라단백질이증가된안정성, 증가된혈청반감기, Fc 수용체에대한결합, 및감소된면역원성을비롯한, 키메라단백질에대한여러바람직한성질을부여한다는것을고려한다 ( 문헌 [Lei, T. et al., Cell. Immunol., 235:12-20, 2005, Baxevanis, C. et al., Eur. J. Immunol., 16: , 1986] 참조 ). TReg 세포는또한 B-세포관용에수단이된다. B 세포는그의세포표면에단일저친화성 Fc 수용체 FcyRIIB를발현한다 ( 문헌 [Ravetch, J. et al., Science, 234: , 1986] 참조 ). 이러한수용체는세포질도메인에면역수용체티로신-기재의억제모티프서열 (ITIM) 을함유한다. 면역복합체에의한 FCyRIIB와 BCR의공동-결합 (Co-ligation) 은 ITIM의티로신인산화를촉발시키는작용을하여이노시톨포스파타제인 SHIP의동원을유도함으로써, MAP 키나제의활성화를방해하여 BCR-촉발증식을억제하고세포막으로부터의버튼티로신키나제 (Burton's tyrosine kinase; Btk) 의분리에의해식균작용을차단하여, 세포로의칼슘유입을억제한다. FcyRIIB는또한 ITIM에상관없이세포자멸사를유발할수있다. IC에의한 FcRIIB의동종-집합시, Btk와세포막의결합이증진되어세포자멸사반응을촉발시킨다 ( 문헌 [Pearse, R. et al., Immunity, 10: , 1999] 참조 ). FcyRIIB의발현은매우가변적이며시토킨의존성이다. 활성화된 Th2 및 TReg 세포에의해발현되는 IL-4 및 IL-10은 FcyRIIB 발현을증진시키는데상승작용적으로작용하여 ( 문헌 [Joshi, T. et al., Mol. Immunol., 43: , 2006] 참조 ) 체액성반응의억제를돕는것으로나타났다. 트레지토프특이적 TReg 세포를이용하여원치않는면역반응을억제하고적응 TReg가공동-전달된단백질을유도하는것이가능하다. 이러한발견은이식, 단백질치료제, 알레르기, 만성감염, 자가면역에대한치료계획및항원-특이적치료법의고안및백신고안에대한암시를제공한다. 약물, 단백질또는알레르겐을트레지토프와함께투여하여작동체면역반응을억제시킬수있다. 트레지토프를사용하여면역계를관용쪽으로의도적으로조작할수있다. 과제의해결수단

5 [0027] [0028] [0029] [0030] 본발명의펩티드는조절 T-세포의선택적개입및활성화에유용하다. 선재하는특정조절 T-세포집단은전신적및제한된질환특이적상황모두에개입되고, 활성화되며, 원치않는면역반응의억제에적용될수있다는것이본원에서입증된다. 광범위한노력에도불구하고, 극소수의예외를제외하고는천연 Treg, 보다중요하게는임상적으로유의한양으로순환하는천연 Treg의항원특이성은알려지지않았다. 혈류에서순환하는특정한인간단백질, 예컨대면역글로불린또는혈청단백질알부민이천연발생조절 T-세포집단과관련된 T-세포에피토프를함유한다는증거가본원에제시된다. 통상의면역감시동안, 이들단백질은수지상세포또는대식세포와같은전문 APC에의해포획되어분해된다. 분해과정동안이들단백질에함유된일부에피토프는 MHC 분자에결합하고, 세포표면으로이송되어조절 T-세포에대해제시된다. 상기세포는 APC에의해활성화되면시토킨및케모킨을방출하여세포외단백질의기능을방해하는자가면역반응을억제하도록돕는다. 이들선재하는조절 T-세포를선택적으로활성화시키는본발명의펩티드를사용함으로써, 본발명의펩티드가각종원치않는면역반응을억제하는데사용될수있다는것을본원에서보여준다. 가장간단한형태로, 심각한자가면역반응, 예컨대 MS 플레어-업 (MS flare-up), 알레르기반응, 이식반응, 또는감염에대한비-제어반응을제어하는데유용한일반화된면역억제제로서본발명의펩티드의전신적적용을이용할수있다. 예를들어류머티스성관절염 (RA) 에걸린관절에국부적용되는보다제어된적용에서, 본발명의펩티드를사용하여국소화자가면역반응을억제할수있다. 특정한다른 T-세포에피토프에펩티드가융합또는결합하여달성될수있는것과같은표적적용에서, 펩티드는면역계의균형을본래대로유지하면서고도로특이적인면역반응을억제할수있다. 예를들어, 인슐린과같은자가면역항원또는브라질너트 (Brazil nut) 항원과같은알레르겐에융합된조절펩티드의전달을통해, 면역계는반응하는작동 T-세포의표현형을적응조절 T-세포의표현형으로전환함으로써공동-전달된항원을 " 관용 " 하도록훈련될수있다. 상기한바와같이, 본발명의펩티드는순환하는세포외단백질로부터유래된다. 유용하기위해서이들펩티드는실제 T-세포에피토프 ( 즉, MHC 분자및 TCR에모두결합할수있는것 ) 이어야하며, 치료효과를나타내기에충분히큰선재하는조절 T-세포집단에관련된것이어야한다. 다중 MHC 대립유전자및다중 TCR에결합할수있는에피토프인 T-세포에피토프클러스터가후자의조건을충족시키는열쇠이다. [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] 발명의효과정의본발명의이해를더돕기위해, 다수의용어및어구를하기에정의한다. 본원에서사용된용어 " 생물학적샘플 " 은유기체로부터의조직, 세포또는분비물의임의의샘플을지칭한다. 본원에서사용된용어 " 이식 " 은한대상체로부터 " 이식물 " 또는 " 이식편 " 으로지칭되는세포, 조직또는기관을취하여그것또는그것들을 ( 통상적으로 ) 다른대상체에넣는과정을가리킨다. 이식물을제공하는대상체는 " 공여자 " 라지칭하고, 이식물을받는대상체는 " 수용자 " 라지칭한다. 동일한종의유전적으로상이한두대상체사이에서이식된기관또는이식편은 " 동종이식편 " 이라지칭한다. 상이한종의대상체사이에서이식된이식편은 " 이종이식편 " 이라지칭한다. 본원에서사용된용어 " 의학적상태 " 는치료및 / 또는예방이필요한하나이상의신체적및 / 또는생리학적증상으로서표출되는임의의상태또는질환을포함하지만이에제한되지는않으며, 이전에및새롭게확인된질환및다른장애를포함한다. 본원에서사용된용어 " 면역반응 " 은, 인체로부터암세포, 전이성종양세포, 악성흑색종, 침입병원체, 병원체에의해감염된세포또는조직, 또는자가면역또는병리학적염증의경우정상인간세포또는조직을선택적으로손상시키거나, 파괴하거나, 제거하는림프구, 항원제시세포, 포식세포, 과립구, 및상기세포또는간에의해생성된가용성거대분자 ( 항체, 시토킨및보체포함 ) 의협력작용을가리킨다. 본원에서사용된용어인조성물의 " 유효량 " 은목적하는치료및 / 또는예방효과를달성하기에충분한양, 예를들어치료할질환과관련된증상을예방하거나감소시키는양이다. 대상체에투여되는본발명의조성물의양은질환의유형및중증도, 및개인의특성, 예컨대일반건강, 연령, 성별, 체중, 및약물에대한내성에좌우될것이다. 또한, 질환의정도, 중증도및유형에좌우될것이다. 당업자는이들및다른인자에따라적절한투여량을결정할수있을것이다. 본발명의조성물은또한서로또는 1종이상의추가치료화합물과조합되

6 어투여될수있다. [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 본원에서사용된용어 "T-세포에피토프 " 는 7 내지 30개아미노산길이이며 HLA 분자에특이적으로결합하여특이적 TCR과상호작용할수있는단백질결정자를의미한다. 일반적으로, T-세포에피토프는선형이며특정한 3 차원특성을발현하지않는다. T-세포에피토프는변성용매의존재에의해영향받지않는다. 본원에서사용된용어 "B-세포에피토프 " 는항체에특이적으로결합할수있는단백질결정자를의미한다. 에피토프는통상아미노산또는당측쇄와같은분자의화학적활성표면군으로이루어지며, 통상특정 3차원구조특성뿐만아니라특정전하특성을갖는다. 입체적및비-입체적에피토프는, 전자에대한결합은변성용매의존재하에서소실된다는점에서구별된다 ( 후자는그렇지않음 ). 본원에서사용된용어 " 대상체 " 는면역반응이일어나는임의의살아있는유기체를가리킨다. 용어대상체는인간, 비인간영장류, 예컨대침팬지및다른유인원및원숭이종 ; 농장용동물, 예컨대소, 양, 돼지, 염소및말 ; 가축, 예컨대개및고양이 ; 실험실용동물, 예를들어설치류, 예컨대마우스, 래트및기니피그등을포함하지만이에제한되지는않는다. 상기용어는특정연령또는성별을나타내지않는다. 따라서, 성체및신생대상체뿐만아니라태아도남성이든여성이든포함되는것으로의도된다. 본원에서사용된용어 "MHC 복합체 " 는 HLA 리간드로서공지되어있는특정목록의폴리펩티드에결합하여상기리간드를세포표면에이송시킬수있는단백질복합체를가리킨다. 본원에서사용된용어 "MHC 리간드 " 는 1종이상의특정 MHC 대립유전자에결합할수있는폴리펩티드를의미한다. 용어 "HLA 리간드 " 는용어 MHC 리간드와상호교환될수있다. 표면에 MHC/ 리간드복합체를발현하는세포는 " 항원제시세포 (APC)" 로서지칭된다. 본원에서사용된용어 "T-세포수용체 " 또는 "TCR" 은 APC의표면에제시된바와같은특정목록의 MHC/ 리간드복합체를개입시킬수있는, T-세포에의해발현된단백질복합체를가리킨다. 본원에서사용된용어 "T-세포에피토프 " 는특정 T-세포수용체 (TCR) 와상호작용할수있는 MHC 리간드를의미한다. T-세포에피토프는인실리코 (in silico) 방법에의해예상될수있다 ( 문헌 [De Groot, A. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 13: , 1997]; [Schafer, J. et al., Vaccine, 16: , 1998]; [De Groot, A. et al., Vaccine, 19: , 2001]; [De Groot, A. et al., Vaccine, 21: , 2003] 참조 ). 본원에서사용된용어 "MHC 결합모티프 " 는특정 MHC 대립유전자에결합하는것으로예상되는단백질서열에서의아미노산패턴을가리킨다. 본원에서사용된용어 "T-세포에피토프클러스터 " 는약 4개내지약 40개의 MHC 결합모티프를함유하는폴리펩티드를가리킨다. 특정실시양태에서, T-세포에피토프클러스터는약 5개내지약 35개의 MHC 결합모티프, 약 8개내지약 30개의 MHC 결합모티프, 및약 10개내지 20개의 MHC 결합모티프를함유한다. 본원에서사용된용어 " 에피바 (EpiBar)" 는 4개이상의상이한 HLA 대립유전자에반응성인것으로예상되는단일 9량체프레임을가리킨다. 에피바를함유하는공지된면역원의서열은인플루엔자헤마글루티닌 , 파상풍독소 , 및 GAD 을포함한다. 에피바를함유하는면역원성펩티드의예를하기에도시한다.

7 [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] 본원에서사용된용어 " 면역시냅스 " 는세포표면 MHC 복합체및 TCR 모두에대한소정의 T-세포에피토프의동시개입으로형성된단백질복합체를의미한다. 본원에서사용된용어 " 조절 T-세포 " 는, CD4, CD25 및 FoxP3를포함하지만이에제한되지않는특정의세포표면마커의존재를특징으로하는천연발생 T-세포의서브세트를의미한다. 활성화시에조절 T-세포는, IL- 10, TGF-β 및 TNF-α를포함하지만이에제한되지않는면역억제시토킨및케모킨을분비한다. 용어 " 폴리펩티드 " 는특정길이가아닌아미노산중합체를가리키며 ; 따라서펩티드, 올리고펩티드및단백질이폴리펩티드의정의내에포함된다. 본원에서사용된폴리펩티드는재조합및비-재조합세포로부터단리될때세포성물질이실질적으로없는경우, 또는화학적으로합성될때화학적전구체또는다른화학물질이없는경우, " 단리 " 또는 " 정제 " 된다고기재된다. 그러나, 폴리펩티드는세포내에서통상적으로결합되지않은또다른폴리펩티드에연결될수있으며, 여전히 " 단리 " 또는 " 정제 " 될수있다. 폴리펩티드가재조합적으로생산되는경우, 배양배지가실질적으로없을수있으며, 예를들어배양배지는폴리펩티드제제부피의약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는약 5% 미만을나타낸다. 변이체폴리펩티드는하나이상의치환, 결실, 삽입, 역위, 융합및절단, 또는이들중임의의것의조합으로인해아미노산서열이상이할수있다. 본발명은또한본발명의폴리펩티드의폴리펩티드단편을포함한다. 본발명은또한본원에서기술하는폴리펩티드의변이체의단편도포함한다. 본발명은또한키메라또는융합폴리펩티드를제공한다. 여기에는본발명의폴리펩티드와실질적으로상동성이아닌아미노산서열을갖는폴리펩티드또는이종단백질에작동적으로연결된폴리펩티드가포함된다. " 작동적으로연결된 " 이란, 폴리펩티드및이종단백질이프레임내에서융합된것을말한다. 단리된폴리펩티드는이를천연적으로발현하는세포로부터정제될수있거나, 이를발현하도록변경된세포 ( 재조합체 ) 로부터정제될수있거나, 공지된단백질합성방법을사용하여합성될수있다. 한실시양태에서, 폴리펩티드는재조합 DNA 기술에의해생산된다. 예를들어, 폴리펩티드를코딩하는핵산분자를발현벡터내로클로닝하고, 발현벡터를숙주세포에도입하고, 숙주세포에서폴리펩티드를발현시킨다. 이어서, 표준단백질정제기술을사용하여적절한정제계획에의해세포로부터폴리펩티드를단리할수있다. 본발명의목적을위해, 폴리펩티드는예를들어변형된형태의천연발생아미노산, 예컨대 D-입체이성질체, 비-천연발생아미노산 ; 아미노산유사체 ; 및모방체를포함할수있다. 본원에기재된방법및물질과유사하거나동일한임의의방법및물질이본발명의실시또는시험에사용될수있지만, 바람직한방법및물질이기재되어있다. 본발명의다른특징, 목적및이점은발명의상세한설명및특허청구범위로부터명백할것이다. 명세서및첨부된특허청구범위에서, 단수형태는문맥에서달리명확히기술하지않는한복수지시물을포함한다. 달리정의되지않는한, 본원에사용된모든기술및과학용어는본발명이속하는업계의당업자가통상적으로이해하는것과동일한의미를갖는다. 본원에인용된모든

8 참고문헌은그전문이참조로본원에포함되며, 모든목적을위해각각의개별공개문헌, 특허문헌또는특허출 원이그전문으로서참조로포함된다고구체적및개별적으로나타내어지는것과동일한정도로포함된다. [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 조성물한측면에서, 본발명은이하에서열거하는하나이상의규정된특징을갖는펩티드또는폴리펩티드사슬을포함하는, ' 트레지토프 ' 로지칭되는신규한부류의 T-세포에피토프조성물을제공한다. 즉, 본발명의트레지토프는, 이것으로한정되는것은아니지만, 하기특징들중하나이상을포함한다 : (1) 본발명의트레지토프는일반인간단백질로부터유래된다. (2) 본발명의트레지토프는그의공급원단백질의공지된변이체들중에서매우보존적이다 ( 예를들어, 공지된변이체들중에서 50% 를초과하여존재함 ). (3) 본발명의트레지토프는에피매트릭스분석에의해확인되는추정 T-세포에피토프를적어도하나포함한다. 에피매트릭스는에피백스 (EpiVax) 에의해개발된독점적컴퓨터알고리즘으로, 추정 T-세포에피토프의존재에대해단백질서열을스크리닝하는데사용된다. 입력서열은중첩된 9량체프레임들로분석되고, 각프레임은 8개의아미노산에의해그말미가중첩된다. 이어서, 각결과프레임에대하여 8종의일반 II형 HLA 대립유전자패널 (DRB1 * 0101, DRB1 * 0301, DRB1 * 0401, DRB1 * 0701, DRB1 * 0801, DRB1 * 1101, DRB1 * 1301 및 DRB1 * 1501) 에대해예상되는결합친화성의점수를매긴다. 원점수를무작위로생성한다량의펩티드샘플의점수로정규화한다. 그결과를 "Z" 점수로보고한다. 대립유전자-특이적에피매트릭스 Z-점수가이론상임의의주어진샘플의상위 5% 인 1.64를초과하는임의의 9량체펩티드를추정 T-세포에피토프로간주한다. [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] 바람직한실시양태에서, 본발명의트레지토프는 T-세포에피토프클러스터로알려진패턴을형성하는수개의추정 T-세포에피토프를함유한다. 추정 T-세포에피토프는단백질서열전반에걸쳐무작위적으로분포되어있지않고, 대신특이적영역에 " 클러스터 " 를형성하는경향이있다. 또한, 추정 T-세포에피토프의클러스터를함유하는펩티드는시험관내및생체내검정에서의확인시보다양성으로시험될수있다. 클러스티머 (Clustimer) 로알려진제2의독점적알고리즘을이용하여추정 T-세포에피토프 " 클러스터 " 의존재에대해초기에피매트릭스분석결과를추가로스크리닝한다. 클러스티머알고리즘은통계적으로드문다수의추정 T-세포에피토프를함유하는임의의주어진아미노산서열내에함유되어있는하위영역을확인한다. 전형적인 T-세포에피토프 " 클러스터 " 는길이가약 9 내지대략 30개아미노산의범위이고, 복대립유전자에대한그리고다중 9량체프레임에걸친그들의친화성을고려할때, 어느곳에서건약 4 내지약 40개의추정 T-세포에피토프를함유할수있다. 확인된각에피토프클러스터에대하여, 추정 T-세포에피토프의점수를합하고후보에피토프클러스터의길이에근거한보정인자및동일한길이의무작위적으로발생된클러스터의예상점수를감하여총에피매트릭스점수를계산한다. +10을초과하는에피매트릭스클러스터점수를현저한것으로본다. 다수의가장반응성인 T-세포에피토프클러스터는 " 에피바 " 라고불리는특성을갖는다. 에피바는적어도 4개의상이한 HLA 대립유전자에대해반응성일것으로예상되는단일한 9량체프레임이다. 에피바를함유하는서열로는인플루엔자헤마글루티닌 ( 클러스터점수 18), 파상풍독소 ( 클러스터점수 16), 및 GAD ( 클러스터점수 19) 이있다. 또다른실시양태에서, 본발명의펩티드는하나이상의에피바를포함할수있다. (4) 본발명의트레지토프는적어도중간정도의친화성 ( 예를들어, 가용성 HLA 분자에기초한 HLA 결합검정에서 < 200 μm IC 50 ) 으로적어도 1개, 바람직하게는 2개이상의일반 HLA II형분자에결합한다. (5) 본발명의트레지토프는적어도 1개, 바람직한실시양태에서는 2개이상의 HLA 대립유전자와관련해서 APC 에의해세포표면에제시될수있다. (6) 이와관련해서, 트레지토프-HLA 복합체는트레지토프-HLA 복합체에대해특이적인 TCR을갖고정상대조군대상체에서순환하는조절 T-세포의선재집단에의해인식될수있다. 트레지토프-HLA 복합체의인식은일치하는조절 T-세포가활성화되도록할수있고조절시토킨및케모킨을분비하도록할수있다. (7) 본발명의트레지토프 ( 들 ) 에의한조절 T-세포의자극은 IL-10, TGF-β, TNF-α 및 MCP1과같은하나이상의시토킨및케모킨의분비를증가시킨다. 이와같은조절시토킨및케모킨의분비의증가는조절 T-세포의특징이다.

9 [0068] [0069] [0070] [0071] (8) 본발명의트레지토프 ( 들 ) 에의해활성화된조절 T-세포는 CD4+CD25+FOXP3 표현형을발현한다. (9) 트레지토프 ( 들 ) 에의해활성화된조절 T-세포는항원-특이적 Th1- 또는 Th2-관련시토킨 ( 주로 INF-γ, IL- 4 및 IL-5) 수치의감소및 CFSE 희석에의해측정되는항원-특이적 T 작동세포증식의감소로측정되는바와같이, 생체외에서 T-작동면역반응을직접적으로억제한다. (10) 트레지토프 ( 들 ) 에의해활성화된조절 T-세포는항원-특이적 Th-1 또는 Th-2 관련시토킨수치의감소 (Elisa 검정에의해측정됨 ), 항원-특이적 T 작동세포수치의감소 (EliSpot 검정에의해측정됨 ), 및단백질항원에대한항체역가의감소로측정되는바와같이, 생체내에서 T-작동면역반응을직접적으로억제한다. (11) 본발명의트레지토프에의해활성화되는천연조절 T-세포는적응 T Reg 세포의발생을자극한다. 말초 T- 세포를본발명의트레지토프와함께항원의존재하에서공동인큐베이션할경우항원 - 특이적 CD4+/CD25+ T- 세 포가팽창되고, 이들세포상에서 FOXP3+ 의발현이상향조절되고, 시험관내항원 - 특이적 T 작동세포의활성화 가억제된다. [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] 본발명의트레지토프는모노클로날항체, 단백질치료제, 자가면역반응을촉진시키는자가항원, 알레르겐, 이식된조직에대한면역반응의조절, 및목적으로하는결과가관용인그밖의분야에유용하다. 본발명의트레지토프의선택실시양태를실시예 1의표 2에요약한다. 한실시양태에서, 본발명의트레지토프는표 2에기술하는바와같은단리된 T-세포에피토프이다. 표 2의트레지토프 ( 서열 4 내지 58) 는 MHC II형분자에결합할수있고, TCR을 MHC II형분자와관련하여개입시킬수있고, 천연조절 T-세포를활성화할수있다. 본발명의폴리펩티드는균질하게정제되거나부분적으로정제될수있다. 그러나, 폴리펩티드가균질하게정제되지않은제제가유용할것으로이해된다. 중요한것은다른성분이상당량존재하더라도제제가폴리펩티드의목적하는기능을발휘할수있도록하는것이다. 이에, 본발명은다양한정도의순도를포괄한다. 한실시양태에서, " 세포성물질이실질적으로없는 " 이라는말에는다른단백질 ( 예를들어, 오염단백질 ) 을약 30 % ( 건조중량기준 ) 미만, 다른단백질을약 20% 미만, 다른단백질을약 10% 미만, 또는다른단백질을약 5% 미만으로갖는폴리펩티드제제가포함된다. 폴리펩티드가재조합적으로생산된경우, 이것역시배양배지가실질적으로없을수있고, 예를들어배양배지는폴리펩티드제제부피의약 20% 미만, 약 10% 미만, 또는약 5% 미만을나타낸다. " 화학적전구체또는다른화학물질이실질적으로없는 " 이라는말에는합성에관여된화학적전구체또는다른화학물질로부터분리된폴리펩티드제제가포함된다. " 화학적전구체또는다른화학물질이실질적으로없는 " 이라는말에는, 예를들어화학적전구체또는다른화학물질을약 30% ( 건조중량기준 ) 미만, 화학적전구체또는다른화학물질을약 20% 미만, 화학적전구체또는다른화학물질을약 10% 미만, 또는화학적전구체또는다른화학물질을약 5% 미만으로포함하는폴리펩티드제제가포함될수있다. 아미노산서열들이적어도약 45 내지 55%, 전형적으로는적어도약 70 내지 75%, 보다전형적으로는적어도약 80 내지 85%, 보다더전형적으로는약 90% 이상상동이거나동일할경우, 본원에서사용되는 2종의폴리펩티드 ( 또는폴리펩티드영역 ) 는실질적으로상동이거나동일하다. 2종의아미노산서열또는 2종의핵산서열의상동성또는동일성백분율을측정하기위해, 서열들을최적의비교목적으로배열시킨다 ( 예를들어, 다른폴리펩티드또는핵산분자와의최적의배열을위해하나의폴리펩티드또는핵산분자의서열에틈을둘수있다 ). 이어서, 상응하는아미노산위치또는뉴클레오티드위치의아미노산잔기또는뉴클레오티드를비교한다. 한서열에서의위치가다른서열의상응하는위치의동일한아미노산잔기또는뉴클레오티드로채워져있는경우, 그분자들은그위치에서상동성이다. 본원에서사용되는아미노산또는핵산 " 상동성 " 은아미노산또는핵산 " 동일성 " 과대등한의미이다. 두서열간의상동성백분율은서열에의해공유되는동일한위치의수의함수이다 ( 예를들어, 상동성백분율은동일한위치의수 / 총위치의수 100과같다 ). 본발명은또한, 동일성정도가낮지만본발명의핵산분자에의해코딩되는폴리펩티드가수행하는기능과동일한기능을하나이상수행하는데충분한유사성을갖는폴리펩티드도포괄한다. 유사성은보존적아미노산치환으로판단한다. 그러한치환은폴리펩티드의주어진아미노산이유사한특징의다른아미노산으로치환된것이다. 보존적치환은표현형적으로드러나지않을수있다. 보존적치환으로서전형적으로관찰되는것은지방족아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile 중에서서로간의대체, 히드록실잔기 Ser과 Thr의상호교환, 산성잔기 Asp와 Glu의교환, 아미드잔기 Asn과 Gln 사이의치환, 염기성잔기 Lys과 Arg의교환, 및방향족잔기 Phe와 Tyr 사이의대체이다. 아미노산변화가표현형적으로드러나지않을수있다는것에관한사항은, 예를들어

10 문헌 [Bowie, J. et al., Science, 247: , 1990] 에서확인된다. [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] [0083] 변이체폴리펩티드는하나이상의치환, 결실, 삽입, 역위, 융합및절단, 또는이들중임의의것의조합으로인해아미노산서열이상이할수있다. 변이체폴리펩티드는완전하게기능적일수있거나, 또는하나이상의활성중에서부족한기능이있을수있다. 완전하게기능적인변이체는전형적으로보존적변이만을함유하거나, 중요하지않은잔기또는중요하지않은영역에서의변이만을함유한다. 기능적변이체는또한기능상에변화를야기하지않거나현저하지않은변화를야기하는유사한아미노산의치환을함유할수있다. 다르게는, 그러한치환은기능에어느정도로긍정적이거나부정적인영향을미칠수있다. 비-기능적인변이체는전형적으로비-보존적인아미노산치환, 결실, 삽입, 역위또는절단을하나이상함유하거나, 중요한잔기또는중요한영역에치환, 삽입, 역위또는결실을함유한다. 변이체폴리펩티드의다수의예가표 2에포함되어있다. 본발명은또한본발명의폴리펩티드의폴리펩티드단편을포함한다. 본발명은또한본원에서기술하는폴리펩티드의변이체의단편도포괄한다. 본원에서사용되는단편은적어도 5개의연속하는아미노산을포함한다. 유용한단편으로는폴리펩티드의생물학적활성을하나이상보유하는것뿐만아니라, 폴리펩티드-특이적항체를생성하는면역원으로사용될수있는것도포함된다. 생물학적으로활성인단편은아미노산길이가, 예를들어약 6, 9, 12, 15, 16, 20 또는 30개, 또는그이상이다. 단편들은 ( 다른아미노산또는폴리펩티드와융합되지않고 ) 분리되어있을수있거나보다큰폴리펩티드내에존재할수있다. 수개의단편들이단일의보다큰폴리펩티드내에포함되어있을수있다. 한실시양태에서, 숙주에서의발현을위해설계된단편은폴리펩티드단편의아미노말단에융합된이종성프리 (pre)- 및프로 (pro)-폴리펩티드영역, 및단편의카르복실말단에융합된부가적인영역을가질수있다. 본발명은또한키메라또는융합폴리펩티드를제공한다. 여기에는본발명의폴리펩티드와실질적으로상동성이아닌아미노산서열을갖는이종단백질또는폴리펩티드에작동적으로연결된본발명의폴리펩티드가포함된다. " 작동적으로연결된 " 이란, 폴리펩티드및이종단백질이프레임내에서융합된것을말한다. 이종단백질은폴리펩티드의 N-말단또는 C-말단에융합될수있다. 한실시양태에서, 융합폴리펩티드는폴리펩티드자체의기능에영향을미치지않는다. 예를들어, 융합폴리펩티드는폴리펩티드서열이 GST 서열의 C-말단에융합된 GST-융합폴리펩티드일수있다. 다른유형의융합폴리펩티드로는효소적융합폴리펩티드, 예를들어베타-갈락토시다제융합체, 효모 2-하이브리드 GAL 융합체, 폴리-His 융합체및 Ig 융합체가있지만, 이들로한정되는것은아니다. 그러한융합폴리펩티드, 특히폴리-His 융합체또는친화성표지융합체는재조합폴리펩티드의정제를용이하게할수있다. 특정한숙주세포 ( 예를들어, 포유동물숙주세포 ) 에서, 폴리펩티드의발현및 / 또는분비는이종성신호서열을이용하는것에의해증가될수있다. 따라서, 또다른실시양태에서융합폴리펩티드는그의 N-말단에이종성신호서열을함유한다. 키메라또는융합폴리펩티드는표준재조합 DNA 기술을이용하여생산할수있다. 예를들어, 통상적인기술에따라상이한폴리펩티드서열을코딩하는 DNA 단편들을프레임내에서함께연결시킨다. 또다른실시양태에서는, 자동 DNA 합성기를비롯한통상적인기술을이용하여융합유전자를합성할수있다. 이와달리, 2개의연속적핵산단편사이에상보적으로걸쳐져서후속적으로어닐링및재증폭되어키메라핵산서열을생성할수있는앵커프라이머를이용하여핵산단편을 PCR 증폭시킬수있다 ( 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1992]). 또한, 융합잔기 ( 예를들어, GST 단백질 ) 를이미코딩하고있는많은발현벡터들을시중에서구입할수있다. 본발명의폴리펩티드를코딩하고있는핵산분자를그러한발현벡터로클로닝하여상기폴리펩티드에융합잔기를프레임내에서연결시킬수있다. 단리된폴리펩티드는이를천연적으로발현하는세포로부터정제될수있거나, 이를발현하도록변경된세포 ( 재조합체 ) 로부터정제될수있거나, 공지된단백질합성방법을사용하여합성될수있다. 한실시양태에서, 폴리펩티드는재조합 DNA 기술에의해생산된다. 예를들어, 폴리펩티드를코딩하는핵산분자를발현벡터내로클로닝하고, 발현벡터를숙주세포에도입하고, 숙주세포에서폴리펩티드를발현시킨다. 이어서, 표준단백질정제기술을사용하여적절한정제계획에의해세포로부터폴리펩티드를단리할수있다. 본발명은또한본발명의폴리펩티드의전부또는일부를코딩하는핵산을제공한다. 본발명의핵산분자는벡터에삽입될수있고, 예를들어발현벡터또는유전자치료법벡터로서사용될수있다. 유전자치료법벡터는, 예를들어정맥내주사, 국소투여 ( 미국특허제5,328,470호 ), 또는입체정위주사 ( 문헌 [Chen, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: , 1994]) 로대상체에게전달할수있다. 유전자치료법벡터의제약제제는허용되는희석제중에유전자치료법벡터를포함할수있거나, 또는유전자전달비히클이함침된서방성매트릭스를포함할수있다. 이와달리, 재조합세포로부터완전한유전자전달벡터, 예를들어

11 레트로바이러스성벡터를그대로생산할수있는경우, 제약제제는유전자전달시스템을생성하는세포를하 나이상포함할수있다. 제약조성물은용기, 팩, 또는디스펜서에투여지침서와함께포함될수있다. [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] [0090] 본발명의트레지토프는대립유전자또는서열변이체 (" 돌연변이 ") 또는그의유사체를포함할수있거나, 또는화학적개질 ( 예를들어, 페길화, 글리코실화 ) 를포함할수있다. 일례에서, 돌연변이는 MHC 분자에대한증진된결합을제공할수있다. 다른예에서, 돌연변이는 TCR에대한결합을증진시킬수있다. 또다른예에서, 돌연변이는 MHC 분자및 / 또는 TCR에대한결합을감소시킬수있다. 또한의도되는것으로는결합은하지만 TCR을통한신호전달은하지않는돌연변이가있다. 본발명은키메라단백질조성물인트레지토프조성물을제공한다. 한실시양태에서, 트레지토프조성물은제1 사슬이서열 4 내지 58 또는그의임의의조합을포함하고제2 사슬이생물학적으로활성인분자를포함하는것인, 함께연결된제1 폴리펩티드사슬및제2 폴리펩티드사슬을포함한다. 한실시양태에서, 생물학적으로활성인분자는면역원성분자 ; T-세포에피토프 ; 바이러스성단백질 ; 박테리아성단백질로이루어진군으로부터선택된다. 한실시양태에서, 본발명의트레지토프조성물은제1 사슬이 289 내지 309 영역의아미노산이 MHC II형분자에결합되지않도록변형된 Fc 영역을포함하고제2 사슬이면역원성분자를포함하는것인, 함께연결된제1 폴리펩티드사슬및제2 폴리펩티드사슬을포함한다. 한측면에서, 본발명은서열 4 내지 58의적어도일부를인식하는조절 T-세포주를생산하는방법을제공한다. 한실시양태에서는, 서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된하나이상의펩티드를적절한부형제와의혼합물로합한다. 그러한조성물은적절한부형제와의혼합물의국소전달이대상체의염증을감소시켜염증의예방또는치료를필요로하는대상체에서염증을예방또는치료하는방법에유용하다. 한실시양태에서는, 서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된하나이상의펩티드를항원또는알레르겐과의혼합물로합한다. 그러한조성물은항원또는알레르겐과의혼합물의국소전달이대상체에서항원또는알레르겐에대한관용을증가시켜항원또는알레르겐에대한관용의유도를필요로하는대상체에서항원또는알레르겐에대한관용을유도하는방법에유용하고, 항원또는알레르겐에대한관용을유도하는적절한부형제와함께전달한다. 한실시양태에서, 본발명은서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된하나이상의트레지토프폴리펩티드를코딩하는핵산을제공한다. 한실시양태에서, 본발명은서열 4 내지 58로이루어진군으로부터선택된하나이상의트레지토프폴리펩티드를코딩하는핵산을포함하는벡터를제공한다. 한실시양태에서, 본발명은본발명의벡터를포함하는세포를제공한다. 세포는포유동물세포, 박테리아세포, 곤충세포, 또는효모세포일수있다. 트레지토프특이적 T-세포의클로닝트레지토프특이적 T-세포의클로닝은당업자에게공지된기술을이용하여실시할수있다. 예를들어, 단리된 PBMC를 20% HSA를함유하는 RPMI 배지 10 μg /ml에서트레지토프로자극한다. IL-2를 5일째부터격일로첨가한다 (10 U/ml의최종농도 ). 11일째또는 12일째에 4량체풀을이용하여 T-세포를염색한다. 각각의풀에 대해, 개세포를배양배지 50 ml 중에서 PE-표지된 4량체 0.5 mg (10 mg/ml) 과함께 37 에서 1 내지 2시간동안인큐베이션한다음, 실온에서 15분동안항-CD4-FITC ( 미국캘리포니아주샌디에고소재의 BD 파밍겐 (BD PharMingen)) 로염색한다. 세포를세척하고벡턴딕킨슨 (Becton Dickinson) FACSCalibur 유세포분석기 ( 미국캘리포니아주산호세소재의벡턴딕킨슨 ) 로분석한다. 양성으로염색된풀에대해상응하는단일의펩티드로적재된 4량체를생성하고, 14일또는 15일째에분석을행한다. 당일또는그다음날에특정사량체에대해양성인세포를벡턴딕킨슨 FACSVantage ( 미국캘리포니아주산호세소재 ) 를이용하여 96-웰 U자바닥형플레이트로단일세포분류한다. 분류된세포를 PHA 2.5 mg/ml와함께영양세포로서웰당 개의일치하지않는, 조사된 (5000 rad) PBMC로팽창시키고, 24시간후에 IL-2 10 U/ml를첨가한다. ( 동족펩티드또는대조군펩티드, HA 로적재된 ) 4량체를이용한염색및특이적펩티드 10 mg/ml에의한 T-세포증식검정으로클로닝된 T-세포의특이성을확인한다 ( 문헌 [Novak, E. et al., J. Immunol., 166: , 2001]). [0091] [0092] 트레지토프조성물의사용방법 한측면에서, 본발명은소분자를설계하기위한트레지토프의사용방법을제공한다. 본발명의한방법에서, 트레지토프 - 특이적 T 세포를 1 μg/ml 농도의소분자혼합물의풀및자가수지상세포 (DC) 로 2 주간격으로 3

12 회자극시킨후, 이종 DC 및항원으로자극시킨다. 둥근바닥 96웰플레이트의웰마다 T 세포 (1.25 x 10 5 개 ) 및 DC (0.25 x 10 5 개 ) 를첨가한다. 500 ml의 RPMI 배지 1640에 50 ml의 FCS ( 하이클론 (HyClone)), 페니실린, 및스트렙토마이신 ( 기브코 (GIBCO)); 20 mm Hepes ( 기브코 ); 및 4 ml의 1 N NaOH 용액을보충함으로써 T-세포배지를제조한다. IL-2 농도는초기에는 0.1 nm이고자극의후속라운드동안서서히 1 nm로증가시킨다. 2 nm IL-2를함유하는배지에서 1 μg/ml 피토헤마글루티닌 ( 디프코 (Difco)) 및영양세포로서의 0.6 x 10 5 개의엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스-형질전환된 B-세포 (100 그레이 ) 및 1.3 x 10 5 개의이종말초혈액단핵세포 (33 그레이 ) 를사용하여한계희석시킴으로써 T 세포클론이유도된다. 트레지토프특이적 T 세포를자극하는소분자풀을이어서개개의분자로서시험한다. [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] 한측면에서, 본발명은 T-세포수용체를클로닝하기위한트레지토프의사용방법을제공한다. 전체 RNA를 RNeasy 미니키트 ( 퀴아젠 (Qiagene)) 를이용하여상기기재한바와같이생산된트레지토프특이적 T 세포주로부터추출한다. 전체 RNA 중 1 μg을사용하여 cdna 말단고속증폭 (RACE) 방법 (GeneRacer 키트, 인비트로젠 (Invitrogen)) 에의해 TCR cdna를클로닝한다. 단쇄 cdna를합성하기전에, RNA를탈인산화하고, 캡핑을제거하고, 5' RACE GeneRacer 키트의사용설명서에따라 RNA 올리고뉴클레오티드로라이게이션한다. SuperScript II RT 및 GeneRacer 올리고-dT가 RNA 올리고-라이게이션 mrna의단쇄 cdna로의역전사를위해사용된다. 5' RACE는, 각각 TCR α, β1 또는 β2 사슬을위한 3' 프라이머로서유전자-특이적프라이머 TCRCAR (5'-GTT AAC TAG TTC AGC TGG ACC ACA GCC GCA GC-3'; 서열 64) 또는 TCRCB1R (5'-CGG GTT AAC TAG TTC AGA AAT CCT TTC TCT TGA CCA TGG C-3'; 서열 65), 또는 TCRCBR2 (5'-CTA GCC TCT GGA ATC CTT TCT CTT G-3'; 서열 66) 및 5' 프라이머로서 GeneRacer 5' (GeneRacer 키트 ) 를이용하여수행한다. 폴리머라제연쇄반응 (PCR) 산물을 pcr2.1 TOPO 벡터 ( 인비트로젠 ) 로클로닝한후에원샷 TOP10 컴피턴트에스케리치아콜라이 (Escherichia coli) ( 인비트로젠 ) 로형질전환시킨다. 플라스미드 DNA를 TCR α, β1, 및 β2 사슬에대한각각의작제물로부터의 96개의개별적클론으로부터제조한다. 모든플라스미드의전장삽입물을서열분석하여 vα/vβ 함량을측정한다 ( 문헌 [Zhao, Y. et al., J. Immunother., 29: , 2006]). 제약제형본발명은제약상허용되는담체또는부형제중의치료적유효량의트레지토프를투여하는것을포함하는, 의학적상태를갖는대상체의치료방법을제공한다. 본발명의트레지토프는투여하기에적합한제약조성물로혼입될수있다. 제약조성물은일반적으로 1개이상의트레지토프및제약상허용되는담체를대상체에투여하기에적합한형태로포함한다. 제약상허용되는담체는부분적으로투여되는특정한조성물및조성물을투여하기위해사용되는특정한방법에의해결정된다. 따라서, 트레지토프조성물을투여하기위한적합한제약조성물제형이다수존재한다 ( 예를들어문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990] 참조 ). 제약조성물은일반적으로무균상태로, 실질적으로등장성으로, 또한미국식품의약국의모든의약품제조관리기준 (GMP) 을위반하지않도록제형화된다. 용어 " 제약상허용되는 ", " 생리학적으로허용되는 ", 및이들의문법적변형용어들은, 이들이조성물, 담체, 희석제및시약을언급할경우에, 상호교환하여사용할수있으며물질이원치않는생리학적효과를조성물의투여를방해할정도로는유발하지않으면서대상체에또는대상체상에투여될수있음을나타낸다. 예를들어 " 제약상허용되는부형제 " 란일반적으로안전하고, 비-독성이며, 목적하는제약조성물의제조에유용한부형제를의미하고, 인간대상의제약용도뿐만아니라, 수의학적용도로도허용되는부형제를포함한다. 이러한부형제는고체, 액체, 반고체, 또는에어로졸조성물의경우에는기체일수있다. 당업자라면본발명의조성물및특정약물에대하여투여의적절한시점, 순서및투여량을결정할수있을것이다. 이러한담체또는희석제의바람직한예로는물, 식염수, 링거액, 덱스트로스용액, 및 5% 인간혈청알부민이있으나, 이들로한정되지는않는다. 리포솜및비-수성비히클, 예컨대고정유또한사용가능하다. 제약활성물질을위한상기매질및화합물의사용은당업계에널리공지되어있다. 임의의통상의매질또는화합물이트레지토프와비상용성인경우를제외하고는, 조성물에그의사용이고려된다. 추가활성화합물을또한조성물에혼입할수있다. 본발명의제약조성물은그의목적하는투여경로와상용성이도록제형화된다. 본발명의트레지토프조성물은비경구, 국소, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 피내, 경피, 직장, 두개내, 복강내, 비내 ; 질 ; 근육내경로로또는흡입물로서투여할수있다. 본발명의몇몇실시양태에서, 제제는침착물이축적된특정조직으로직접주입되는데, 예를들면두개내로주입된다. 근육내주입또는정맥내주입이트레지토프의투여에바람직하다.

13 어떤방법에서는, 본발명의특정트레지토프를두개골에직접주입한다. 어떤방법에서는, 본발명의트레지 토프를서방형조성물또는장치, 예컨대메디패드 (Medipad) 장치로서투여한다. [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] [0105] [0106] 본발명의트레지토프는임의적으로본원에기재한다양한의학적상태를치료하는데적어도부분적으로효과적인다른작용제와함께투여할수있다. 대상체의중추신경계에투여하는경우에, 본발명의트레지토프는또한본발명의작용제의혈액-뇌장벽의관통을증대시키는다른작용제와함께투여할수있다. 비경구, 피내, 또는피하적용을위해사용되는용액또는현탁액은다음성분을포함할수있다 : 멸균희석제, 예컨대주사용수, 식염수, 고정유, 폴리에틸렌글리콜, 글리세린, 프로필렌글리콜또는여타다른합성용매 ; 항박테리아화합물, 예컨대벤질알콜또는메틸파라벤 ; 항산화제, 예컨대아스코르브산또는소듐비술파이트 ; 킬레이팅화합물, 예컨대에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA); 완충제, 예컨대아세테이트, 시트레이트또는포스페이트, 및장성조절화합물, 예컨대염화나트륨또는덱스트로스. ph는산또는염기, 예컨대염산또는수산화나트륨을이용하여조정할수있다. 부형제의예로는전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 곡분, 백악, 실리카겔, 물, 에탄올, DMSO, 글리콜, 프로필렌, 건조탈지유등이포함될수있다, 조성물은또한 ph 완충제, 및습윤제또는유화제도함유할수있다. 비경구제제는유리또는플라스틱으로제조된앰풀, 일회용주사기또는다중용량바이알에봉입할수있다. 주사용으로적합한제약조성물은멸균수용액 ( 수용성인경우 ) 또는분산액및멸균주사용액또는분산액의즉석제조를위한멸균분말을포함한다. 정맥내투여의경우에, 적합한담체로는생리식염수, 정균수, 크레모포르 (Cremophor) ELTM ( 미국뉴저지주파시파니소재의바스프 (BASF)) 또는포스페이트완충식염수 (PBS) 가있다. 모든경우에, 조성물은무균상태이고용이한주사능이존재하는정도로유동성이어야한다. 조성물은제조및보관조건하에서안정하고박테리아및진균과같은미생물의오염작용에대해보존처리된다. 담체는, 예를들어물, 에탄올, 폴리올 ( 예를들면, 글리세롤, 프로필렌글리콜및액체폴리에틸렌글리콜등 ), 및이들의적합한혼합물을함유하는분산매질또는용매일수있다. 적절한유동성은, 예를들어레시틴과같은코팅을사용함으로써, 분산액의경우에는요구되는입자크기를유지함으로써, 또한계면활성제를사용함으로써유지할수있다. 미생물작용의방지는다양한항박테리아성및항진균성화합물, 예를들면파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살등에의해달성할수있다. 수많은경우에, 등장성화합물, 예를들면당, 폴리알콜, 예컨대만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을조성물에포함시키는것이바람직할것이다. 주사가능한조성물의장시간흡수는조성물에흡수를지연시키는화합물, 예를들면알루미늄모노스테아레이트및젤라틴을포함시킴으로써달성할수있다. 멸균주사액은필요한양의트레지토프를, 필요에따라서는상기나열한성분들중 1종또는그들의조합물이포함된적절한용매에혼입한후에멸균여과함으로써제조할수있다. 일반적으로, 분산액은결합제를기본분산매질및상기나열한것들로부터의필요한다른성분들을함유하는멸균비히클에혼입함으로써제조한다. 멸균주사액의제조를위한멸균분말의경우에, 제조방법은미리멸균여과된용액으로부터활성성분과임의의부가적인바람직한성분의분말을수득하는진공건조및동결건조이다. 본발명의제제는활성성분의서방형또는박동형방출을가능하게하는방식으로제형화될수있는이식물또는데포주사제제의형태로투여할수있다. 경구조성물은일반적으로비활성희석제또는식용담체를포함한다. 이들은젤라틴캡슐에봉입되거나정제로압축될수있다. 경구치료투여를위해, 결합제가부형제와함께혼입되고정제, 트로키또는캡슐의형태로사용될수있다. 경구조성물은또한양치물약으로서사용하기위해유동성담체를사용하여제조할수있는데, 여기서유동성담체중의화합물은경구로적용되며스위싱 (swishing) 하고뱉어내거나삼킨다. 제약상허용되는결합화합물및 / 또는보조물질이조성물의부분으로포함될수있다. 정제, 환제, 캡슐, 트로키등은임의의다음성분또는유사한특성의화합물을함유할수있다 : 결합제, 예컨대미정질셀룰로스, 검트래거캔스또는젤라틴 ; 부형제, 예컨대전분또는락토스, 붕해화합물, 예컨대알긴산, 프리모겔 (Primogel) 또는옥수수전분 ; 윤활제, 예컨대마그네슘스테아레이트또는스테로테스 (Sterotes); 활탁제, 예컨대콜로이드성이산화규소 ; 감미화합물, 예컨대수크로스또는사카린 ; 또는향미화합물, 예컨대페퍼민트, 메틸살리실레이트또는오렌지향미제. 흡입에의한투여를위해, 트레지토프 ( 들 ) 는적합한추진제, 예를들면이산화탄소와같은기체를함유하는가압용기또는디스펜서, 또는네불라이저로부터에어로졸스프레이의형태로전달된다. 전신투여는또한경점막또는경피수단에의한투여일수있다. 경점막또는경피투여를위해, 침투해야할

14 장벽에대해적절한침투제가제형에사용된다. 이러한침투제는일반적으로당업계에공지되어있으며, 예를들어경점막투여의경우에는디터전트, 담즙산염및후시딘산유도체를포함한다. 경점막투여는비강스프레이또는좌제의사용을통해달성될수있다. 경피투여를위해, 트레지토프는연고, 고약, 젤또는크림으로제형화되고국소적으로또는당업계에널리공지된경피패치기법을통해적용된다. [0107] [0108] [0109] [0110] [0111] [0112] 트레지토프는또한직장전달을위해정체관장으로또는좌제 ( 예를들면, 코코아버터및기타글리세리드와같은통상의좌제기제와함께 ) 의형태로제약조성물로서제조될수있다. 한실시양태에서, 트레지토프는임플란트및미세캡슐화전달시스템을비롯한제어-방출제형과같이, 신체로부터의신속한제거에대해트레지토프를보호하는담체를이용하여제조한다. 생분해성및생체적합성중합체, 예를들면에틸렌비닐아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르및폴리락트산을사용할수있다. 이러한제형의제조방법은당업자에게자명할것이다. 재료는또한알자코포레이션 (Alza Corporation) 및노바파마슈티칼즈, 인크.(Nova Pharmaceuticals, Inc.) 로부터상업적으로입수할수있다. 리포솜현탁액 ( 바이러스항원에대한모노클로날항체를갖는감염세포에대해표적화된리포솜포함 ) 또한제약상허용되는담체로서사용할수있다. 이들은당업자에게공지된방법에따라제조할수있다 ( 미국특허제4,522,811호 ). 트레지토프또는키메라단백질은트레지토프또는키메라단백질의목적하는부위로의느린방출을가능하게하는생중합체고체지지체내에이식되거나또는그러한지지체와연결될수있다. 투여의용이함및투여량의균일성을위해투여단위형태로경구또는비경구조성물을제형화하는것이특히유리하다. 본원에서사용되는투여단위형태는치료대상체를위한단위투여량으로서적합화된물리적으로분리된단위를가리키고 ; 각각의단위는필요한제약담체와함께목적하는치료효과를나타내도록계산한소정량의결합제를함유한다. 본발명의투여단위형태에대한명세는결합제의특별한성질및달성하고자하는특정한치료효과, 및대상체의치료를위해이러한트레지토프를배합하는기술본래의한계에의해지시되고직접적으로좌우된다. 의학적상태의예방또는치료방법본발명은, 예를들면본발명의트레지토프또는키메라단백질을투여함으로써의학적상태를치료하는것을포함하는하나이상의의학적상태의치료방법에관한것이다. 의학적상태는, 예를들면일차성면역결핍증 ; 면역-매개성혈소판감소증, 가와사끼 (Kawasaki) 병, 20세이상의환자에서의조혈모세포이식, 만성 B-세포림프구성백혈병및소아 HIV 제1형감염일수있다. 구체적인예로는 ( 혈액학 ) 재생불량성빈혈, 순수적혈구무형성증, 다이아몬드-블랙판 (Diamond-Blackfan) 빈혈, 자가면역용혈성빈혈, 신생아의용혈성질환, 후천성 VIII 인자억제제, 후천성폰빌러브란트 (von Willebrand) 병, 면역-매개성호중구감소증, 혈소판수혈불응증, 신생아동종면역성 / 자가면역성혈소판감소증, 수혈후자반증, 혈전혈소판감소성자반 / 용혈성요독증후군 ; ( 감염성질환 ) 감염성질환에걸리면해로울수있는상태, 예를들면저체중출산 ( 예를들면, < 1500 g), 실질장기이식술, 수술, 외상, 화상및 HIV 감염 ; ( 신경학 ) 간질및소아난치성길랑-바레 (Guillain-Barre) 증후군, 만성염증성탈수초화다발성신경병증, 중증근무력증, 람베르트-이튼 (Lambert-Eaton) 근무력증후군, 다초점성운동신경병증, 다발성경화증 ; ( 산과학 ) 습관성유산 ; ( 호흡기학 ) 천식, 만성흉부증후군, 류머티즘, 류머티스성관절염 ( 성인및아동 ), 전신홍반성루푸스, 전신성혈관염, 피부근염, 다발성근염, 봉입체근염, 베게너 (Wegener) 육아종증 ; ( 기타 ) 부신백질이영양증, 근위축성측삭경화증, 베체트 (Behcet) 증후군, 급성심근증, 만성피로증후군, 선천성심장블록, 낭포성섬유증, 자가면역성수포성피부병, 진성당뇨병, 급성특발성자율신경병증, 급성파종성뇌척수염, 내독소혈증, 용혈성수혈부작용, 혈구탐식증후군, 급성림프아구성백혈병, 하위운동신경원증후군, 다발성골수종, 인간 T-세포백혈병바이러스-1-관련척수병증, 신염증후군, 막성신장병증, 신증후군, 갑상선기능안구병증, 간대성-근경련증, 재발성중이염, 부종양성소뇌변성, 파라프로테인성신경병증, 파보바이러스감염 ( 일반 ), 다발성신경병증, 장기비대증, 내분비계질환, M-단백질, 및피부변화 (POEMS) 증후군, 진행성요천추신경총병증, 라임근신경염, 라스머센 (Rasmussen) 증후군, 라이터 (Reiter) 증후군, 급성신부전증, 혈소판감소증 ( 비면역성 ), 연쇄구균성독성쇼크증후군, 포도막염및보그트-코야나기-하라다 (Vogt-Koyanagi-Harada) 증후군이있다. 특정한실시양태에서, 본발명은, 예를들면알레르기, 자가면역질환, 이식-관련장애, 예컨대이식편대숙주질환, 효소또는단백질결핍장애, 지혈장애, 암, 불임, 또는감염 ( 바이러스, 박테리아또는기생충 ) 의치료방법에관한것이다. 본발명의트레지토프또는키메라단백질은부작용을감소시키거나또는공동-투여되는화합물의효능을증대시키기위해의학적상태를갖는대상체를치료하는데사용되는다른단백질또는화합물과함께사용할수있다.

15 [0113] 알레르기에의적용. 알레르겐 - 특이적조절 T- 세포는알레르기및천식의발생을제어함에있어중요한역할을 한다. 천연발생 CD4/CD25 조절 T- 세포및 2 차적 T Reg ( 항원 - 특이적조절 T- 세포 ) ( 둘다전사인자 FOXp3 을발 현함 ) 는둘다알레르기질환에연관된부적절한면역반응을억제한다고나타나있다. 다수의최근연구에의하면, 조절 T-세포는동물모델에서뿐만아니라인간에서도, 감수성개인에서의 T-보조 2형편향면역반응의과발생을제어함에있어중요한역할을한다고나타난다. 최근연구에의하면, 조절 T-세포는또한 TGF-β 및 IL-10의분비에의해 T-세포공동자극을억제한다고나타나는데, 이는알레르기성장애의조절에서의조절 T-세포의중요한역할을시사한다. 천연또는적응조절 T-세포의팽창이약화되면알레르기의발생을유도하고, 알레르겐-특이적조절 T-세포를유도하는치료가알레르기및천식에대한치유적요법을제공할것이다. [0114] [0115] 천식의예방및치료둘다를위한하나의전략은조절 T-세포의유도이다. 동물은 Th1 또는 Tr 반응을야기하는면역자극에의해천식발생으로부터보호될수있다. 이식에의적용. 본발명의트레지토프는공여자세포에대한면역반응을특이적으로하향조절하는세포의발생을촉진함으로써, 이식과정동안의관용을유도하기에유용하다. 기관-특이적자가면역을치료하기위한 Ag-특이적 T Reg 세포의유도는일반화된면역억제를회피하는중요한치료적발전이다. 골수이식의뮤린모델 에서, T Reg 는유익한이식편대종양면역학적효과를훼손하지않으면서, 공여자골수생착을촉진하고이식편대숙주질환의발병률및중증도를감소시킨다. 이러한발견은, 마우스및인간에서의 T Reg 가표현형및구조적특성을공유한다는발견과함께, 인간조혈세포이식과관련된합병증을감소시키기위한상기세포의사용으로의활동적인연구를이끌어냈다. T Reg 와작동 T-세포의불균형은이식편대숙주질환발전의원인이다. 그러나, 면역조절의메커니즘, 특히 T Reg 의동종인식성질, 그의다른면역세포에대한효과및상호작용, 및그의억제활성의부위는잘이해되지않고있다. [0116] 인간및실험동물모델둘다로부터축적되는증거들은이식편대숙주질환 (GVHD) 발생에서의 T Reg 의연관성 을암시하였다. T Reg 가 GVHD를이식편대종양 (GVT) 활성과구별할수있다는증명은 T Reg 의면역억제잠재성이 GVT 효과에대한불리한결과없이 GVHD를감소시키도록조작될수있음을시사한다. 억제능력을갖는다양한 T 림프구가보고되어있지만, 2가지최상의특징을갖는서브세트는천연적으로발생하는흉선내-발생 T Reg ( 천연 T Reg ) 및말초발생유도성 T Reg ( 유도성 T Reg ) 이다. [0117] 자가면역에의적용. 트레지토프는면역원성화합물 ( 단백질치료제 ) 에대한관용화제로서사용할수있다. 상 기발견은단백질치료제고안에대한암시를갖는다. 따라서, 트레지토프와모노클로날항체, 자가시토킨또 는외래단백질의병용투여는역 T 작동면역반응을억제한다. 생체내에서, T Reg 는수지상세포를통해작용 하여자가반응성 T-세포활성화를제한하므로, 그의차별화및작동기능의습득을막는다. 활성화된병원성세포의공급을제한함으로써, T Reg 는자가면역질환의진행을예방하거나늦춘다. 그러나, 이러한보호메커니즘은, 아마도 T Reg 세포의부족및 / 또는장시간질환과정동안의 T Reg -내성병원성 T-세포의발생및축적때문에, 자가면역개인에서불충분해보인다. 따라서, 상기환자에서자가-관용의회복은진행중인조직손상을제어하는증가된능력을가진 T Reg 의주입과함께병원성 T-세포의제거를필요로할수있다. 기관-특이적자가면역질병, 예를들어갑상선염및인슐린-의존성당뇨병은상기관용메커니즘의파괴로인한것이었다. [0118] [0119] 당뇨에의적용. 1형 ( 소아 ) 당뇨는인슐린-생산췌장베타-세포의파괴로인한기관-특이적자가면역질환이다. 당뇨가아닌경우, 섬세포항원-특이적 T-세포는흉선발달시소모되거나, 섬세포항원에대한작동반응을능동적으로억제하는조절 T-세포로전환된다. 소아당뇨에서및소아당뇨의 NOD 마우스모델에서, 상기관용메커니즘은상실된다. 상기메커니즘없이, 섬세포항원은인간백혈구항원 (HLA) I형및 II형분자에의해제시되고, CD8(+) 및 CD4(+) 자가-반응성 T-세포에의해인식된다. 이들자가-반응성세포에의한섬세포의파괴는궁극적으로글루코스불관용을야기시킨다. 트레지토프및섬세포항원의공동투여는천연조절 T-세포의활성화및존재하는항원특이적작동 T-세포의조절표현형으로의전환을야기시킨다. 이러한방식으로, 해로운자가면역반응의방향을바꾸어항원-특이적적응관용을유도한다. 항원-특이적관용의유도에의해자가에피토프에대한자가-면역반응을조절하는것은진행중인베타-세포파괴를막을수있다. 따라서, 본발명의트레지토프는당뇨의예방또는치료를위한방법에유용하다. B형간염 (HBV) 감염에의적용. 만성 HBV는보통 ( 모자전달에의해 ) 습득되거나, 또는성인에서의급성 HBV

16 감염의드문결과일수있다. 만성 B형간염 (CH-B) 의급성악화는 B형간염코어및 e 항원 (HBcAg/HBeAg) 에대한증가된세포독성 T-세포반응에의해동반된다. 최근의연구에서는, HBcAg 및 HbeAg로부터 MHC II형-제한에피토프펩티드를예측하기위하여 SYFPEITHI T-세포에피토프맵핑시스템이사용되었다. 높은점수의펩티드를사용하는 MHC II형 4량체가구축되고, T Reg 및 CTL 주파수를측정하기위해사용되었다. 결과는, HBcAg에특이적인 T Reg 세포가 HBcAg 펩티드-특이적세포독성 T-세포증가를동반하는악화동안감소됨을나타내었다. 관용시기동안, FOXp3-발현 T Reg 세포클론이확인되었다. 이들데이터는 HbcAg T Reg T-세포의감소가만성 B형간염바이러스감염자연사에서의자발적인악화를설명한다는것을시사한다. 따라서, 본발명의트레지토프는바이러스감염, 예를들어 HBV 감염의예방또는치료를위한방법에유용하다. [0120] SLE 에의적용. 전신홍반루푸스 (SLE) 또는쇼그렌증후군에서역할을하는 T Reg 에피토프가확인되었다. 상 기펩티드는스플라이시오솜단백질의잔기 (RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY; 서열 67) 을포함한다. 가용성 HLA II형분자와의결합분석및분자모델링실험은상기에피토프가무차별적인에피토프로서행동하고인간 DR 분자의거대패널에결합함을나타내었다. 정상 T-세포및루푸스가아닌자가면역환자의 T-세포와반대로, 무작위선택된루푸스환자의 40% 로부터의 PBMC는펩티드 에반응하여증식하는 T-세포를함유한다. 리간드의변화는 T-세포반응을변경시키는데, 이는상기펩티드에반응하는 T-세포의몇몇집단이존재하며, 이들가운데 T Reg 세포가있을수있음을시사한다. T 조절에피토프는또한쇼그렌증후군에서확인되었다. 따라서, 상기에피토프와함께공동-투여되는본발명의트레지토프는 SLE의예방또는치료를위한방법에유용하다. [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] [0126] [0127] 그레이브스병에의적용. 그레이브스병은갑상샘으로부터의호르몬의비정상적으로강한방출, 또는갑상선기능항진증을야기하는자가-갑상선자극호르몬수용체 (TSHR) 에대한항체를특징으로하는자가면역장애이다. 몇몇유전인자들은그레이브스병에대한감수성에영향을줄수있다. 여성은남성보다상기질환에훨씬더욱잘걸리며, 백인및아시아인집단은흑인집단보다더높은위험에있고, HLA DRB1-0301은상기질환과밀접하게연관된다. 따라서, TSHR 또는다른그레이브스병항원또는그의일부와본발명의트레지토프 ( 들 ) 의공동-투여는그레이브스병의예방또는치료를위한방법에유용하다. 자가면역갑상선염에의적용. 자가면역갑상선염은자가갑상선퍼옥시다제및 / 또는갑상선글로불린에대해항체가생길때발생하는, 갑상샘소포의점진적파괴를유발하는질병이다. HLA DR5는상기질환과밀접하게연관된다. 따라서, 갑상선퍼옥시다제및 / 또는갑상선글로불린 TSHR 또는그의일부와본발명의트레지토프의공동-투여는자가면역갑상선염의예방또는치료를위한방법에유용하다. 백신벡터고안에의적용. 수지상세포표면수용체 DEC-205를표적화하는모노클로날항체는백신항원을수지상세포로표적화할수있는백신벡터로서의가능성을보여주었다. 그러나, 강한염증면역반응의자극제로서의항-DEC-205의성공은비-특이적수지상세포성숙인자의공동-투여에따라달라진다. 상기인자가없으면, 항-DEC-205는면역보다는항원-특이적관용을유도한다. 그러므로, 항-DEC-205에함유된조절 T-세포에피토프는비-특이적면역-자극제의공동-투여를통해서만극복되는관용원성반응을촉진한다. 이점은실험적으로증명되었는데, 즉, 항-DEC-205 벡터에함유된트레지토프는조절 T-세포의항원-특이적팽창을유발하고염증면역반응을억제한다. 상기트레지토프를더이상 MHC 분자에결합하지못하도록변경하는것은관용원성을유의하게소멸시킬것이므로, 면역계의비-특이적활성화와관련된위험을제거하는효과적이고뛰어난항원전달시스템으로서의항-DEC-205의사용을가능하게한다. 키트본원에기재된방법은예를들면, 본원에기재된의학적상태의증상또는가족력을나타내는대상체를치료하기위해, 예컨대임상환경에서통상적으로사용할수있는 1종이상의본발명의트레지토프조성물을포함하는미리포장된키트를사용함으로써수행할수있다. 한실시양태에서, 키트는본원에기재된의학적상태의증상또는가족력을나타내는대상체를치료하기위한, 1종이상의본발명의트레지토프조성물의사용을위한설명서를추가로포함한다. 트레지토프를사용한 T-조절세포의생체외팽창다른측면에서, 본발명은조절 T-세포의팽창을위한생체외방법을제공한다. 한실시양태에서, 본발명은 (a) 대상체로부터생물학적샘플을제공하는것 ; (b) 상기생물학적샘플로부터조절 T-세포를단리하고 ; 단리된조절 T-세포를 T-조절세포가수적으로증가하여팽창된조절 T-세포조성물을산출하는조건하에서유효량

17 의본발명의트레지토프조성물과접촉시킴으로써, 생물학적샘플에서의조절 T-세포를팽창시키는것을포함하는, 생물학적샘플에서의조절 T-세포를팽창시키는방법을제공한다. 한실시양태에서, 상기방법은팽창된조절 T-세포조성물을대상체에투여하는단계를더포함한다. 한실시양태에서, 팽창된조절 T-세포조성물이투여된대상체는, 예컨대팽창된조절 T-세포조성물의자가이식에의하여원래의생물학적샘플을얻은것과동일한개체이다 (Ruitenberg, J. et al, BMC Immunol., 7:11, 2006). [0128] [0129] 트레지토프조성물의시험관내용도다른측면에서, 본발명은시험관내실험모델에서의조절 T-세포기능의연구에서시약으로서의본발명의트레지토프조성물의용도를제공한다. 한실시양태에서, 본발명은 (a) 대상체로부터생물학적샘플을제공하는것 ; (b) 상기생물학적샘플로부터조절 T-세포를단리하고 ; 단리된조절 T-세포를 T-조절세포가하나이상의생물학적기능을변경시키도록자극받는조건하에서유효량의본발명의트레지토프조성물과접촉시킴으로써, 생물학적샘플에서의조절 T-세포를자극하는것을포함하는, 생물학적샘플에서의조절 T-세포를시험관내에서자극하는방법을제공한다. 한실시양태에서, 본발명은조절 T-세포또는그의단편에대한트레지토프의결합을측정하기위한시험관내방법을제공한다. [0130] 도면의간단한설명 도 1 은면역글로불린 G (IgG) 의모식도이다. 도 2는캡핑펩티드와비-캡핑펩티드를비교하는일련의그래프도이다. PBMC를배양액중에서 8일동안 CEF ( 양성대조군펩티드풀 ) 단독 ( 상부패널 ), CEF + 트레지토프 289-아미드 ( 중앙패널 ), 또는 CEF + 트레지토프 -289-비-캡핑 ( 하부패널 ) 으로자극하였다. CEF 단독인큐베이션과비교하여, CEF와트레지토프-289-아미드의공동-인큐베이션에의해, 1) 보다높은백분율의조절표현형을갖는세포가나타났고 ( 좌측패널 ), 2) CEF 재자극에대한반응에서인터페론감마분비의관련된유의적 (p < ) 감소가나타났다 ( 우측패널 ). 반대로, 트레지토프 289-비-캡핑과의공동-인큐베이션 ( 하부패널 ) 에의해서는, CEF 단독인큐베이션 ( 상부패널 ) 에비해유의적차이가없음이나타났다. 도 3은트레지토프존재하의천연 Treg의활성화를나타낸다. 인간 PBMC를시험관내에서 4일동안파상풍독소펩티드 (TT ) 또는트레지토프의존재하에또는무자극하에직접자극하였다. 세포를항-CD4 및항-CD25로세포외염색한후에, FoxP3으로세포내염색하고, 유세포분석법에의해분석하였다. 트레지토프와의인큐베이션에서, TT (745개세포의 12.5%) 또는무자극 (497개세포의 19.5%) 과비교하여 CD4+CD25+Foxp3+T-세포의백분율 (644개세포의 53.6%) 이증가하였다. 도 4는트레지토프가 T-조절시토킨및케모킨의상향조절, 그리고 T-작동시토킨및케모킨의하향조절을유도한다는것을나타내는일련의막대그래프이다. a) C3d 단백질로부터유래된면역원성펩티드풀 ( 흑색막대 ); b) C3d 펩티드 + 트레지토프-167 ( 밝은회색막대 ); 또는 c) C3d 펩티드 + 트레지토프-134 ( 중간회색막대 ) 로의최초자극후 C3d 재자극에대한반응을나타내었다. 반응값을 2차인큐베이션에서의무자극 ( 대조군 ) 인배경값에대한증가배수로나타내었다. 각기준 ( 배경 ) 값 (pg/ml) 을 x-축라벨에표시하였다. IL-4, TNFα 또는 TGFβ1 수준에는유의적차이가없었다. 도 5는 a) C3d 단백질로부터유래한면역원성펩티드풀 ( 흑색막대 ), 또는 b) C3d 펩티드 + 트레지토프-289 ( 밝은회색막대 ) 로의최초자극후 C3d 펩티드재자극에대한반응을나타내는일련의막대그래프이다. 반응값을 2차인큐베이션에서의무자극 ( 대조군 ) 인배경값에대한증가배수로나타내었다. 각시토킨에대해, 기준 ( 무-재자극, 배경 ) 값은 x-축라벨에표시하였다. 도 6은그레이브질환의표적항원인 TSHR로부터유래한에피토프와의공동-자극이그레이브질환을앓는환자로부터의 PBMC에서에피토프에대한면역반응을억제한다는것을나타내는막대그래프이다. 그레이브질환을앓는환자로부터의 PBMC를, 1) TSHR 펩티드풀단독, 또는 2) TSHR 펩티드풀및트레지토프-134, 트레지토프- 167 및트레지토프-289 풀과먼저 8일동안인큐베이션하였다. 이어서세포를수거하고, 세척하고, ( 기재된바와같은 IL-4 ELISpot 플레이트내에서 ) 1) 개별 TSHR 펩티드및트레지토프풀, 또는 2) TSHR 펩티드풀및트레지토프풀과인큐베이션하였다. " 무-재자극 " 대조군또한플레이팅하였다. 반응값을무항원으로의재자극에대해나타내었다. 흑색막대는항원단독과의인큐베이션및재자극에해당하고, 회색막대는항원 + 트레지토프풀과의인큐베이션및재자극에해당한다. 이실험에서, 트레지토프공동-인큐베이션은개별 TSHR 펩티드에대한반응을 35% 내지 67% 까지억제하였고, TSHR 펩티드풀에대한반응을 65% 까지억제하였다. 쌍비교에

18 대한 P 값을나타내었다. 도 7은 CEF 단독, CEF + 트레지토프-289, CEF + 트레지토프 294, CEF + 트레지토프-029, CEF + 트레지토프-074 또는 CEF + 트레지토프-009 중어느하나와의 8일동안의인큐베이션후, 시판중인양성대조군펩티드 (CEF) 풀에대한반응에있어서, 3개대상체의평균반응을나타내는막대그래프이다. CEF에대한반응은사용된개별트레지토프에따라 29 내지 48% 까지억제되었다. (CEF 단독에대해이전에인큐베이션된샘플에서의 ) CEF 에대한기준반응값은배경값 ( 배경값은무-재자극임 ) 에대해 1404 내지 IFN-γ SFC/10 6 PBMC 범위였다. 쌍비교에대한 P 값을나타내었다. 도 8은트레지토프와의공동-인큐베이션이보툴리눔신경독소로부터유래한펩티드에피토프에대한면역반응을억제한다는것을나타내는막대그래프이다. 항-BoNT/A 항체의증거를갖는대상체에서말초혈액을채취하였다. PBMC를 8일동안 BoNT/A 펩티드풀단독또는 BoNT/A 펩티드풀 + 트레지토프풀 ( 트레지토프-134, 트레지토프-167 및트레지토프-289) 과먼저인큐베이션하였다. 이어서세포를수거하고, 세척한후에, (IFN-γ ELISpot 플레이트내에서 ) 개별적인 BoNT/A 펩티드와 3벌로, 그리고풀에서 3벌로인큐베이션하였다. 반응값을무항원으로의재자극에대해나타내었다. 흑색막대는항원단독과의인큐베이션에해당하고, 회색막대는항원 + 트레지토프풀과의인큐베이션에해당한다. BoNT/A에대한반응은 26% 내지 73% 까지억제되었고 ; BoNT/A 펩티드풀에대한반응은 59% 까지억제되었다. 쌍비교에대한 P 값을나타내었다. 도 9는트레지토프-289 및트레지토프-134가시험관내에서공동-투여된면역우성항원에대한반응에서증식을하향조절한다는것을나타내는일련의그래프이다. PBMC를혈액은행공여자로부터단리하고, 8일동안 CEF 단독, CEF + 트레지토프-134 또는 CEF + 트레지토프-289로자극하였다. 2가지트레지토프중어느하나와의공동 -인큐베이션은 IFN-γ ELISA에의해측정된바와같이 CEF에대한반응의감소를유도하고 ( 좌측패널 ), CFSE 형광법에의해측정된바와같이증식의감소를유도하였다 ( 우측패널 ) ( 회색음영은항원-트레지토프공동-인큐베이션으로억제된반응값을나타내고 ; 흑색은항원단독과의인큐베이션후의기준반응값을나타낸다 ). 도 10은백시니아펩티드에대한반응을나타내는플롯이다. PBMC를혈액은행공여자로부터단리하고, 8일동안 CEF 단독, CEF + 트레지토프-134 또는 CEF + 트레지토프-289로자극하였다. 2가지트레지토프중어느하나와의공동-인큐베이션은 IFN-γ ELISA에의해측정된바와같이 CEF에대한반응의감소를유도하고 ( 좌측패널 ), CFSE 형광법에의해측정된바와같이증식의감소를유도하였다 ( 우측패널 ). 회색음영은항원-트레지토프공동-인큐베이션으로억제된반응값을나타내고 ; 흑색은항원단독과의인큐베이션후의기준반응값을나타낸다. 도 11은트레지토프억제가조절표현형을갖는세포에의해매개된다는것을나타내는일련의그래프이다. 트레지토프억제는 CD4+CD25Hi T-세포에의존한다. 좌측패널 : 알레르기성개체로부터의 PBMC를항-CD4 및항- CD25 항체로염색하고, 유세포분석법에의해분석하였다. CD4+CD25Hi 서브세트 ( 게이트 ) 를잔류 PBMC로부터소모시켰다. 중앙패널 : CD4+CD25Hi 소모된, 그리고소모되지않은 PBMC를, 트레지토프-289와함께또는이것없이 HDM 용해물로공동-자극하였다. CD4+CD25Hi 소모된 PBMC는, 소모되지않은 PBMC보다 IFN-γ를덜억제할수있었다. 우측패널 : HDM 용해물및트레지토프-289의공동-인큐베이션에의해 HDM 용해물자극에대한반응에서 CD4+ 세포의증식의감소가유도되었다. 도 12는 TReg (CD4/CD25Hi) 의팽창이 IL-10 분비와상호관련된다는것을나타내는플롯및그래프이다. 트레지토프-289 및 HDM과의공동-인큐베이션후 CD4 CD25hi T-세포의팽창 ; 및 HDM 단독으로의재자극후공동-인큐베이션된세포에의해분비된 IL-10의양을나타내었다. 트레지토프-167과의공동-인큐베이션에대한결과는유사하였다 : CD4/CD25hi 세포의 1.67% 에서 7.5% 로의증가및 IL-10 분비의 5배증가. 도 13은트레지토프공동-인큐베이션이항원-특이적알레르기성 Th2 반응의억제를유도한다는것을나타내는일련의그래프및플롯이다. 트레지토프및 Bet v 알레르겐과의공동-배양은 Th2 작동체에서 Th1/TReg으로의변화를유도한다. 3개의박달나무-꽃가루-알레르기성대상체로부터의 PBMC를, 트레지토프- 167과함께또는이것없이 Bet v 펩티드로공동-자극하였다. 10일동안의트레지토프공동-자극은, Bet v 량체양성 CD4+ 세포에의한, IL-5 분비의감소를유도하였고 ( 하부좌측패널 ), Th2-관련표면마커의감소를유도하였다 ( 상부패널 ). 연장된배양 (30일, 하부우측패널 ) 은, Bet v 특이적세포중에서 Th2 (IL-5) 에서 Th1 (IFN-γ) 로의유의적변화를유도하였다. 도 14는트레지토프공동-투여가생체내에서공동-투여된단백질치료제에대한작동체반응의억제를유도한다는것을나타내는그래프이다. 항원-XX ( 실시예 5A 참조 ) 면역화단독 ( 흑색막대 ) 은, IL-4 ( 좌측막대쌍, 좌

19 측축 ) 및항-항원-XX 항체역가 ( 우측막대쌍, 우측축 ) 둘다에의한확고한반응을유발한다. 이들반응은항원-XX가트레지토프-167 및트레지토프-106의뮤린동족체와공동-투여된경우에둘다반감하였다 ( 회색막대 ). 샴-면역화된 (sham-immunized) 동물에서의항원-XX에대한반응은예상된바와같이음성이다. 항체 ( 우측막대쌍 ) 및 IL-4 ELISpot ( 좌측막대쌍 ) 에의한반응들은상호관련이있다. 도 15는집진드기용해물 (HDML) 및먼지진드기항원에대한 IL-4 및항체반응을나타내는그래프이다. HDML 면역화 ( 흑색막대 ) 는 IL-4 ( 좌측막대쌍, 좌측축 ) 및항-HDM 항원항체역가 ( 각우측막대쌍, 우측축 ) 둘다에의한확고한반응을유발한다. 이들반응은 HDML이트레지토프-289의뮤린동족체와공동-투여된경우에둘다반감되었다 ( 회색막대 ). 샴-면역화된동물에서의 HDML에대한반응은예상된바와같이음성이다. 항체 ( 우측막대쌍 ) 및 IL-4 ELISpot ( 좌측막대쌍 ) 에의한반응들은상호관련이있다. 이들그래프는 DM 미감작마우스에서생체내 38% 억제, 및사전-감작된마우스의경우 84% 억제를나타내었다. 실시예 5B를참조한다. 도 16은트레지토프공동-투여에의한면역원성펩티드치료제 ("IPT") 에대한 T 작동체반응의생체내억제를나타내는막대그래프이다. HLA DR4 Tg 마우스에 IPT 단독, 또는 IPT + 뮤린 FC 또는 IPT + 트레지토프-289 ( 뮤린동족체 ) 를 3회피하투여하였다. 최종투여 1주일후에마우스를희생시키고, 비장세포를 48시간 IL-4 ELISpot 검정에서면역원성펩티드치료제로자극하였다. 면역원성단백질치료제와 Fc 또는트레지토프-289와의공동-투여는 IL-4 스팟-형성세포의유의적감소를유도하였다. 실시예 5C를참조한다. [0131] [0132] 발명을실시하기위한구체적인내용하기실시예는본발명의범위를어떠한방식으로든제한하는것으로파악해서는안된다. 비추어, 본청구항의범위내의수많은실시양태들이당업자에게명백할것이다. 예시 본명세서에 [0133] [0134] [0135] [0136] 트레지토프는 (1) T-세포에피토프맵핑알고리즘에피매트릭스를사용하여확인되고, (2) 가용성 HLA에결합하는것으로확인되고, (3) 천연조절 T-세포를개입시키는것으로입증되고, (4) 생체외에서 ( 인간 PBMC에서 ) 공동-전달된항원에대한면역반응을억제하는것으로입증되고, (3) 생체내에서 ( 마우스에서 ) 공동-전달된항원에대한면역반응을억제하는것으로입증되었다. 상기발견을위한방법을하기에요약하며, 그후상응하는결과를제시한다. (1) T-세포에피토프및 T-세포에피토프클러스터의확인방법 T-세포는 MHC ( 주조직복합체 ) II형분자와관련해서항원제시세포 (APC) 에의해제시된에피토프를특이적으로인식한다. 상기 T-보조에피토프는 MHC II형결합홈에맞는 7 내지 30개의인접아미노산을포함하는선형서열로서나타낼수있다. 다수의컴퓨터알고리즘이개발되었고, 다양한기원의단백질분자내 II형에피토프를검출하기위해사용되었다 (De Groot, A. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 13: , 1997; Schafer, J. et al., Vaccine, 16: , 1998; De Groot, A. et al., Vaccine, 19: , 2001; De Groot, A. et al., Vaccine, 21: , 2003). T-보조에피토프의이러한 " 인실리코 " 예측은백신의고안및치료적단백질의면역제거에성공적으로적용되었다. 에피매트릭스시스템은 I형및 II형에피토프를예측하는도구이다. 알고리즘은 HLA 분자에결합하는 9량체및 10량체펩티드의예측을위한매트릭스를사용한다. 각매트릭스는포켓프로파일방법 (Sturniolo, T. et al., Nat. Biotechnol., 17: , 1999) 과유사하지만동일하지는않은방법에의해설명되는아미노산결합친화성과관련된위치-특이적계수를바탕으로한다. 에피매트릭스시스템은시험관내및생체내에서확인되었던수많은에피토프를장차예측하기위해사용되었다. 임의의주어진서열의전체아미노산은먼저, 중첩된 9량체프레임들로분석되고, 각프레임은 8개의아미노산에의해그말미가중첩된다. 이어서, 각프레임을 8종의일반 II형 HLA 반수체 (DRB1 * 0101, DRB1 * 0301, DRB1 * 0401, DRB1 * 0701, DRB1 * 0801, DRB1 * 1101, DRB1 * 1301, 및 DRB1 * 1501) 각각에대해예상되는친화성의점수를매긴다. 이들 8개대립유전자는그의만연함및서로간의차이때문에전세계인구의약 97% 를커버한다. 이어서, 에피매트릭스원점수를매우큰세트의무작위로생성한펩티드서열로부터유도된점수분포에대해서정규화한다. 생성된 "Z" 점수는정규분포되고, 대립유전자전반에걸쳐직접비교가능하다. [0137] 에피매트릭스펩티드채점. 에피매트릭스 "Z" 등급에서 1.64 초과로채점된임의의펩티드 ( 임의의주어진펩 티드세트의대략상위 5%) 는예측된 MHC 분자에의결합가능성이상당하다고결정되었다. 상기등급에서

20 2.32 초과로채점된펩티드 ( 상위 1%) 는결합하기가매우쉽고 ; 대부분의공개된 T- 세포에피토프는상기점수 범위에속한다. 이전연구는또한에피매트릭스가공개된 MHC 리간드및 T- 세포에피토프를정확하게예측함을 증명하였다. [0138] [0139] [0140] [0141] 무차별 T-세포에피토프클러스터의확인. 에피토프맵핑후, 에피매트릭스알고리즘에의해얻어진결과세트는 T-세포에피토프클러스터및에피바의존재에대해스크리닝된다. 잠재적 T-세포에피토프는단백질서열전반에걸쳐무작위적으로분포되어있지않고, 대신 " 클러스터 " 를형성하는경향이있다. T-세포에피토프 " 클러스터 " 는길이가 9 내지대략 30개아미노산의범위이고, 복대립유전자에대한그리고다중 9량체프레임에걸친그들의친화성을고려할때, 어느곳에서건 4 내지 40개의결합모티프를함유한다. 클러스티머로알려진독점적알고리즘을이용하여, 추정 T-세포에피토프클러스터를확인한다. 간략하게는, 분석된각각의 9량체펩티드의에피매트릭스점수를합하고, 통계학적으로유도된역치값에대해체크한다. 이어서, 높은점수의 9 량체를한번에 1개의아미노산으로연장시킨다. 이어서, 연장된서열의점수를다시합치고, 보정된역치값과비교한다. 제시된연장이클러스터의전체점수를더이상개선시키지않을때까지상기과정을반복한다. 본연구에서확인된트레지토프 ( 들 ) 은클러스티머알고리즘에의해 T-세포에피토프클러스터로서확인되었다. 이들은 MHC 결합및 T-세포반응성에대한높은잠재성을나타내는상당수의추정 T-세포에피토프및에피바를함유한다. (2) 펩티드합성및가용성 MHC와의결합의평가방법. 펩티드의합성. 트레지토프는직접적화학합성또는재조합방법에의해생산될수있다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). 본발명의트레지토프에상응하는펩티드를뉴잉글랜드 (New England) 펩티드에서의 9-플루오로닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 합성에의해, 자동화라이넨심포니 / 프로틴테크놀로지스 (Rainen Symphony/Protein Technologies) 합성기 ( 미국캘리포니아주두블린소재의신페프 (Synpep) 제품 ) 상에서제조하였다. 펩티드는 HPLC, 질량분광계및 UV 스캔 ( 각각순도, 질량및스펙트럼을확보함 ) 에의해확인되는바와같이, 80% 초과의순도로전달되었다. 생산된펩티드의결합. 바이오티닐화되지않은시험펩티드를 96-웰폴리프로필렌플레이트에서 3벌의웰에 0.1 μm μm 범위의최종농도로현탁시켰다. 이어서, 150 mm 시트레이트-포스페이트완충액 (ph 5.4) 중 1 mm PefaBloc, 0.75% n-옥틸-b-d-글루코피라노시드를함유하는용액중의정제된재조합 HLA II형분자를 200 ng/ 웰의최종농도로상기웰에첨가하였다. 96-웰플레이트를 37 에서 6% CO 2 에서 45분동안인큐베이 션하였다. 인큐베이션후, 바이오티닐화된 Flu HA 펩티드 ( 또는다른적합한대조군펩티드 ) 를 0.1 μ M/ 웰의최종농도로첨가하고, 37 에서 20시간동안인큐베이션하였다. 이어서, 각웰의내용물을항-인간 HLA-DR L243 포획항체 ( 벡턴딕킨슨 ) 로미리코팅된 96-웰고도결합 ELISA 플레이트에첨가하고, 4 에서 20 시간동안인큐베이션하였다. 이어서, 각웰에 100 μl (10 μg/ml) 의유로피움-표지된스트렙타비딘 (Streptavidin) ( 퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer)) 및 100 μl의상승완충액 ( 퍼킨-엘머 ) 을첨가하여플레이트를전개시켰다. 반응물을실온의암실에서 15-30분동안인큐베이션한후, 왈락빅터3-V(Wallac Victor3-V) 시간-분해형광계로형광을측정하였다. 이어서, 시그마플롯 (SigmaPlot) 분석프로그램을이용하여비-선형회귀분석으로 IC 50 값을계산하였다. 공지된펩티드와의비교를바탕으로할때, 250 μm 이상의 IC 50 은약한결합의지표이고, 400 μm 이상의 IC 50 은비-결합상호작용의지표이다. [0142] [0143] [0144] (3) 천연조절 T-세포를개입시키는펩티드의능력평가방법. T-세포단리. 상기조사프로그램은미국프로비던스의로드아일랜드혈액은행으로부터얻은기증된혈액, 미국로드아일랜드주존스톤소재의클리니컬파트너즈 (Clinical Partners) 에서모집된지원자의혈액, 프랑스파리소재의스탈러제네스 (Stallergenes) 에의해모집된지원자의혈액, 및상업적공급원으로부터얻은샘플을포함한다. 공여자혈액은모든연방지침에따라그리고스탈러제네스및에피백스기관정책에따라입수하였다. 공여자혈액을얻기위한프로토콜은각기관의심사위원회에의해승인되었다. 말초혈액단핵세포 (PBMC) 를어쿠스핀 (Accuspin) 프로토콜 ( 미국미주리주세인트루이스소재의시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich) 제품 ) 에따라단리하였다. 먼지-진드기-알레르기개인으로부터의저온보존된 PBMC는셀룰라테크놀로지스엘티디.(Cellular Technologies Ltd.) ( 미국오하이오주클리블랜드소재 ) 로부터입수하였다. 천연 Treg 분석. 인간 PBMCS를파상풍독소펩티드 TT 단독, 트레지토프단독, 피토헤마글루티닌단독

21 ( 분열촉진성양성대조군 ) 의존재하에또는무자극하에 4일동안생체외에서직접자극시켰다 개세포를항-CD4-FITC ( 클론 RPA-T4; 이바이오사이언스 (ebioscience)) 및항-CD25-APC ( 클론 BC96; 이바이오사이언스 ) 항체로 30분동안얼음에서유동염색완충액 ( 이바이오사이언스 ) 중에서염색하고, 완충액으로 2회세척하였다. 세포표면염색에이어서, 세포를고정시키고, 투과가능하도록하고 ( 이바이오사이언스 ), 제조자프로토콜에따라 FOXp3 ( 클론 PCH101; 이바이오사이언스 ) 에대해세포내염색하였다. 여러배양조건하의 FOXp3 양성 CD4+/CD25+ T 세포의빈도를플로조 (Flowjo) 분석소프트웨어에의해계산하였다. T 세포활성을 CD4+CD25+ 발현의증가에의해나타내며, FOXp3 발현의증가를수반하는경우활성화된세포가조절된다는것을나타낸다. [0145] [0146] (4) 세포외공동 - 투여된항원에대한반응을억제하는펩티드의능력평가방법. 방관자억제분석. 단리된 PBMC 를면역원성항원단독또는트레지토프펩티드의존재하의항원중하나의존 재하에 37 5% CO 2 에서 8 일동안배양하였다. 시험항원은 10 μg/ml 로첨가되었으며, 1) 예를들어파상풍 독소펩티드 TT , 인플루엔자헤마글루티닌펩티드 , 백시니아펩티드에피토프및 CEF 양성대조군펩티드풀과같은전형적인항원 ( 웹사이트 aidsreagent.org의 NIH AIDS 연구및참조시약프로그램 ; 문헌 [Currier, J. et al., J. Immunol. Methods, 260:157-72, 2002]; [Mwau, M. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 18:611-8, 2002]), 2) 단백질치료제, 예컨대보툴리눔뉴로톡신 A, 자가자가항원, 예컨대갑상선호르몬자극호르몬및보체성분 C3d를포함하였다. 또한, 시험항원은알레르겐 : 자작나무꽃가루항원 Betv1, 집먼지진드기용해물및정제된집먼지진드기항원, Der P2를포함하였다. 재조합 IL-2 (10 IU/ml) 및 IL-7 (20 ng/ml) 을 2일째에 PBMC 배양액에첨가하였다. 자극 8일후, 세포를수거하고, PBS로수회세척하고, 하기기재된인간시토킨방출분석법에따라분석하였다. [0147] 인간 IFN-γ ELISpot. 맵테크 (Mabtech) 로부터구매한인간 IFN-γ ELISpot 키트를사용하여 IFN-γ ELISpot 검정을수행하였다. 10% 인간혈청을갖는 RPMI1640 중 250,000 개인간말초혈액단핵세포를함유하는 3 벌 웰에표적펩티드를 10 μg/ml 첨가하고, 37 에서 18 내지 22 시간동안 5% CO 2 분위기하에 인큐베이션하였다. 3벌웰을 10 μg/ml의 PHA로플레이팅하였다. 펩티드없는 6개웰을배경값측정에사용하였다. 펩티드시험웰에서의스팟의수가맨-휘트니 (Mann-Whitney) U 검정에의해대조군웰의스팟의수와통계적으로상이한경우 (P < 0.05) 반응은양성으로간주된다. 일반적으로, 스팟의수가배경값의 4배이상이며, 배경값 (20,000개비장세포당배경값에대하여 1개반응 ) 에비해 1백만개세포당 50개스팟초과인경우반응은양성으로간주된다. 결과를배경값에대한스팟의평균수로기록하며, 시딩된 1백만개세포당스팟으로조정하였다. 통계적으로유의하다고측정된경우 10% 이상의억제율이통계적으로유의하다고간주된다. [0148] 인간 IFN-γ ELISpot. 맵테크로부터구매한인간 IL-4 ELISpot 키트를사용하여 IFN-γ ELISpot 검정을수행 하였다. 10% 인간혈청을갖는 RPMI1640 중 250,000 개인간말초혈액단핵세포를함유하는 3 벌웰에표적 펩티드를 10 μg/ml 첨가하고, 37 에서 18 내지 22 시간동안 5% CO 2 분위기하에인큐베이션하였다. 3 벌웰 을 10 μg/ml의 PHA로플레이팅하였다. 펩티드없는 6개웰을배경값측정에사용하였다. 펩티드시험웰에서의스팟의수가맨-휘트니 U 검정에의해대조군웰의스팟의수와통계적으로상이한 (p < 0.05) 경우반응은양성으로간주된다. 일반적으로, 스팟의수가배경값의 4배이상이며, 배경값 (20,000개비장세포당배경값에대하여 1개반응 ) 에비해 1백만개세포당 50개스팟초과인경우반응은양성으로간주된다. 결과를배경값에대한스팟의평균수로기록하였으며, 시딩된 1백만개세포당스팟으로조정하였다. 통계적으로유의한것으로측정된경우 10% 이상의억제율이통계적으로유의하다고간주된다. [0149] 인간 IL-4 ELISpot. 맵테크로부터구매한인간 IL-4 ELISpot 키트를사용하여 IL-4 ELISpot 검정을수행하였 다. 10% 인간혈청을갖는 RPMI1640 중 250,000 개인간말초혈액단핵세포를함유하는 3 벌웰에표적펩티 드를 10 μg/ml 첨가하고, 37 에서 18 내지 22 시간동안 5% CO 2 하에인큐베이션하였다. 3 벌웰을 2 μg/ml 의 PHA로플레이팅하였다. 펩티드없는 6개웰을배경값측정에사용하였다. 변형순열시험을사용하여통계적시험을수행하였다 ( 문헌 [Hudgens, M. et al., J. Immunol. Methods, 288:19-34, 2004]). 펩티드시험웰에서의스팟의수가대조군웰의스팟의수와통계적으로상이한경우 (p < 0.01) 반응은양성으로간주된다. 일반적으로, 스팟의수가배경값의 4배이상이며, 배경값 (20,000개비장세포당배경값에대하여 1개반응 ) 에대해 1백만개세포당 50 스팟초과인경우반응은양성으로간주된다. 결과를배경값에대한스팟의평균수로기록하며, 시딩된 1백만개세포당스팟으로조정하였다. 통계적으로유의한것으로측정된경우 10% 이상의

22 억제율이유의하다고간주된다. [0150] 인간 IFN-γ ELISA. 10% 인간혈청을갖는 RPMI1640 중인간말초혈액단핵세포를함유하는배양액에표적 펩티드를 10 μg/ml 첨가하고, 37 에서 18 내지 22 시간동안 5% CO 2 분위기하에인큐베이션하였다. 10 μ g/ml의 PHA 또는펩티드없이자극된배양액을대조군으로서사용하였다. 알앤디시스템스퀀티킨 (R&D Systems Quantikine) ELISA 키트를사용하여인간 IFN-γ 정량적샌드위치 ELISA를수행하였다. IFN-γ에특이적인폴리클로날항체를 96-웰미세적정플레이트에예비-코팅하였다. 키트-제공표준, 및 PHA 및펩티드없는대조군을포함하는세포상등액샘플 (100 μl) 을웰에피펫팅하고, 존재하는임의의 IFN-γ가실온에서 2시간에걸쳐고정된항체에의해결합하였다. 결합되지않은물질을세척제거한이후, IFN-γ에특이적인효소- 연결된폴리클로날항체를실온에서 2시간인큐베이션동안웰에첨가하였다. 세척하여임의의결합되지않은항체-효소시약을제거한이후, 기질용액을 30분동안웰에첨가하면, 결합된 IFN-γ의양에비례하여발색되었다. 발색을중지시키고, 450 nm에서의색의강도를왈락빅터3에서측정하였다. 450 nm 값에서 540 nm에서의강도를차감하여플레이트에서의광학적불완전에대해보정하였다. 실험군사이의시토킨수준의차이를 t-검정에의해평가하였다. 실험군및대조군웰사이의시토킨발현에서의관측된차이가통계적으로상이한경우 (p < 0.01) 반응은양성으로간주된다. [0151] [0152] [0153] [0154] [0155] 다중인간시토킨 / 케모킨 ELISA. PBMC 배양액으로부터의상등액을서치라이트 (SearchLight) 다중 ELISA 기법을사용하여시토킨및케모킨수준에대해평가하였다. 측정되는인간시토킨에는 IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p40, IL-12p70, TNFα 및 TGFβ가포함된다. 측정되는인간케모킨에는 MCP-1, MIP-1α 및 MIP-1β가포함된다. 서치라이트프로테오믹어레이 (SearchLight Proteomic Array) 는 96-웰폴리스티렌미세적정플레이트의하부에스팟팅된최대 16개상이한포획항체를함유하는정량적다중샌드위치 ELISA이다. 각각의항체는바이오티닐화된항체로검출된특이적단백질을포획하고, 이어서스트렙타비딘-HRP을첨가하고, 최종적으로슈퍼시그날 ELISA 펨토 (SuperSignal ELISA Femto) 화학발광기질을전하-결합소자 (CCD) 카메라로검출하였다. 실험군사이의시토킨수준의차이를 t-검정에의해평가하였다. 실험군및대조군웰사이의시토킨발현의관측된차이가통계적으로상이한경우 (p < 0.01) 반응은양성으로간주된다. 세포분리 / 소모방법. 인간 Treg 세포집단을사용설명서 ( 캘리포니아칼즈배드소재의인비트로젠 ) 에따라인비트로젠다이나비즈 (dynabeads) 시스템 ( 인간 CD4 및 CD25) 을사용하여 PBMC로부터소모시키거나또는양성으로단리시켰다. (5) 생체내공동-투여된항원에대한반응의억제방법. 살아있는계에서단백질-유도된작동반응에대한트레지토프의면역억제작동체를측정하기위해, 뮤린모델을사용하여실험을수행하였다. 마우스군을항원단독, 항원및트레지토프의칵테일, 또는트레지토프와융합된항원으로면역화시켰다. 음성대조군 ( 용매단독 ) 또한평가하였다. 최종주입 1주이후, 마우스를모든기관및연방가이드라인에따라희생시켜비장을수거하였다. 새롭게단리된마우스비장세포를사용하여생체내세포면역반응을평가하였다. 단일비장세포현탁액을제조하고, 하기검정에사용하였다. 또한, 심장천자에의해전혈을얻었으며, 공동-투여된항원에대한항체반응의정량화에사용하기위해혈청을수집하였다. 뮤린 IFN-γ ELISpot. 맵테크로부터구매한뮤린 IFN-γ ELISpot 키트를사용하여 IFN-γ ELISpot 검정을수행하였다. 300,000개뮤린비장세포 (10% FCS를갖는 RPMI1640) 를함유하는 3벌웰에표적펩티드를 10 μ g/ml 첨가하고, 37 에서 18 내지 22시간동안 5% CO 2 분위기하에인큐베이션하였다. 3벌웰을 10 μg/ml의 ConA로플레이팅하였다. 펩티드없는 6개웰을배경값측정을위해사용하였다. 펩티드시험웰에서스팟의수가맨-휘트니 U 검정에의해대조군웰의스팟의수와통계적으로상이한경우 (p < 0.05) 반응은양성으로간주된다. 일반적으로, 스팟의수가배경값의 4배이상이며, 배경값 (20,000개비장세포당배경값에대하여 1 개반응 ) 에비하여 1백만개세포당 50개스팟초과인경우반응은양성으로간주된다. 배경값에대한스팟의평균수로서결과를기록하며, 시딩된 1백만개세포당스팟으로조정하였다. [0156] 뮤린 IL-4 ELISpot. 맵테크로부터구매한뮤린 IL-4 ELISpot 키트를사용하여 IL-4 ELISpot 검정을수행하였 다. 300,000 개뮤린비장세포 (10% 35 FCS 를갖는 RPMI1640) 를함유하는 3 벌웰에표적펩티드를 10 μg/ml 첨가하고, 37 에서 18 내지 22 시간동안 5% CO 2 분위기하에인큐베이션하였다. 3 벌웰을 10 μg/ml 의 ConA 로플레이팅하였다. 펩티드없는 6 개웰을배경값측정에사용하였다. 변형순열검정을사용하여통계적시 험을수행하였다 ( 문헌 [Hudgens, M. et al., J. Immunol. Methods, 288:19-34, 2004]). 펩티드시험웰에서

23 의스팟의수가대조군웰의스팟의수와통계적으로상이한경우 (p < 0.01) 반응은양성으로간주된다. 일반적으로, 스팟의수가배경값의 4배이상이고, 배경값 (20,000개비장세포당배경값에대하여 1개반응 ) 에비하여 1백만개세포당 50개스팟초과인경우반응은양성으로간주된다. 배경값에대한스팟의평균수로서결과를기록하고, 시딩된 1백만개세포당스팟으로조정하였다. [0157] 뮤린 IFN-γ ELISA. 10% 인간혈청을갖는 RPMI1640 중인간말초혈액단핵세포를함유하는배양액에표적 펩티드를 10 μg/ml 첨가하고, 37 에서 18 내지 22 시간동안 5% CO 2 분위기하에인큐베이션하였다. 10 μ g/ml의 PHA로또는펩티드없이자극된배양액을대조군으로서사용하였다. 알앤디시스템즈퀀티카인 ELISA 키트를사용하여마우스 IFN-γ 정량적샌드위치 ELISA를수행하였다. IFN-γ에특이적인폴리클로날항체를 96-웰미세적정플레이트에예비-코팅하였다. 키트-제공표준, 및 PHA 및펩티드없는대조군을포함하는세포상등액샘플 (100 μl) 을웰로피펫팅하고, 존재하는임의의 IFN-γ가실온에서 2시간에걸쳐고정된항체에의해결합한다. 결합되지않은물질을세척제거한이후, IFN-γ에특이적인효소-연결된폴리클로날항체를실온에서 2시간인큐베이션동안웰에첨가하였다. 세척하여임의의결합되지않은항체-효소시약을제거한이후, 기질용액을 30분동안웰에첨가하면, 결합된 IFN-γ에비례하여발색되었다. 발색을중지시키고, 450 nm 에서의색의강도를왈락빅터3에서측정하였다. 450 nm 값에서 540 nm에서의강도를차감하여광학적불완전에대해보정하였다. 실험군사이의시토킨수준의차이를 t-검정에의해평가하였다. 실험군및대조군웰사이의시토킨발현에서의관측된차이가통계적으로상이한경우 (p < 0.01) 반응은양성으로간주된다. [0158] 유세포분석법. 비장세포를 10% FCS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신술페이트로보충한 RPMI 1640 중 개세포 / 웰로 96-웰조직배양액플레이트에서플레이팅하였다. 자극되지않은양성대조군 (ConA) 이각검정에포함된다. 세포를 37 5% CO 2 에서밤새인큐베이션하였다. 인큐베이션에이어서, 1% 소혈청알부민을함유하는 PBS에서세포를세척하고, 표면항체 ( 예를들어, CD4, CD25) 로염색하였다. 이후, 세포를세척하고, 사용설명서에따라시토픽스 / 시토페름키트 (BD 파밍겐 ) 를사용하여고정시켰다. 고정화에이어서, 세포를시토페름완충액에서 2회세척하고, 세포내마커 ( 예를들어, FOXp3, IL-10) 에대한항체로염색하였다. 염색에이어서, 세포를세척하고, 유세포분석을위한제제중 1% 파라포름알데히드를함유하는 PBS로고정시켰다. 세포를 BD FACSCalibur 기계에서분석하였다. 20,000회이벤트를샘플당수집하였다. 플로조 (FloJo) 소프트웨어를사용하여데이터분석을수행하였다. 모든데이터는배경값차감하였다. 군사이의비교는월콕슨 (Wilcoxon) 순위합시험을기준으로한다. p < 0.05의유의성을쌍비교에적용하고, p < 0.01 을다중비교에사용하였다. [0159] [0160] [0161] [0162] 세포분리 / 소모방법. 뮤린 Treg 세포집단을사용설명서 ( 인비트로젠 ; 캘리포니아칼즈배드 ) 에따라인비트로젠다이나비즈시스템을사용하여 PBMS로부터소모시키거나, 양성으로단리시켰다 ( 뮤린 CD4 및 CD25). 공동-투여된항원에대한항체의정량화. 항원에대한 IgG 항체의정량화를항체-포획 ELISA에의해측정하였다. 항원 (10 μg/ml) 을카르보네이트완충액에용해시키고, 4 에서밤새 96-웰미세적정플레이트에두었다. 이후, 플레이트를 0.05% 트윈 20 (PBST) 을함유하는포스페이트-완충염수로세척하고, PBS 중 5% 소태아혈청 (FBS; Gibco) 으로실온에서 3시간동안블로킹하였다. 0.5% FBS/PBS 중혈청의연속희석액을플레이트에첨가하고, 실온에서 2시간동안인큐베이션하였다. 이후, 미세적정플레이트를 PBST로세척하고, 0.5% FBS/PBS 중 1:10000 희석된호스래디쉬퍼옥시다제 ( 써던바이오테크놀로지어소시에이츠 (Southern Biotechnology Associates)) 에컨쥬게이션된 100 μl 염소항-마우스 IgG ( 감마-사슬특이적 ) 를각웰에첨가하였다. 미세적정플레이트를 PBST 중에서세척하고, 이후 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB; 모스 (Moss)) 으로발색시켰다. 왈락빅터3에서측정된 450 nm의파장에서의흡광도를판독하였다. 450 nm 값에서 540 nm에서의강도를차감하여광학불완전에대해보정하였다. 실시예 1. 트레지토프조성물의확인조절시인간 IgG 단백질에서에피토프의확인. 면역원성잠재성에대한다수의항체의평가이후, 재발패턴을관찰하였다. 특정에피토프클러스터가다중항체에서발생하였다. 이론에의해제한되는것을원하지는않지만, 고도로보존된에피토프클러스트는항-항체면역반응을촉진하지않을것으로판단되었다. 추가적으로, 재발패턴은면역계에의해수동적으로관용되거나또는항-항체면역반응을억제하는조절 T-세포를활성적으로개입시킬수있다고판단되었다. 재발에피토프클러스터의서열과진뱅크 (GenBank) 에서의단백질데이터베이스와의비교로, 보존되며조절 T-세포를잠재적으로자극할수있는 IgG 항체의서열에포함된 19개영역을수립하였다 ( 표 2 참조 ).