특허청구의범위청구항 1 SEQ ID NO:1의아미노산서열을가지는정제된재조합이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 를포함하는점액다당류증타입 II(MPS II, 헌터증후군 ) 예방또는치료용조성물로서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 38/46 ( ) A61K 38/17 ( ) A61K 9/20 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2012 년 09 월 07 일 심사청구일자 2012 년 09 월 07 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2014 년 01 월 08 일 (30) 우선권주장 61/666, 년 06 월 29 일미국 (US) (56) 선행기술조사문헌 KR B1* * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2014년04월11일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2014년03월27일 (73) 특허권자 쉐어휴먼제네텍세러피스, 인코포레이티드 미국매사추세츠렉싱턴패트리엇트웨이 500 ( 우 : 02421) (72) 발명자 니콜스, 데이브 미국 매사추세츠렉싱턴쉐어웨이 300 (74) 대리인 특허법인남앤드남 전체청구항수 : 총 19 항심사관 : 김용원 (54) 발명의명칭이듀로네이트 -2- 설파타제의정제 (57) 요약 본원은 SEQ ID NO:1 과 70% 이상의상동성을보이는아미노산서열을가지는정제된재조합이듀로네이트 -2- 설파타제 (I2S) 을포함하는조성물로서, 상기정제된재조합 I2S 가약 70% 이상의 SEQ ID NO:1 의 Cys59 에상응하는시스테인잔기의 Cα- 포르밀글리신 (FGly) 으로의전환율을포함하며, 상기정제된재조합 I2S 가 150 ng/mg 미만의숙주세포단백질 (HCP) 을포함하는조성물에관한것이다. 대표도 - 도 1-1 -

2 특허청구의범위청구항 1 SEQ ID NO:1의아미노산서열을가지는정제된재조합이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 를포함하는점액다당류증타입 II(MPS II, 헌터증후군 ) 예방또는치료용조성물로서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율 (molar ratio conversion) 이 70% 이상이며, 추가적으로, 상기정제된재조합 I2S가분자당, 평균적으로 16개이상의시알산 (sialic acids) 을함유하는조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 상기정제된재조합 I2S가분자당, 평균적으로 18개이상의시알산을함유하는조성물. 청구항 3 제1항에있어서, 상기정제된재조합 I2S가분자당, 평균적으로 20개이상의시알산을함유하는조성물. 청구항 4 SEQ ID NO:1의아미노산서열을가지는정제된재조합이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 를포함하는점액다당류증타입 II(MPS II, 헌터증후군 ) 예방또는치료용조성물로서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 70% 이상이며, 추가적으로, 상기정제된재조합 I2S가분자당, 10몰 % 이상의비스-포스포릴레이티드올리고사카라이드 (bisphorylated olygosaccharide) 를함유하는조성물. 청구항 5 제4항에있어서, 상기정제된재조합 I2S가분자당, 50몰 % 이상의비스-포스포릴레이티드올리고사카라이드를함유하는조성물. 청구항 6 SEQ ID NO:1의아미노산서열을가지는정제된재조합이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 를포함하는점액다당류증타입 II(MPS II, 헌터증후군 ) 예방또는치료용조성물로서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 70% 이상이며, 추가적으로, 상기정제된재조합 I2S가분자당, 평균적으로 16개이상의시알산 (sialic acids) 을함유하며, 분자당, 10몰 % 이상의비스-포스포릴레이티드올리고사카라이드를함유하는조성물. 청구항 7 제1항내지제6항중어느한항에있어서, 상기정제된재조합 I2S가추가적으로중성 ( 피크그룹 1), 모노-시알릴레이티드 ( 피크그룹 2), 디-시알릴레이티드 ( 피크그룹 3), 모노포스포릴레이티드 ( 피크그룹 4), 트리-시알릴레이티드 ( 피크그룹 5), 테트라-시알릴레이티드 ( 피크그룹 6), 및디포스포릴레이티드 ( 피크그룹 7) I2S 단백질을나타내는피크그룹으로부터선택되는피크그룹을 7개이하로포함하는글리칸맵 (glycan map) 을특징으로하는조성물. 청구항 8 제1항내지제6항중어느한항에있어서, - 2 -

3 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 75% 인조성물. 청구항 9 제1항내지제6항중어느한항에있어서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 80% 이상인조성물. 청구항 10 제1항내지제6항중어느한항에있어서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 85% 초과인조성물. 청구항 11 제1항내지제6항중어느한항에있어서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 90% 초과인조성물. 청구항 12 제1항내지제6항중어느한항에있어서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 95% 초과인조성물. 청구항 13 제1항내지제6항중어느한항에있어서, 상기정제된재조합 I2S에서 SEQ ID NO:1의 Cys59에상응하는시스테인잔기로부터 Cα-포르밀글리신 (FGly) 으로의몰비전환율이 100% 인조성물. 청구항 14 제1항내지제6항중어느한항에있어서, 상기정제된재조합 I2S가 100 ng/mg 미만의숙주세포단백질 (HCP) 을함유하는조성물. 청구항 15 제1항내지제6항중어느한항의조성물및약학적으로허용가능한담체를포함하는제형. 청구항 16 제15항에있어서, 상기제형이정맥투여용으로적합한제형. 청구항 17 제15항에있어서, 상기제형이수막강내 (intrathecal) 투여용으로적합한제형. 청구항 18 제15항에있어서, 상기제형이피하 (subcutaneous) 투여용으로적합한제형. 청구항

4 제 15 항에있어서, 상기제형이헌터증후군 (Hunter syndrome) 치료용인제형. 청구항 20 삭제청구항 21 삭제청구항 22 삭제청구항 23 삭제청구항 24 삭제청구항 25 삭제 명세서 [0001] [0002] 기술분야관련출원의전후참조본출원은전체내용이참조로서본원에포함되는 2012년 6월 29일에출원된미국가특허출원일련번호 61/666,733호를우선권으로주장한다. [0003] [0004] [0005] 배경기술점액다당류증타입 II(MPS II, 헌터증후군 ) 는효소이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 의결함으로부터발생하는 X- 염색체-연관열성리소좀축적병이다. I2S는글리코사미노글리칸 (GAG) 더마탄설페이트및헤파란설페이트로부터의말단 2-O-설페이트모이어티 (moiety) 를절단한다. 헌터증후군을갖는환자에서의 I2S 효소결핍또는결함성 I2S 효소로인해, GAG는점진적으로다양한세포유형의리소좀내에축적되어, 세포과다 (cellular engorgemen), 장기종대 (organomegaly), 조직파괴, 및기관계기능이상을야기시킨다. 일반적으로, 헌터증후군을갖는사람들에대한신체적소견은신체및신경증상둘모두를포함한다. 예를들어, 헌터증후군의일부경우에, 중추신경계관련은발달지연및신경계문제를야기시킨다. 헌터증후군의비-신경증상은보통출생시에는존재하지않지만, 시간이지남에따라, 신체의세포내의 GAG의점진적축적이신체의말초조직에큰영향을미칠수있다. 말초조직내의 GAG 축적은환자의안면용모에서독특한거침 (coarseness) 을야기시키며, 이는헌터환자의규정하는특징으로서돌출된이마, 편평한콧마루및혀비대의원인이된다. 유사하게, GAG의축적은신체의기관계에해로운영향을미칠수있다. 처음에심장, 폐및기도벽의비후, 및간, 비장및신장의비정상적비대로징후가나타나며, 이러한현저한변화는궁극적으로만연된치명적인기관부전을야기시킬수있다. 결과로서, 헌터증후군은항상중증이고, 진행성이며, 생명을제한한다. 효소대체요법 (ERT) 은헌터증후군을갖는환자에외인성대체 I2S 효소를투여하는것을포함하는헌터증후군 (MPS II) 을치료하기위한승인된요법이다. [0006] 발명의내용 발명의개요 - 4 -

5 [0007] 본발명은특히, 효소대체요법을위해재조합적으로생성된 I2S 단백질을정제하기위한개선된방법을제공한다. 본발명은, 부분적으로, 재조합 I2S 단백질이 4개의크로마토그래피컬럼만큼적은수의컬럼을포함하는방법을이용하여가공되지않은생물학적물질, 예를들어, I2S-함유세포배양배지로부터정제될수있다는놀라운발견에기초로한다. 효소대체요법을위한재조합 I2S의승인된현재정제방법은 6개의크로마토그래피컬럼을포함한다. 실시예섹션에기재된바와같이, 본발명에따른 4개의컬럼방법을이용하여정제된재조합 I2S 단백질은미국및다수의다른나라에서의시판순도요건에부합된다. 또한, 본발명에따라정제된재조합 I2S 효소는 I2S 효소의활성에중요한높은백분율의 C α -포르밀글리신(FGly)( 예를들어, 70% 초 과및 100% 이하 ) 를함유하며, 재조합 I2S 단백질의생체이용률및 / 또는리소좀표적화를촉진할수있는글리칸맵및디포스포산함량과같은독특한특징을보유한다. 따라서, 본발명은재조합 I2S 단백질을정제하기위한효과적이고, 보다저렴하며, 보다신속한방법을제공한다. 본발명은무혈청배지에서생성된재조합 I2S 단백질을정제하는데특히, 유용하다. [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] 따라서, 일양태에서, 본발명은음이온-교환크로마토그래피, 양이온-교환크로마토그래피, 혼합모드크로마토그래피, 및소수성상호작용크로마토그래피중하나이상을기초로한방법을이용하여불순한제조물로부터재조합 I2S 단백질을정제하는방법을제공한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은 6개미만 ( 예를들어, 5개미만, 4개미만, 또는 3개미만 ) 의크로마토그래피단계를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은 2, 3, 4 또는 5개의크로마토그래피단계를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은 4개의크로마토그래피단계를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은 100 ng/mg 미만의숙주세포단백질 (HCP)( 예를들어, 90 ng/mg 미만의 HCP, 80 ng/mg 미만의 HCP, 70 ng/mg 미만의 HCP, 60 ng/mg 미만의 HCP, 50 ng/mg 미만의 HCP, 40 ng/mg 미만의 HCP, 30 ng/mg 미만의 HCP, 20 ng/mg 미만의 HCP, 10 ng/mg 미만의 HCP) 을함유한다. 일부구현예에서, 적합한음이온-교환크로마토그래피는 Q 크로마토그래피이다. 일부구현예에서, 적합한양이온-교환크로마토그래피는 SP 크로마토그래피이다. 일부구현예에서, 적합한혼합모드크로마토그래피는수산화아파타이트 (HA) 크로마토그래피이다. 일부구현예에서, 적합한소수성상호작용크로마토그래피는페닐크로마토그래피이다. 음이온-교환크로마토그래피 ( 예를들어, O 컬럼 ), 양이온-교환크로마토그래피 ( 예를들어, SP 컬럼 ), 혼합모드크로마토그래피 ( 예를들어, HA 컬럼 ), 및소수성상호작용크로마토그래피 ( 예를들어, 페닐컬럼 ) 가임의의순서로수행될수있는것이고려된다. 일부구현예에서, 본발명에따른방법은음이온-교환크로마토그래피 ( 예를들어, O 컬럼 ), 양이온-교환크로마토그래피 ( 예를들어, SP 컬럼 ), 혼합모드크로마토그래피 ( 예를들어, HA 컬럼 ), 및소수성상호작용크로마토그래피 ( 예를들어, 페닐컬럼 ) 의순서로수행된다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액 (flow-through) 은음이온-교환크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, Q 컬럼 ) 으로의로딩전에약 의 ph( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0) 및약 ms/cm의전도율 ( 예를들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20 ms/cm) 으로조정된다. 일부구현예에서, ph는 1M 소듐아세테이트를이용하여조정된다. 일부구현예에서, 전도율은 5M 염화나트륨을이용하여조정된다. 일부구현예에서, 음이온-교환크로마토그래피컬럼은로딩후약 의 ph( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 or 7.0) 와함께약 140 mm 내지 200 mm 범위의염 ( 예를들어, NaCl) 농도 ( 예를들어, 약 140 mm, 145 mm, 150 mm, 155 mm, 160 mm, 165 mm, 170 mm, 175 mm, 180 mm, 185 mm, 190 mm, 195 mm, 또는 200 mm) 를포함하는세척완충액을이용하여세척된다. 일부구현예에서, 음이온-교환크로마토그래피컬럼은선형염 ( 예를들어, NaCl) 구배를포함하는용출완충액을이용하여용출된다. 일부구현예에서, 적합한선형 NaCl 구배는약 mm 범위의 NaCl( 예를들어, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm) 을함유한다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액은양이온-교환크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, SP 컬럼 ) 으로의로딩전에약 1 ms/cm 내지 20 ms/cm 범위의전도율 ( 예를들어, 약 1 ms/cm 내지 15 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 10 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 8 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 6 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 4 ms/cm, 약 2 ms/cm 내지 4 ms/cm) 로조정된다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액은양이온-교환크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, SP 컬럼 ) 으로의로딩전에약 2 ms/cm 내지 4 ms/cm 범위의전도율 ( 예를들어, 2, 2.5, 3, 3.5, 또는 4 ms/cm) 로조정된다. 일부구현예에서, 전도율은음이온-교환크로마토그래피컬럼으로부터의용출액을 H 2 O로약 1-2:1( 예를들어, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 1.6:1, 1.7:1, 1.8:1, 1.9:1, 또는 2:1) 비로희석시킴으로써조정된다. 일부구현예에서, 전도율은정용여과 - 5 -

6 (dialfiltration) 에의해조정된다. 일부구현예에서, 양이온-교환크로마토그래피컬럼은약 의 ph( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5) 에서수행된다. 일부구현예에서, 양이온-교환크로마토그래피컬럼은약 0.01 M 내지약 0.1 M 범위의포스페이트 ( 예를들어, NaPO4) 농도 ( 예를들어, 약 0.01 M, 0.02 M, 0.03 M, 0.04 M, 0.05 M, 0.06 M, 0.07 M, 0.08 M, 0.09 M, 또는 0.1 M) 를포함하는완충액으로수행된다. 일부구현예에서, 적합한 ph는약 ( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0, 또는 6.5) 이다. [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액은혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 으로의로딩전에약 M 내지약 0.01 M 범위의포스페이트 ( 예를들어, NaPO4) 농도 ( 예를들어, 약 M, M, M, M, M, M, M, M, M, 또는 0.01 M) 및약 의 ph( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0, 또는 6.5) 로조정된다. 일부구현예에서, 혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 은로딩후중성 ph 또는중성에가까운 ph의포스페이트 ( 예를들어, 1-10 mm 소듐또는포타슘포스페이트 ) 을함유하는세척완충액으로세척된다. 일부구현예에서, 로딩된혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 은약 mm 범위의포스페이트농도 ( 예를들어, 약 mm, mm, mm, mm, mm, mm) 를갖는세척완충액으로세척된다. 일부구현예에서, 로딩된혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 은 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm 또는이를초과하는포스페이트농도를갖는세척완충액으로세척된다. 일부구현예에서, 혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 으로부터의용출은구배포스페이트완충액으로달성된다. 일부구현예에서, 적합한용출완충액은약 mm( 예를들어, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm) 인산나트륨또는포타슘포스페이트의포스페이트구배를가질수있다. 일부구현예에서, HA 컬럼으로부터의용출은용출완충액내의포스페이트농도를단계적으로증가시킴으로써달성된다. 일부구현예에서, 단계적용출완충액은 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 100 mm, 110 mm, 120 mm, 130 mm, 140 mm, 150 mm, 200 mm, 250 mm, 300 mm, 350 mm, 400 mm로부터선택된포스페이트 ( 예를들어, 인산나트륨 ) 농도를가질수있다. 일부구현예에서, 혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 으로부터의용출은약 50 mm 내지 150 mm 범위의포스페이트 ( 예를들어, 인산나트륨 ) 농도 ( 예를들어, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 100 mm, 110 mm, 120 mm, 130 mm, 140 mm, 150 mm, 및이의조합의포스페이트 ( 예를들어, 인산나트륨 ) 농도로부터선택됨 ) 를갖는용출완충액에의해달성된다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액은소수성상호작용크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, 페닐컬럼 ) 으로의로딩전에약 의 ph( 예를들어, 약 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 에서약 0.5 M 내지약 2.0 M 범위의염 ( 예를들어, NaCl) 농도 ( 예를들어, 약 0.5 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, 또는 2.0 M NaCl) 로조정된다. 일부구현예에서, 소수성상호작용크로마토그래피컬럼은로딩후약 의 ph( 예를들어, 약 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 에서약 0.5 M 내지 2.0 M 범위의염 ( 예를들어, NaCl) 농도 ( 예를들어, 약 0.5 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, 또는 2.0 M NaCl) 를포함하는세척완충액을이용하여세척된다. 일부구현예에서, 소수성상호작용크로마토그래피컬럼은약 의 ph( 예를들어, 약 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 에서약 0.1 M 내지약 0.5 M 범위의염 ( 예를들어, NaCl) 농도 ( 예를들어, 약 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 또는 0.5 M NaCl) 를포함하는용출완충액을이용하여용출된다. 일부구현예에서, 음이온-교환크로마토그래피, 양이온-교환크로마토그래피, 혼합모드크로마토그래피, 및소수성상호작용크로마토그래피컬럼각각은 cm 범위의높이 ( 예를들어, cm, cm, cm, cm, cm, 또는 cm) 를갖는다. 일부구현예에서, 음이온-교환크로마토그래피, 양이온-교환크로마토그래피, 혼합모드크로마토그래피, 및소수성상호작용크로마토그래피컬럼각각은약 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 cm의높이를갖는다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은불순한제조물을첫번째크로마토그래피컬럼에로딩하기전에바이러스비활성화단계를포함한다. 일부구현예에서, 바이러스비활성화단계는불순한제조물에세제를첨가하는것을포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은마지막크로마토그래피컬럼후에바이러스제거단계를추가로포함한다. 일부구현예에서, 본발명의방법은초여과및 / 또는정용여과단계를추가로포함한다. 일부구현예에서, 초여과및 / 또는정용여과단계는정제된재조합 I2S 단백질을약물제형화완충액으로교환하는것을포함한다. 일부구현예에서, 본발명은 SEQ ID NO:1과약 50%( 예를들어, 적어도약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, - 6 -

7 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 이상동일한아미노산서열을갖는재조합 I2S 단백질을정제하는데사용된다. 일부구현예에서, 본발명은 SEQ ID NO:1 과동일한아미노산서열을갖는재조합 I2S 단백질을정제하는데사용 된다. [0018] [0019] [0020] [0021] 일부구현예에서, 본발명은무혈청배지중의현탁액에서배양된포유류세포에의해생성된재조합 I2S 단백질을정제하는데사용된다. 일부구현예에서, 본발명에적합한무혈청배지는동물-유래성분이결핍되어있다. 일부구현예에서, 본발명에적합한무혈청배지는화학적규명배지이다. 일부구현예에서, 포유류세포는생물반응기에서배양된다. 일부구현예에서, 포유류세포는재조합 I2S 단백질및포르밀글리신생성효소 (FGE) 를공동발현한다. 일부구현예에서, 포유류세포는인간세포이다. 일부구현예에서, 본발명의방법에사용되는불순한제조물은포유류세포로부터분비된재조합 I2S 단백질을함유하는무혈청배지로부터제조된다. 일부구현예에서, 본발명의방법에서사용되는불순한제조물은동결된배지제조물로부터해동된다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은평균적으로분자당 16-22개 ( 예를들어, 16-21개, 16-20개, 16-19개, 17-22개, 17-21개, 17-20개, 17-19개 ) 의사양산을함유한다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은평균적으로분자당 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22개의시알산을함유한다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은인간 I2S(SEQ ID NO:1) 의 Cys59에상응하는시스테인잔기의 C α -포르밀글리신(FGly) 으로의약 70%( 예를들어, 적어도약 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 이상의전환율을갖는다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은인간 I2S(SEQ ID NO:1) 의 Cys59에상응하는시스테인잔기의 C α -포르밀글리신(FGly) 으로의실질적으로 100% 의전환율을갖는다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은기질로서헤파린이당류를이용한시험관내설페이트방출활성에의해결정시 20 U/mg, 30 U/mg, 40 U/mg, 50 U/mg, 60 U/mg, 70 U/mg, 80 U/mg, 90 U/mg, 또는 100 U/mg 이상의특이적활성을갖는다. [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은시험관내흡수검정에의해결정시 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 를초과하는세포흡수를특징으로한다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은중성 ( 피크그룹 1), 모노-시알릴레이티드 ( 피크그룹 2), 디-시알릴레이티드 ( 피크그룹 3), 모노포스포릴레이티드 ( 피크그룹 4), 트리-시알릴레이티드 ( 피크그룹 5), 테트라-시알릴레이티드 ( 피크그룹 6), 및디포스포릴레이티드 ( 피크그룹 7) I2S 단백질각각을나타내는 7개의피크그룹을포함하는글리칸맵을특징으로한다. 일부구현예에서, 글리칸맵은뉴라미니다제분해후에생성된다. 다른구체예에서, 글리칸맵은알칼리성포스파타제분해후에생성된다. 특히, 본발명은본원에기재된바와같은정제된재조합 I2S 단백질, 및이를함유하는약학적조성물또는제형을제공한다. 일부구현예에서, 제형은정맥내, 피하및 / 또는수막강내 (intrathecal) 투여용으로제형화된다. 본발명은또한헌터증후군의치료를필요로하는피검체에정제된재조합 I2S, 이를함유하는약학적조성물또는제형을투여함으로써헌터증후군을치료하는방법을제공한다. 본원에서사용되는용어 "I2S 단백질, "I2S", "I2S 효소 " 또는문법적상당어구는달리특별히언급되지않는한재조합 I2S 단백질분자의제조물을의미한다. 본출원에서사용되는용어 " 약 " 및 " 대략 " 은상당어구로사용된다. 약 / 대략을갖거나갖지않는본출원에서사용되는임의의수는관련분야의당업자에의해인지되는임의의일반적인변동을포함하는것을의미한다. 본발명의다른특징, 목적, 및장점은후속되는상세한설명에서명백하다. 그러나, 본발명의구체예를나타내는상세한설명은단지예시로제공되며, 이로제한하는것이아니다. 본발명의범위내의다양한변화및변형은상세한설명으로부터당업자에게명백해질것이다. 정의본발명이보다용이하게이해되도록하기위해, 특정용어가먼저하기에정의된다. 하기용어및다른용어에대한추가정의는본명세서전체에걸쳐기재되어있다. 대략또는약 : 하나이상의관심값에적용되는본원에서사용되는용어 " 대략 " 또는 " 약 " 은언급된참조값과유사한값을의미한다. 특정구체예에서, 용어 " 대략 " 또는 " 약 " 은문맥에달리언급되거나문맥으로부터달리 - 7 -

8 명백하지않는한언급된참조값의어느한방향 ( 초과또는미만 ) 으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는이미만내에해당되는값의범위를의 미한다 ( 상기수가가능한값의 100% 를초과하는경우제외 ). [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] 생물학적활성 : 본원에서사용되는구 " 생물학적활성 " 은생물학적시스템 ( 예를들어, 세포배양물, 유기체등 ) 내에서활성을갖는임의의물질의특징을의미한다. 예를들어, 유기체에투여되는경우이러한유기체에대한생물학적효과를갖는물질이생물학적으로활성인것으로간주된다. 생물학적활성은시험관내검정 ( 예를들어, 시험관내효소검정, 예를들어, 설페이트방출검정 ) 에의해결정될수있다. 특정구체예에서, 단백질또는폴리펩타이드가생물학적으로활성인경우, 단백질또는폴리펩타이드의하나이상의생물학적활성을공유하는단백질또는폴리펩타이드의부분은통상적으로 " 생물학적활성 " 부분으로언급된다. 일부구현예에서, 피검체에투여되는경우생물학적활성을나타내는단백질은세포배양시스템으로부터생성되고 / 되거나정제된다. 일부구현예에서, 단백질은생물학적으로활성이되기위해추가처리를필요로한다. 일부구현예에서, 단백질은생물학적으로활성이되기위해글리코실화 ( 예를들어, 시알릴화 ), 파니실화 (farnysylation), 절단, 폴딩, 포르밀글리신전환율및이의조합을포함하나이에제한되지는않는번역후변형을필요로한다. 일부구현예에서, 프로폼 (proform)( 즉, 미성숙형태 ) 로생성되는단백질은생물학적으로활성이되기위해추가변형을필요로할수있다. 양이온-독립적만노오스-6-포스페이트수용체 (CI-MPR): 본원에서사용되는용어 " 양이온-독립적만노오스-6-포스페이트수용체 (CI-MPR)" 는리소좀으로의수송이예정된골지체내의산가수분해효소전구체상의만노오스- 6-포스페이트 (M6P) 태그에결합하는세포수용체를의미한다. 만노오스-6-포스페이트에더하여, CI-MPR은또한 IGF-II를포함하는다른단백질에결합한다. CI-MPR은 "M6P/IGF-II 수용체 ", "CI-MPR/IGF-II 수용체 ", "IGF- II 수용체 " 또는 "IGF2 수용체 " 로도알려져있다. 이러한용어및이의약어는본원에서상호교환적으로사용된다. 크로마토그래피 : 본원에서사용되는용어 " 크로마토그래피 " 는혼합물의분리를위한기술을의미한다. 통상적으로, 혼합물은 " 정지상 " 으로언급되는또다른물질을고정시키는구조를통해운반되는 " 이동상 " 으로언급되는유체에용해된다. 컬럼크로마토그래피는정지베드 (stationary bed) 가튜브, 즉, 컬럼내에존재하는분리기술이다. 희석제 : 본원에서사용되는용어 " 희석제 " 는재구성된제형의제조에유용한약학적으로허용되는 ( 예를들어, 인간에게투여하기에안전하고비독성임 ) 희석물질을의미한다. 예시적희석제는멸균수, 주사용정균수 (BWFI), ph 완충된용액 ( 예를들어, 포스페이트-완충염수 ), 멸균염수, 링거액 (Ringer's solution) 또는덱스트로오스용액을포함한다. 용출 : 본원에서사용되는용어 " 용출 " 은용매를이용한세척에의해또다른물질로부터한물질을추출하는방법을의미한다. 예를들어, 이온-교환크로마토그래피에서, 용출은포획된이온을제거하기위해로딩된수지를세척하는방법이다. 용출액 : 본원에서사용되는용어 " 용출액 " 은이동상 " 담체 ", 및통상적으로용출의결과로서크로마토그래피로부터나오는분석물질의조합물을의미한다. 효소대체요법 (ERT): 본원에서사용되는용어 " 효소대체요법 (ERT)" 은결실된효소를제공함으로써효소결핍을고치는임의의치료방법을의미한다. 투여후, 효소는세포에의해흡수되고, 리소좀으로수송되며, 여기서상기효소는효소결핍으로인해리소좀내에축적된물질을제거하는작용을한다. 통상적으로, 리소좀효소대체요법이효과적이되도록하기위해서, 치료효소는저장결핍이나타난표적조직내의적절한세포내의리소좀으로전달된다. 평형화시키다또는평형화 : 크로마토그래피와관련하여본원에서사용되는용어 " 평형화시키다 " 또는 " 평형화 " 는일반적으로액체 ( 예를들어, 완충액 ) 성분의안정적이고균등한분포를달성하기위해첫번째용액 ( 예를들어, 완충액 ) 을또다른용액과함께균형상태가되도록하는방법을의미한다. 예를들어, 일부구현예에서, 크로마토그래피컬럼은컬럼을통해요망되는액체 ( 예를들어, 완충액 ) 의하나이상의컬럼부피를통과시킴으로써평형화될수있다. 개선시키다, 증가시키다, 또는감소시키다 : 본원에서사용되는용어 " 개선시키다 ", " 증가시키다 " 또는 " 감소시키다 " 또는이의문법적상당어구는본원에기재된치료의개시전에동일개체에서의측정과같은기준선측정, 또는본원에기재된치료의부재하에서의대조군개체 ( 또는다수의대조군개체들 ) 에서의측정에비한값 - 8 -

9 을나타낸다. " 대조군개체 " 는치료되는개체와대략동일연령이며, 치료되는개체와동일한형태의리소좀 축적병에걸린개체이다 ( 치료된개체및대조군개체 ( 들 ) 에서의질병의단계가비교되는것을보장함 ). [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 불순물 : 본원에서사용되는용어 " 불순물 " 은표적물질또는화합물의화학적조성물과상이한, 제한된양의액체, 가스, 또는고체내의물질을의미한다. 불순물은오염물질로도언급된다. 링커 : 본원에서사용되는용어 " 링커 " 는융합단백질에서자연단백질내의특정위치에서나타나는아미노산서열이아닌아미노산서열을의미하며, 이는일반적으로가요성이있거나, 2개의단백질모이어티사이의 a-헬릭스와같은구조를삽입하도록디자인된다. 링커는스페이서로도언급된다. 로드 (load): 본원에서사용되는용어 " 로드 " 는크로마토그래피에서샘플-함유액체또는고체를컬럼에첨가하는것을의미한다. 일부구현예에서, 컬럼에로딩된샘플의특정성분은이후에로딩된샘플이컬럼을통해통과함에따라포획된다. 일부구현예에서, 컬럼에로딩된샘플의특정성분은, 로딩된샘플이컬럼을통해통과함에따라컬럼에의해포획되지않거나, " 컬럼을통과 " 한다. 폴리펩타이드 : 본원에서사용되는용어 " 폴리펩티드 " 는일반적으로말하면펩타이드결합에의해서로부착된 2 개이상의아미노산의스트링 (string) 이다. 일부구현예에서, 폴리펩타이드는 3-5개이상의아미노산을포함할수있으며, 이들각각은하나이상의펩타이드결합에의해다른아미노산에부착된다. 당업자는폴리펩타이드가때때로 " 비-자연적 " 아미노산또는폴리펩타이드사슬로통합될수없는다른존재물 (entity) 을선택적으로포함하는것을인지할것이다. 푸울 (pool): 크로마토그래피와관련하여본원에서사용되는용어 " 푸울 " 은컬럼을통해함께통과하는유체의하나이상의분획을조합시키는것을의미한다. 예를들어, 일부구현예에서, 크로마토그래피에의해분리된샘플의요망되는성분을함유하는하나이상의분획 ( 예를들어, " 피크분획 ") 은단일한 " 풀링된 (pooled)" 분획을생성시키기위해함께 " 풀링 " 될수있다. 대체효소 : 본원에서사용되는용어 " 대체효소 " 는치료되는질병에서결함이있거나결핍된효소의적어도일부를대체시키는작용을할수있는임의의효소를의미한다. 일부구현예에서, 용어 " 대체효소 " 는치료되는리소좀축적병에서결함이있거나결핍된리소좀효소의적어도일부를대체시키는작용을할수있는임의의효소를의미한다. 일부구현예에서, 대체효소는포유류리소좀에서축적된물질을감소시킬수있거나, 하나이상의리소좀축적병증상을구제하거나개선시킬수있다. 본발명에적합한대체효소는야생형또는변형된리소좀효소둘모두를포함하며, 재조합및합성방법을이용하여생성될수있거나, 자연원으로부터정제될수있다. 대체효소는재조합효소, 합성효소, 유전자-활성화효소또는자연효소일수있다. 가용성 : 본원에서사용되는용어 " 가용성 " 은균일한용액을형성하는치료제의성능을의미한다. 일부구현예에서, 투여되고, 작용표적부위로전달되는용액내의치료제의용해도는치료적유효량의치료제를작용표적부위로전달하기에충분하다. 여러요인이치료제의용해도에영향을미칠수있다. 예를들어, 단백질용해도에영향을미칠수있는관련요인은이온강도, 아미노산서열및다른공동-용해보조제또는염 ( 예를들어, 칼슘염 ) 의존재를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른치료제는이의해당약학적조성물내에서가용성이다. 안정성 : 본원에서사용되는용어 " 안정적 " 은연장된기간에걸쳐치료효능 ( 예를들어, 소기의생물학적활성및 / 또는생리화학적온전성의모두또는대부분 ) 을유지하는치료제 ( 예를들어, 재조합효소 ) 의성능을의미한다. 치료제의안정성, 및이러한치료제의안정성을유지하는약학적조성물의성능은연장된기간 ( 예를들어, 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36개월이상동안 ) 에걸쳐평가될수있다. 제형의측면에서, 안정적제형은제형내의치료제가저장후및처리 ( 예를들어, 동결 / 해동, 기계적혼합및동결건조 ) 동안이의물리적및 / 또는화학적온전성및생물학적활성을본질적으로보유하는제형이다. 단백질안정성에대해, 이는고분자량 (HMW) 응집물의형성, 효소활성의상실, 펩타이드단편의생성및전하프로파일의변화에의해측정될수있다. 바이러스처리 : 본원에서사용되는용어 " 바이러스처리 " 는바이러스가단순히샘플로부터제거되는 " 바이러스제거 ", 또는바이러스가비-감염성형태로샘플에서유지되는 " 바이러스비활성화 " 를의미한다. 일부구현예에서, 바이러스제거는특히, 나노여과및 / 또는크로마토그래피기술을이용할수있다. 일부구현예에서, 바이러스비활성화는특히, 용매비활성화, 세제비활성화, 저온살균, 산성 ph 비활성화, 및 / 또는자외선비활성화를이용할수있다. 발명의상세한설명 - 9 -

10 [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] 본발명은특히, 6개미만의크로마토그래피단계를포함하는방법을기초로하는효소대체요법을위한재조합 I2S 단백질을정제하기위한개선된방법을제공한다. 일부구현예에서, 본발명은음이온-교환크로마토그래피, 양이온-교환크로마토그래피, 혼합모드크로마토그래피, 및소수성상호작용크로마토그래피중하나이상을기초로한방법을이용하여불순한제조물로부터재조합 I2S 단백질을정제하는방법을제공한다. 일부구현예에서, 본발명은 Q 크로마토그래피, 수산화아파타이트 (HA) 크로마토그래피, SP 크로마토그래피, 및페닐크로마토그래피를수행함으로써불순한제조물로부터재조합 I2S 단백질을정제하는방법을제공한다. 본발명은정제된재조합 I2S 단백질및이의사용방법을추가로제공한다. 본발명의다양한양태는하기서브섹션에서추가로상세히기재된다. 서브섹션의사용은본발명을제한하는것을의미하지않는다. 각각의서브섹션은본발명의임의의양태에적용될수있다. 이러한적용에서, " 또는 " 의사용은달리언급하지않는한 " 및 / 또는 " 을의미한다. 재조합 I2S 단백질본원에서사용되는 I2S 단백질은자연발생이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 단백질의적어도부분적활성을대체할수있거나, I2S-결함과관련된하나이상의표현형또는증상을구제할수있는임의의단백질또는단백질의부분이다. 본원에서사용되는용어 "I2S 효소 " 및 "I2S 단백질 " 및문법적상당어구는상호교환적으로사용된다. 통상적으로, 인간 I2S 단백질은전구체형태로사용된다. 인간 I2S의전구체형태는신호펩타이드 ( 전장 (full length) 전구체의아미노산잔기 1-25), 프로-펩타이드 ( 전장전구체의아미노산잔기 26-33), 및 42 kda 사슬 ( 전장전구체의잔기 ) 및 14 kda 사슬 ( 전장전구체의잔기 ) 로추가적처리될수있는사슬 ( 전장전구체의잔기 ) 을함유한다. 통상적으로, 전구체형태는또한 550개의아미노산을함유하는전장전구체또는전장 I2S 단백질로언급된다. 제거되는신호펩타이드를갖는성숙형태의아미노산서열 (SEQ ID NO:1) 및통상적인야생형또는자연발생인간 I2S 단백질의전장전구체 (SEQ ID NO:2) 가표 1에제시된다. 신호펩타이드에는밑줄이있다. 또한, 인간 I2S 단백질이소형 a 및 b 전구체의아미노산서열이또한표 1의 SEQ ID NO:3 및 4에각각제공된다. 표 1. 인간이듀로네이트-2-설파타제 [0056]

11 [0057] [0058] [0059] [0060] 따라서, 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은성숙인간 I2S 단백질 (SEQ ID NO:1) 이다. 본원에개시된바와같이, SEQ ID NO:1은인간 I2S 단백질에대한정준 (canonical) 아미노산서열이다. 일부구현예에서, I2S 단백질은 I2S 유전자의 5' UTR 내의대안적시작부위에서의전사로부터발생하는 SEQ ID NO:1의스플라이스이소형및 / 또는변이체일수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은성숙인간 I2S 단백질의상동체 (homologue) 또는유사체 (analogue) 일수있다. 예를들어, 성숙인간 I2S 단백질의유사체는실질적 I2S 단백질활성을보유하면서야생형또는자연발생 I2S 단백질 ( 예를들어, SEQ ID NO:1) 에비해하나이상의아미노산치환, 결실, 및 / 또는삽입을함유하는변형된성숙인간 I2S 단백질일수있다. 따라서, 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은성숙인간 I2S 단백질 (SEQ ID NO:1) 과실질적으로상동성이다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:1과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의상동성을보이는아미노산서열을갖는다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은성숙인간 I2S 단백질 (SEQ ID NO:1) 과실질적으로동일하다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:1과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로동일한아미노산서열을갖는다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은성숙인간 I2S 단백질의단편또는일부를함유한다. 또한, 재조합 I2S 단백질은전장 I2S 단백질이다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은전장인간 I2S 단백질의상동체또는유사체일수있다. 예를들어, 전장인간 I2S 단백질의상동체또는유사체는실질적 I2S 단백질활성을보유하면서야생형또는자연발생전장 I2S 단백질 ( 예를들어, SEQ ID NO:2) 에비해하나이상의아미노산치환, 결실, 및 / 또는삽입을함유하는변형된전장인간 I2S 단백질일수있다. 따라서, 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은전장인간 I2S 단백질 (SEQ ID NO:2) 과실질적으로상동성이다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:2와 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의상동성을보이는아미노산서열을가질수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:2와실질적으로동일하다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:2와 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로동일한아미노산서열을가질수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은전장인간 I2S 단백질의단편또는일부를함유한다. 본원에서사용되는전장 I2S 단백질은통상적으로신호펩타이드서열을함유한다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 a 단백질이다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 a 단백질의상동체또는유사체일수있다. 예를들어, 인간 I2S 이소형 a 단백질의상동체또는유사체는실질적 I2S 단백질활성을보유하면서야생형또는자연발생인간 I2S 이소형 a 단백질 ( 예를들어, SEQ ID NO:3) 에비해하나이상의아미노산치환, 결실, 및 / 또는삽입을함유하는변형된인간 I2S 이소형 a 단백질일수있다. 따라서, 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 a 단백질 (SEQ ID NO:3) 과실질적으로상동성이다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:3과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의상동성을보이는아미노산서열을가질수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:3과실질적으로동일하다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:3과 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로동일한아미노산서열을가질수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 a 단백질의단편또는부분을함유한다. 본원에서사용되는인간 I2S 이소형 a 단백질은통상적으로신호펩타이드서열을함유한다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 b 단백질이다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 b 단백질의상동체또는유사체일수있다. 예를들어, 인간 I2S 이소형 b 단백질의상동체또는유사체는실질적 I2S 단백질활성을보유하면서야생형또는자연발생인간 I2S 이소형 b 단백질 ( 예를들어, SEQ ID NO:4) 에비해하나이상의아미노산치환, 결실, 및 / 또는삽입을함유하는변형된인간 I2S 이소형 b 단백질일수있다. 따라서, 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 b 단백질 (SEQ ID NO:4) 과실질적으로상동성이다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:4와 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의상동성을보이는아미노산서열을가질수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:4와실질적으로동일하다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질은 SEQ ID NO:4와 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상으로동일한아미노산서열을가질수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은인간 I2S 이소형 b 단백질의단편또는부분을함유한다. 본원에서사용되는인간 I2S 이소형 b 단백질은통상적으로신호펩타이드서열을함유한다

12 [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] 인간 I2S 단백질의상동체또는유사체는당업자에게공지된폴리펩타이드서열을변경시키는방법, 예를들어, 이러한방법을편집한참고문헌에서발견되는방법에따라제조될수있다. 일부구현예에서, 아미노산의보존적인치환은 (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D의그룹내에서의아미노산중에서이루어진치환을포함한다. 일부구현예에서, " 보존적인아미노산치환 " 은아미노산치환이이루어진단백질의상대전하또는크기특징을변경시키지않는아미노산치환을의미한다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은세포흡수및 / 또는리소좀표적화를촉진하기위해표적세포의표면상의수용체에결합하는모이어티를함유할수있다. 예를들어, 이러한수용체는만노오스-6-포스페이트 (M6P) 잔기에결합하는양이온-독립적만노오스-6-포스페이트수용체 (CI-MPR) 일수있다. 또한, CI-MPR은또한 IGF- II를포함하는다른단백질에결합한다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은단백질의표면상에 M6P 잔기를함유한다. 특히, 재조합 I2S 단백질은 CI-MPR에대해보다높은결합친화성을갖는비스-포스포릴레이티드된올리고사카라이드를함유할수있다. 일부구현예에서, 적합한효소는효소당약 20% 이상평균에달하는비스-포스포릴레이티드된올리고사카라이드를함유한다. 다른구체예에서, 적합한효소는효소당약 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% 의비스-포스포릴레이티드된올리고사카라이드를함유할수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 효소는표적세포의표면상의수용체에결합할수있는리소좀표적화모이어티에융합될수있다. 적합한리소좀표적화모이어티는 IGF-I, IGF-II, RAP, p97, 및이의변이체, 상동체또는단편 ( 예를들어, 야생형성숙인간 IGF-I, IGF-II, RAP, p97 펩타이드서열과 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상으로동일한서열을갖는펩타이드를포함함 ) 일수있다. 리소좀표적화모이어티는 N-말단, C-말단또는내부에서 I2S 단백질또는효소에컨쥬게이션되거나융합될수있다. 재조합 I2S 단백질의생성본발명은다양한수단에의해생성된재조합 I2S 단백질을정제하는데사용될수있다. 예를들어, I2S 단백질은 I2S-엔코딩핵산을발현하도록조작된숙주세포시스템을이용함으로써재조합적으로생성될수있다. 또한, I2S 단백질은내인성 I2S 유전자를활성화시킴으로써생성될수있다. 본발명은다양한발현시스템을이용하여생성된재조합 I2S 단백질을정제하는데사용될수있는것이고려된다. 적합한발현시스템은, 예를들어, 란 (egg), 배큘로바이러스,(baculovirus) 식물, 효모, 또는포유류세포를포함한다. 일부구현예에서, I2S 효소는포유류세포에서생성된다. 본발명에따라사용될수있는포유류세포의비제한적인예는 BALB/c 마우스골수종세포주 (NSO/l, ECACC No: ); 인간망막모세포종 (PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); SV40에의해형질전환된원숭이신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간배아신장세포주 ( 현탁배양에서의성장을위해서브클로닝된 HEK293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); 인간섬유육종세포주 ( 예를들어, HT1080); 새끼햄스터신장세포 (BHK21, ATCC CCL 10); 차이니즈햄스터난소세포 +/-DHFR(CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스세르톨리세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: , 1980); 원숭이신장세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카그린 (African green) 원숭이신장세포 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간자궁경부암종세포 (HeLa, ATCC CCL 2); 개신장세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로래트간세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간폐세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간간세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스유방종양 (MMT , ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포 ; FS4 세포 ; 및인간간암세포주 (Hep G2) 를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은인간세포 ( 예를들어, HT1080) 로부터생성된재조합 I2S 효소를정제하는데사용된다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은 CHO 세포로부터생성된재조합 I2S 효소를정제하는데사용된다. 통상적으로, 재조합 I2S를발현하도록조작된세포는본원에기재된재조합 I2S 단백질을엔코딩하는트랜스진을포함할수있다. 핵산엔코딩재조합 I2S는조절서열, 유전자조절서열, 프로모터, 비코딩서열및 / 또는재조합 I2S를발현시키기위한다른적절한서열을함유할수있는것이인지되어야한다. 통상적으로, 코딩영역은상기핵산성분중하나이상과실시가능하게연결된다. " 조절서열 " 은통상적으로코딩서열의업스트림 (5' 비코딩서열 ), 코딩서열내, 또는코딩서열의다운스트림 (3' 비코딩서열 ) 에위치된뉴클레오타이드서열을의미하며, 이는관련된코딩서열의전사, RNA 처리또는안정성,

13 또는번역에영향을미친다. 조절서열은프로모터, 번역리더서열, 인트론, 및폴리아데닐레이션 (polyadenylation) 인지서열을포함할수있다. 때때로, " 조절서열 " 은 " 유전자조절서열 " 로도언급된다. [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] " 프로모터 " 는통상적으로코딩서열또는기능성 RNA의발현을조절할수있는뉴클레오타이드서열을의미한다. 일반적으로, 코딩서열은프로모터서열에대해 3' 에위치된다. 프로모터서열은근위및보다원위의업스트림성분으로구성되며, 보다원위의업스트림성분은종종인헨서 (enhancer) 로언급된다. 따라서, " 인헨서 " 는프로모터활성을자극할수있는뉴클레오타이드서열이며, 이는프로모터의선천적성분또는프로모터의수준또는조직-특이성을향상시키기위해삽입된이종유래성분일수있다. 프로모터는자연유전자로부터이의완전체 (entirety) 로유래될수있거나, 자연에서발견되는다양한프로모터로부터유래된다양한성분으로구성되거나, 심지어합성뉴클레오타이드세그먼트를포함할수있다. 다양한프로모터는다양한조직또는세포유형에서, 또는다양한발달단계에서, 또는다양한환경적조건에반응하여유전자의발현을유도할수있다. "3' 비코딩서열 " 은통상적으로코딩서열의다운스트림에위치된뉴클레오타이드서열을의미하며, 이는폴리아데닐레이션인지서열및 mrna 처리또는유전자발현에영향을미칠수있는조절신호를엔코딩하는다른서열을포함한다. 폴리아데닐레이션신호는보통 mrna 전구체의 3' 말단에폴리아데닐산트랙 (tract) 의첨가에영향을미침으로써특성규명된다. " 번역리더서열 " 또는 "5' 비코딩서열 " 은통상적으로유전자의프로모터서열과코딩서열사이에위치된뉴클레오타이드서열을의미한다. 번역리더서열은번역시작서열의완전히처리된 mrna 업스트림에존재한다. 번역리더서열은 mrna로의일차전사체 (transcript) 의처리, mrna 안정성또는번역효율에영향을미칠수있다. 통상적으로, 용어 " 작동가능하게연결된 " 또는 " 실시가능하게연결된 " 은하나의핵산단편의기능이다른핵산단편에의해영향을미치도록하는단일한핵산단편에대한 2개이상의핵산단편의회합을의미한다. 예를들어, 프로모터는코딩서열의발현에영향을미칠수있는경우 ( 즉, 코딩서열이프로모터의전사조절하에있는경우 ) 에코딩서열과작동가능하게연결된다. 코딩서열은센스또는안티센스배향으로조절서열에작동가능하게연결될수있다. 트랜스진의코딩영역은특정세포유형에대한코돈사용빈도를최적화시키기위해하나이상의잠재적돌연변이를포함할수있다. 예를들어, I2S 트랜스진의코돈은척추동물세포에서의발현을위해최적화될수있다. 일부구현예에서, I2S 트랜스진의코돈은포유류세포에서의발현을위해최적화될수있다. 일부구현예에서, I2S 트랜스진의코돈은인간세포에서의발현을위해최적화될수있다. 임의로, 구조체 (construct) 는하기중하나이상과같은추가성분을함유할수있다 : 스플라이스부위, 인헨서서열, 적절한프로모터의조절하에서의선택가능한마커유전자, 적절한프로모터의조절하에서의증폭가능한마커유전자, 및기질부착영역 (MAR) 또는삽입되는영역의발현을향상시키는당분야에공지된다른성분. 숙주세포로트랜스펙션되거나형질도입된후, 적합한벡터는염색체외적 ( 에피솜적 ) 으로발현할수있거나, 숙주세포의게놈으로통합될수있다. 재조합 I2S 단백질의활성화통상적으로, 재조합 I2S 효소는 2-아미노-3-옥소프로피온산, 또는옥소-알라닌으로도공지된포르밀글리신에대한보존된시스테인 ( 성숙인간 I2S의아미노산 59에상응함 ) 의번역후변형에의해활성화된다. 이러한번역후변형은포르밀글리신생성효소 (FGE) 로공지된효소에의해수행될수있다. 따라서, 일부구현예에서, 재조합 I2S 효소는 FGE 단백질을또한발현하는세포에서생성된다. 특정구체예에서, 재조합 I2S 효소는 FGE 단백질의증가되거나향상된발현을갖는세포에서생성된다. 예를들어, 세포는높은수준의활성효소를갖는 I2S 제조물의생성을촉진하기위해재조합 I2S와함께 FGE를과다발현하도록조작될수있다. 일부구현예에서, FGE의과다-발현은표준재조합기술을이용하여외인성 FGE의발현 ( 예를들어, 과다-발현 ) 에의해달성된다. 일부구현예에서, FGE의과다-발현은, 예를들어, 내인성 FGE 유전자의프로모터를활성화시키거나향상시킴으로써내인성 FGE의활성화되거나향상된발현에의해달성된다. 일부경우에, 핵산엔코딩재조합 I2S 및핵산엔코딩재조합 FGE 단백질은내부리보솜진입부위에상응하는서열을갖는핵산 ( 예를들어, 스페이서서열 ) 에의해연결된다. 시스테인을포르밀글리신으로전환시키는성능을갖는임의의 FGE가본발명에사용될수있다. FGE 단백질에대한예시적핵산및아미노산서열은 US 호에개시되어있으며, 상기서열및서열자체와관련된전체내용은참조로서본원에포함된다. 핵산엔코딩재조합 FGE가조절서열, 유전자조절서열, 프로모터,

14 비코딩서열및 / 또는 FGE 를발현시키기위한다른적절한서열을포함할수있는것이인지되어야한다. 통상 적으로, 코딩영역은상기핵산성분중하나이상과실시가능하게연결된다. [0081] [0082] [0083] [0084] [0085] [0086] [0087] [0088] [0089] 세포배양배지및조건다양한세포배양배지및조건이재조합 I2S 단백질을생성시키는데사용될수있다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질은혈청-함유또는무혈청배지에서생성될수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은무혈청배지에서생성된다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은동물성분비함유배지, 즉, 동물-유래성분이결핍된배지에서생성된다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은화학적규명배지에서생성된다. 본원에서사용되는용어 " 화학적규명영양분배지 " 는화학적성분의실질적으로모두가공지된배지를의미한다. 일부구현예에서, 화학적규명영양소배지는동물-유래성분, 예를들어, 혈청, 혈청유래단백질 ( 예를들어, 알부민또는피투인 (fetuin)), 및다른성분을함유하지않는다. 일부경우에, 화학적규명배지는하나이상의단백질 ( 예를들어, 단백질성장인자또는사이토카인 ) 을포함한다. 일부경우에, 화학적규명영양소배지는하나이상의단백질가수분해물을포함한다. 다른경우에, 화학적규명영양소배지는단백질-비함유배지, 즉, 단백질, 가수분해물또는공지되지않은조성물의성분을함유하지않는무혈청배지이다. 일부구현예에서, 화학적규명배지는하나이상의동물유래성분으로보충될수있다. 이러한동물유래성분은송아지태아혈청, 말혈청, 염소혈청, 당나귀혈청, 인간혈청, 및혈청유래단백질, 예를들어, 알부민 ( 예를들어, 소혈청알부민또는인간혈청알부민 ) 을포함하나, 이에제한되지는않는다. 회전병 (roller bottle) 배양, 배양기배치배양및배양기공급-배치배양을포함하나, 이에제한되지는않는다양한세포배양조건이재조합 I2S 단백질을대규모로생성시키는데사용될수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은현탁배양된세포에의해생성된다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질은부착세포에의해생성된다. 예시적세포배지및배양조건은실시예섹션에기재되어있다. 재조합 I2S 단백질을생성시키기위한추가의예시적방법및조성물은동일날짜에본원과함께출원된 " 재조합이듀로네이트-2-설파타제를생성시키기위한방법및조성물 (Methods and Compositions for Producing Recombinant Iduronate-2-Sulfatase)" 을제목으로하는가출원에기재되어있으며, 이의전체개시내용은참조로서본원에포함된다. 재조합 I2S 단백질의정제일부구현예에서, 본발명은음이온-교환크로마토그래피, 양이온-교환크로마토그래피, 혼합모드크로마토그래피, 및소수성상호작용크로마토그래피중하나이상을기초로한방법을이용하여불순한제조물로부터재조합 I2S 단백질을정제하는방법을제공한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은 6개미만 ( 예를들어, 5개미만, 4개미만, 또는 3개미만 ) 의크로마토그래피단계를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은 2, 3, 4 또는 5개의크로마토그래피단계를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은 4개의크로마토그래피단계를포함한다. 일부구현예에서, 본발명에따른본발명의방법은음이온-교환크로마토그래피, 혼합모드크로마토그래피, 양이온-교환크로마토그래피, 및소수성상호작용크로마토그래피의순서로수행한다. 불순한제조물본원에서사용되는불순한제조물은재조합 I2S 단백질을함유하는처리되지않은생물학적물질을포함하는임의의생물학적물질일수있다. 예를들어, 불순한제조물은 I2S 단백질을생성하는세포 ( 예를들어, 포유류세포 ) 로부터분비된재조합 I2S 단백질을함유하는처리되지않은세포배양배지또는 I2S 단백질을함유하는미가공세포용해질일수있다. 일부구현예에서, 불순한제조물은부분적으로처리된세포배지또는세포용해질일수있다. 예를들어, 세포배지또는세포용해질은농축되거나, 희석되거나, 바이러스비활성화, 바이러스처리또는바이러스제거로처리될수있다. 일부구현예에서, 바이러스제거는특히, 나노여과및 / 또는크로마토그래피기술을이용할수있다. 일부구현예에서, 바이러스비활성화는특히, 용매비활성화, 세제비활성화, 저온살균, 산성 ph 비활성화, 및 / 또는자외선비활성화를이용할수있다. 세포배지또는세포용해질은또한숙주세포단백질및 / 또는핵산 ( 예를들어, DNA 또는 RNA) 의수준을감소시키기위해프로테아제, DNases, 및 / 또는 RNase로처리될수있다. 일부구현예에서, 처리되지않거나부분적으로처리된생물학적물질 ( 예를들어, 세포배지또는세포용해질 ) 은동결되고, 일정기간동안요망되는온도 ( 예를들어, 2-8, -4, -25, -75 ) 에서저장된후, 정제를위해해동될수있다. 본원에서사용되는불순한제조물은시작물질또는로딩물질로도언급된다

15 [0090] [0091] [0092] 음이온-교환크로마토그래피일부구현예에서, 재조합 I2S를정제하기위해제공된방법은음이온-교환크로마토그래피를포함한다. 요컨대, 음이온교환크로마토그래피는음성으로하전된화합물과양성으로하전된수지사이의전하-전하상호작용에의존하는크로마토그래피기술이다. 일부구현예에서, 음이온-교환크로마토그래피는강한음이온-교환크로마토그래피이다. 일부구현예에서, 음이온-교환크로마토그래피는치료단백질 ( 예를들어, 재조합 I2S) 에대한첫번째정제단계로서이용된다. 예시적음이온교환수지는 4차아민수지또는 "Q-수지"( 예를들어, Capto -Q, Q-Sepharose, QAE Sephadex ); 디에틸아미노에탄 (DEAE) 수지 ( 예를들어, DEAE-Trisacryl, DEAE Sepharose, 벤조일화나프토일화 DEAE, 디에틸아미노에틸 Sephacel ; Amberjet 수지 ; Amberlyst 수지 ; Amberlite 수지 ( 예를들어, Amberlite IRA-67, Amberlite 강염기성, Amberlite 약염기성 ), 콜레스티라민수지, ProPac 수지 ( 예를들어, ProPac SAX-10, ProPac WAX-10, ProPac WCX-10); TSK-CEL 수지 ( 예를들어, TSKgel DEAE-NPR; TSKgel DEAE-5PW); 및 Acclaim 지는 Q 수지이다. 수지를포함하나, 이에제한되지는않는다. 특정구체예에서, 음이온교환수 [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] 음이온교환크로마토그래피를위한통상적이동상은비교적극성인용액, 예를들어, 물, 아세토니트릴, 유기알콜, 예를들어, 메탄올, 에탄올, 및이소프로판올, 또는 2-(N-모르폴리노 )-에탄설폰산(MES) 을함유하는용액을포함한다. 따라서, 특정구체예에서, 이동상은약 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는약 100% 극성용매를포함한다. 특정구체예에서, 이동상은분리과정동안임의의제공된시간에서약 1% 내지약 100%, 약 5% 내지약 95%, 약 10% 내지약 90%, 약 20% 내지약 80%, 약 30% 내지약 70%, 또는약 40% 내지약 60% 극성용액을포함한다. 일반적으로, 이동상은염을포함한다. 예를들어, 염 ( 예를들어, 염화나트륨 ) 은음이온교환컬럼으로부터결합된단백질을용출시킬수있다 ( 예를들어, 반대이온은클로라이드이고, 이는이후에방출되는표적단백질을교환시킨다 ). 일부구현예에서, 이동상은약 0 내지약 1.0M, 예를들어, 약 0 내지약 0.8M, 약 0 내지약 0.6M, 약 0 내지약 0.5M, 약 0 내지약 0.4M, 약 0.05M 내지약 0.50M, 약 0.10M 내지약 0.45M, 약 0.10M 내지약 0.40M, 또는약 0.15M 내지약 0.40M의염농도를포함한다. 일부구현예에서, 이동상은약 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 또는 1.0M의염농도를포함한다. 일부구현예에서, 이동상중의염농도는구배 ( 예를들어, 선형또는비-선형구배 ) 이다. 일부구현예에서, 이동상중의염농도는일정하다. 일부구현예에서, 이동상중의염농도는단계적으로증가되거나감소될수있다. 통상적으로, 이동상은완충된다. 특정구체예에서, 이동상은완충되지않는다. 특정구체예에서, 이동상은약 5 내지약 14의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 5 내지약 10의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 5 내지약 7의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 6.5의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10의 ph로완충된다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는통과액은음이온-교환크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, Q 컬럼 ) 으로의로딩전에약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 또는 7.5의 ph 및약 2 ms/cm, 4 ms/cm, 6 ms/cm, 8 ms/cm, 10 ms/cm, 12 ms/cm, 14 ms/cm, 16 ms/cm, 18 ms/cm, 또는 20 ms/cm의전도율로조정된다. ph는소듐아세테이트 ( 예를들어, 1M) 를이용하여조정될수있고, 전도율은염화나트륨 ( 예를들어, 5M) 을이용하여조정될수있다. 로딩후, 음이온-교환크로마토그래피컬럼은약 의 ph( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 또는 7.5) 와함께약 140 mm 내지약 200 mm 범위의염 ( 예를들어, NaCl) 농도 ( 예를들어, 약 140 mm, 145 mm, 150 mm, 155 mm, 160 mm, 165 mm, 170 mm, 175 mm, 180 mm, 185 mm, 190 mm, 195 mm, 또는 200 mm) 를포함하는세척완충액을이용하여세척될수있다. 음이온-교환크로마토그래피컬럼은선형 NaCl 구배를포함하는용출완충액을이용하여용출될수있다. 적합한예시적선형 NaCl 구배는약 mm 범위의 NaCl ( 예를들어, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm, 약 mm) 을함유할수있다. 양이온교환크로마토그래피

16 [0098] [0099] 일부구현예에서, 재조합 I2S를정제하기위해제공된방법은양이온-교환크로마토그래피를포함한다. 요컨대, 양이온교환크로마토그래피는양성으로하전된화합물과음성으로하전된수지사이의전하-전하상호작용에의존하는크로마토그래피기술이다. 일부구현예에서, 양이온-교환크로마토그래피는강한양이온-교환크로마토그래피이다. 양이온교환크로마토그래피는일반적으로설포늄이온을함유하는강하거나약한양이온교환컬럼으로실시되거나, 보통카르복시메틸 (CM) 또는카르복실레이트 (CX) 작용기를갖는약한양이온교환기로실시된다. 많은 적합한양이온교환수지는당분야에공지되어있고, 시판되며, 이는 SP-Sepharose, CM Sepharose ; Amberjet 수지 ; Amberlyst 수지 ; Amberlite 수지 ( 예를들어, Amberlite IRA120); ProPac 수지 ( 예를들어, ProPac SCX-10, ProPac WCX-10, ProPac WCX-10); TSK-GEL 수지 ( 예를들어, TSKgel BioAssist S; TSKgel SP-2SW, TSKgel SP-5PW; TSKgel SP-NPR; TSKgel SCX; TSKgel SP-STAT; TSKgel CM-5PW; TSKgel OApak- A; TSKgel CM-2SW, TSKgel CM-3SW, 및 TSKgel CM-STAT); 및 Acclaim 수지를포함하나, 이에제한되지는않는다. 특정구체예에서, 음이온교환수지는 SP-Sepharose 수지 이다. [0100] [0101] [0102] [0103] 양이온교환크로마토그래피에대한통상적인이동상은비교적극성의용액, 예를들어, 물, 아세토니트릴, 유기알콜, 예를들어, 메탄올, 에탄올, 및이소프로판올, 또는 2-(N-모르폴리노 )-에탄설폰산(MES) 을함유하는용액을포함한다. 따라서, 특정구체예에서, 이동상은약 0%, 1%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는약 100% 의극성용액을포함한다. 특정구체예에서, 이동상은분리과정동안임의의제공된시간에서약 1% 내지약 100%, 약 5% 내지약 95%, 약 10% 내지약 90%, 약 20% 내지약 80%, 약 30% 내지약 70%, 또는약 40% 내지약 60% 의극성용액을포함한다. 일반적으로, 이동상은염을포함한다. 예를들어, 염 ( 예를들어, 염화나트륨, 인산나트륨등 ) 은양이온교환컬럼으로부터결합된단백질을용출시킬수있다 ( 예를들어, 반대이온은소듐이고, 이는이후에방출되는표적단백질을교환시킨다 ). 일부구현예에서, 이동상은약 0 내지약 1.0M, 예를들어, 약 0 내지약 0.8M, 약 0 내지약 0.6M, 약 0 내지약 0.5M, 약 0 내지약 0.4M, 약 0.05M 내지약 0.50M, 약 0.10M 내지약 0.45M, 약 0.10M 내지약 0.40M, 또는약 0.15M 내지약 0.40M의염농도를포함한다. 일부구현예에서, 이동상은약 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M, 0.05M, 0.06M, 0.07M, 0.08M, 0.09M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4M, 0.5M, 0.6M, 0.7M, 0.8M, 0.9M, 또는 1.0M의염농도를포함한다. 일부구현예에서, 이동상내의염농도는구배 ( 예를들어, 선형또는비-선형구배 ) 이다. 일부구현예에서, 이동상내의염농도는일정하다. 일부구현예에서, 이동상내의염농도는단계적으로증가되거나감소될수있다. 통상적으로, 이동상은완충된다. 특정구체예에서, 이동상은완충되지않는다. 특정구체예에서, 이동상은약 5 내지약 14의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 5 내지약 10의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 5 내지약 7의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 6.5의 ph로완충된다. 특정구체예에서, 이동상은약 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 또는 10의 ph로완충된다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액은양이온-교환크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, SP 컬럼 ) 으로의로딩전에약 1 ms/cm 내지 20 ms/cm 범위의전도율 ( 예를들어, 약 1 ms/cm 내지 15 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 10 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 8 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 6 ms/cm, 약 1 ms/cm 내지 4 ms/cm, 약 2 ms/cm 내지 4 ms/cm) 로조정된다. 특정구체예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액은양이온-교환크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, SP 컬럼 ) 으로의로딩전에약 2 ms/cm 내지 4 ms/cm 범위의전도율 ( 예를들어, 2, 2.5, 3, 3.5, 또는 4 ms/cm) 로조정된다. 전도율은불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액을 H 2 O로, 예를들어, 1:1, 1.1:1, 1.2:1, 1.3:1, 1.4:1, 1.5:1, 2.0:1, 2.5:1, 3.0:1, 4.0:1, 5.0:1, 또는 10:1의비로희석시킴으로써조정될수있다. 전도율은또한요망되는완충액으로의정용여과에의해조정될수있다. 일부구현예에서, 양이온-교환크로마토그래피컬럼은약 의 ph( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0 또는 6.5) 에서수행된다. 일부구현예에서, 양이온-교환크로마토그래피컬럼은약 0.01 M 내지약 0.1 M 범위의포스페이트 ( 예를들어, NaPO4) 농도 ( 예를들어, 약 0.01 M, 0.02 M, 0.03 M, 0.04 M, 0.05 M, 0.06 M, 0.07 M, 0.08 M, 0.09 M, 또는 0.1 M) 를포함하는완충액으로수행된다. 일부구현예에서, 적합한 ph는약 ( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0, 또는 6.5) 이다. [0104] 혼합모드크로마토그래피

17 [0105] 수산화아파타이트크로마토그래피 (HA) 는 " 슈도-친화성 (Pseudo-affinity)" 또는 " 혼합-모드 " 이온크로마토그래피인것으로간주되고, 이는본발명에따라사용될수있다. 수산화아파타이트는생물학적분자의분획화및정제에사용되는칼슘포스페이트의독특한형태이다. 일부경우에, 결정성수산화아파타이트가사용될수있으나, 결정의취약성은유속및 / 또는컬럼수명을제한할수있다. 2 유형의화학적으로순수한세라믹수산화아파타이트, CHT 세라믹수산화아파타이트타입 I 및 II는매크로다공성구체이며, 이는높은유속및압력에서사용될수있다. 타입 I은일반적으로높은단백질결합성능을갖는반면, 타입 II는일반적으로단백질에대해낮은결합성능을갖는다. 일반적으로, 수산화아파타이트의화학식은 Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 (Kawasaki, et al 1985) 이다. 작용기는결정칼슘이온 (C-부위) 의양성으로하전된쌍및결정포스페이트 (P-부위) 의트리플렛 (triplet) 과회합된 6개의음성으로하전된산소원자의클러스터를포함한다. C-부위, P-부위및하이드록실은결정표면상에고정된패턴으로분배되며, 이는일반적으로단백질및다른분자와의복잡한상호작용을야기시킨다. [0106] [0107] [0108] [0109] [0110] 샘플은중성 ph 또는중성에가까운 ph의낮은이온강도의포스페이트완충액 ( 예를들어, 1-10 mm 소듐또는포타슘포스페이트 ) 중에서 HA 컬럼에로딩될수있다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는컬럼통과액은혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 으로의로딩전에약 M 내지약 0.01 M 범위의포스페이트 ( 예를들어, NaPO4) 농도 ( 예를들어, 약 M, M, M, M, M, M, M, M, M, 또는 0.01 M) 및약 의 ph( 예를들어, 약 5.0, 5.5, 6.0, 또는 6.5) 로조정된다. 로딩된 HA 컬럼은통상적으로로딩완충액의포스페이트농도와동등한포스페이트농도를갖는세척완충액으로세척된다. 일부구현예에서, 혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 은로딩후중성 ph 또는중성에가까운 ph의포스페이트 ( 예를들어, 1-10 mm 소듐또는포타슘포스페이트 ) 을함유하는세척완충액으로세척된다. 예를들어, 적합한세척완충액은약 1 mm, 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm의포스페이트농도를가질수있다. 일부구현예에서, 보다엄격한세척조건을발생시키기위해세척완충액중의포스페이트의양을증가시키는것이요망될수있다. I2S 단백질의표면상의 M6P 수준, 특히, 디-M6P 수준이리소좀표적화에중요한것이고려된다. 세척완충액중의증가된포스페이트농도는선택적으로 HA 컬럼상에높은수준의 M6P, 특히, 디-M6P를갖는 I2S 단백질을보유할수있다. 따라서, 일부구현예에서, 요망되는세척완충액은 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm 또는이를초과하는포스페이트농도를가질수있다. 일부구현예에서, 로딩된혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 은약 mm 범위의포스페이트농도 ( 예를들어, 약 mm, mm, mm, mm, mm, mm) 를갖는세척완충액으로세척된다. 일부구현예에서, 로딩된혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 은 10 mm, 11 mm, 12 mm, 13 mm, 14 mm, 15 mm, 16 mm, 17 mm, 18 mm, 19 mm, 20 mm 또는이를초과하는포스페이트농도를갖는세척완충액으로세척된다. HA 컬럼으로부터의용출은통상적으로구배포스페이트완충액으로달성된다. 예를들어, 적합한용출완충액은약 mm( 예를들어, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm, mm) 의인산나트륨의포스페이트구배를가질수있다. 일부구현예에서, HA 컬럼으로부터의용출은용출완충액중의포스페이트농도를단계적으로증가시킴으로써달성된다. 일부구현예에서, 단계적용출완충액은 10 mm, 20 mm, 30 mm, 40 mm, 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 100 mm, 110 mm, 120 mm, 130 mm, 140 mm, 150 mm, 200 mm, 250 mm, 300 mm, 350 mm, 400 mm로부터선택된포스페이트농도를가질수있다. 일부구현예에서, 혼합모드크로마토그래피컬럼 ( 예를들어, HA 컬럼 ) 으로부터의용출은약 50 mm 내지약 150 mm 범위의포스페이트 ( 예를들어, 인산나트륨 ) 농도 ( 예를들어, 약 50 mm, 60 mm, 70 mm, 80 mm, 90 mm, 100 mm, 110 mm, 120 mm, 130 mm, 140 mm, 150 mm, 및이의조합의포스페이트 ( 예를들어, 인산나트륨 ) 농도로부터선택됨 ) 를갖는용출완충액에의해달성된다. HA 크로마토그래피를위한조건의많은다양한조합이공지되어있고, 파라미터를특정관심단백질 ( 예를들어, 재조합 I2S) 에적합하게되도록조정하는데사용될수있음이인지될것이다. 소수성상호작용크로마토그래피소수성상호작용크로마토그래피 (HIC) 는단백질을또다른단백질로부터분리시키기위해소수성의특성을이용하는분리기술이다. 상기유형의크로마토그래피에서, 페닐, 옥틸, 또는부틸과같은소수성기가정지컬럼에부착된다. 표면상에소수성아미노산측쇄를갖는컬럼을통해통과하는단백질은컬럼상의소수성기와

18 상호작용하고이에결합할수있다. HIC 컬럼이공지되어있고, 이는, 예를들어, 페닐세파로오스 (Phenyl Sepharose) 를포함한다. [0111] HIC 분리는종종이온교환크로마토그래피에서사용되는조건의반대조건을이용하도록디자인된다. 일반적으로, 높은이온강도를갖는완충액, 보통암모늄설페이트가먼저컬럼에적용된다. 완충액내의염은샘플용질의용매화를감소시키고, 이에따라용매화가감소하고, 노출되는소수성영역이배지에의해흡착된다. 정지상은일반적으로다른분자와소수성상호작용을형성하도록디자인된다. 이러한상호작용은일반적으로물에서너무약하나, 완충액으로의염 ( 예를들어, Na 2 SO 4, K 2 SO 4, (NH 4 ) 2 SO 4, NaCl, NH 4 Cl, NaBr, 및 NaSCN) 의첨 가는소수성상호작용을발생시킨다. 일부구현예에서, 이동상은약 0.1M 내지약 3.0M, 예를들어, 약 0.1M 내지약 1.5M, 약 0.2M 내지약 0.8M, 또는약 0.3M 내지약 0.5M 의염농도를포함한다. [0112] [0113] [0114] [0115] [0116] [0117] [0118] [0119] 특정구현예에서, 이동상은완충된다. 특정구현예에서, 이동상은완충되지않는다. 특정구현예에서, 이동상은 ph 약 5 내지약 14로완충된다. 특정구현예에서, 이동상은 ph 약 5 내지약 10로완충된다. 특정구현예에서, 이동상은 ph 약 5 내지약 7로완충된다. 특정구현예에서, 이동상은 ph 약 5.0로완충된다. 일부구현예에서, 불순한제조물또는중간용출액또는통과액은소수성상호작용크로마토그래피컬럼 ( 예컨대, 페닐컬럼 ) 으로로딩되기전에 ph 약 ( 예컨대, 약 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 에서약 0.5 M 내지약 2.0 M( 예컨대, 약 0.5 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, 또는 2.0 M) 범위의염 ( 예컨대, NaCl) 농도로조절된다. 로딩되면, 소수성상호작용크로마토그래피컬럼은 ph 약 ( 예컨대, 약 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 에서약 0.5 M 내지약 2.0 M( 예컨대, 약 0.5 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, 또는 2.0 M) 범위의염 ( 예컨대, NaCl) 농도를포함하는세척완충제를사용하여세척될수있다. 일부구현예에서, 소수성상호작용크로마토그래피컬럼은 ph 약 ( 예컨대, 약 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0) 에서약 0.1 M 내지약 0.5 M ( 예컨대. 약 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 또는 0.5 M) 범위의염 ( 예컨대, NaCl) 농도를포함하는용출완충제를사용하여용출된다. 정제된 I2S 단백질의특성화정제된재조합 I2S 단백질은여러방법을사용하여특성화될수있다. 순도정제된재조합 I2S 단백질의순도는전형적으로최종생성물에존재하는여러불순물 ( 예컨대, 숙주세포단백질또는숙주세포 DNA) 의수준에의해측정된다. 예를들어, 숙주세포단백질 (HCP) 의수준은 ELISA 또는 SDS- PAGE에의해측정될수있다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질은 150 ng HCP/mg I2S 미만의단백질 ( 예컨대, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 30, 20, 10 ng HCP/mg I2S 미만의단백질 ) 을함유한다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질을염색법 (silver staining) 으로 SDS-PAGE 처리하는경우, 0.05%, 0.01%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% 검정대조군보다더큰강도를가지는새로운밴드를갖지않는다. 여러검정대조군이사용될수있으며, 특히, FDA와같은규제청이허용하는것들이사용될수있다. 특이적활성또한, 정제된재조합 I2S 단백질은기능적및 / 또는생물학적활성을평가함으로써특성화될수있다. 재조합 I2S 조성물의효소활성은당해공지된방법을사용하여측정될수있다. 전형적으로, 이들방법은설페이트방출검정으로서공지되어있는, 합성기질로부터의설페이트제거를검출하는것을포함한다. 효소활성검정의일례는이온크로마토그래피의사용을포함한다. 이방법은기질로부터재조합 I2S에의해효소적으로방출되는설페이트이온의양을정량화하는것이다. 기질은천연기질또는합성기질일수있다. 몇몇경우에, 기질은헤파린설페이트 ( 예컨대, 헤파린디사카라이드 ), 더마탄설페이트, 또는이의기능적등가물이다. 전형적으로, 방출된설페이트이온은전도도검출기가구비된이온크로마토그래피에의해분석된다. 이러한예에서, 결과는 U/ 단백질의 mg으로서표현될수있으며, 1 유닛 (Unit) 은기질로부터시간당 1 μmole 설페이트이온을방출시키는데요구되는효소의양으로서정의된다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질은, 기질로서헤파린디사카라이드를사용하는시험관내설페이트방출활성검정에의해측정되는경우, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg, 약 U/mg 범위의특이적활성을갖는다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질은, 기질로서헤파린디사카라이드를사용하는시험관내설페이트방출활성검정에의해측

19 정되는경우, 약 5 U/mg, 약 10 U/mg, 약 15 U/mg, 약 20 U/mg, 약 25 U/mg, 약 30 U/mg, 약 35 U/mg, 약 40 U/mg, 약 45 U/mg, 약 50 U/mg, 약 55 U/mg, 약 60 U/mg, 약 65 U/mg, 약 70 U/mg, 약 75 U/mg, 약 80 U/mg, 약 85 U/mg, 약 90 U/mg, 약 95 U/mg, 또는약 100 U/mg 이상의특이적활성을갖는다. 기질로서헤파린디사카라이드를사용하는시험관내설페이트방출활성검정을수행하기위한예시적인조건이하기에제시된다. 전형적으로, 이검정은천연유래된기질인헤파린디사카라이드로부터설페이트이온을방출시키는 I2S의성능을측정한다. 방출된설페이트는이온크로마토그래피에의해정량화될수있다. 몇몇경우에, 이온크로마토그래피에전도도검출기가구비된다. 비제한적예로서, 샘플을먼저 10mM Na 아세테이트, ph 6으로완충제교환시켜제형완충제중의포스페이트이온에의한억제를제한한다. 이후, 샘플은반응완충제 (10mM Na 아세테이트, ph 4.4) 를사용하여 mg/ml로희석되고, 30μL 반응부피에서 0.3 μg I2S/100 μg기질의효소대기질비로헤파린디사카라이드와함께 37 에서 2시간동안인큐베이션된다. 이후, 이반응은 3분동안 100 에서샘플을가열함으로써중단된다. IonPac AG18 guard 컬럼과함께 Dionex IonPac AS18 분석컬럼을사용하여분석이수행된다. 15분동안 1.0 ml/min로 30 mm 수산화칼륨에의한동용매 (isocratic) 방법이사용된다. I2S 샘플에의해방출된설페이트의양은 1.7 내지 16.0 nmole 범위에서설페이트표준의선형회귀분석으로부터계산된다. 기록가능한값이단백질 1mg에대한유닛으로서표현되며, 여기서 1 유닛은시간당방출된 1μ mole의설페이트로서정의되고, 단백질농도는 A280 측정에의해결정된다. [0120] 일부구현예에서, 재조합 I2S 단백질의효소활성은또한예를들어, 4-메틸움벨리페릴-설페이트 (4- methylumbelliferyl-sulfate) 의설페이트및천연형광 4-메틸움벨리페론 (4-methylumbelliferone: 4-MUF) 으로의가수분해를측정하는 4-MUF 검정과같은당해공지된여러다른방법을사용하여측정될수있다. 일부구현예에서, 시험관내 4-MUF 검정으로측정되는, 생산된재조합 I2S 단백질의요망되는효소활성은약 0.5 U/mg, 1.0 U/mg, 1.5 U/mg, 2 U/mg, 2.5 U/mg, 3 U/mg, 4 U/mg, 5 U/mg, 6 U/mg, 7 U/mg, 8 U/mg, 9 U/mg, 10 U/mg, 12 U/mg, 14 U/mg, 16 U/mg, 18 U/mg, 또는 20 U/mg 이상이다. 일부구현예에서, 시험관내 4-MUF 검정으로측정되는, 생산된재조합 I2S 단백질의요망되는효소활성은약 0-50 U/mg ( 예컨대, 약 0-40 U/mg, 약 0-30 U/mg, 약 0-20 U/mg, 약 0-10 U/mg, 약 2-50 U/mg, 약 2-40 U/mg, 약 2-30 U/mg, 약 2-20 U/mg, 약 2-10 U/mg, 약 4-50 U/mg, 약 4-40 U/mg, 약 4-30 U/mg, 약 4-20 U/mg, 약 4-10 U/mg, 약 6-50 U/mg, 약 6-40 U/mg, 약 6-30 U/mg, 약 6-20 U/mg, 약 6-10 U/mg) 의범위이다. 시험관내 4-MUF 검정을수행하기위한예시적인조건이하기에제시된다. 전형적으로, 4-MUF 검정은 4-메틸움벨리페릴-설페이트 (4-MUF-SO4) 를설페이트및천연형광 4-메틸움벨리페론 (4-MUF) 으로가수분해시키는 I2S 단백질의성능을측정한다. 1 밀리유닛의활성은 37 에서 1분내에 1 나노몰의 4-MUF-SO 4 를 4-MUF로전환시키는데요구되는효소의양으로서정의된다. 전형적 으로, 공지된활성을갖는 I2S 시험샘플에의해생성된평균형광유닛 (MFU) 이표준곡선을생성하는데사용될 수있으며, 이것이관심있는샘플의효소활성을계산하는데사용될수있다. 따라서, 효소활성을단백질농 도로나눔으로써특이적활성이계산될수있다. [0121] [0122] [0123] [0124] [0125] 다른예에서, 재조합 I2S 조성물의단백질농도는단백질농도를측정하기위한당해공지되어있는어떠한적합한방법에의해측정될수있다. 몇몇경우에, 단백질농도는자외선흡광도검정에의해측정된다. 이러한흡광도검정은전형적으로약 280 nm 파장 (A 280 ) 에서수행된다. 전하프로파일정제된재조합 I2S은단백질과관련된전하프로파일에의해특성화될수있다. 전형적으로, 단백질전하프로파일은전형적으로단백질의표면상에존재하는잔기측쇄전하의패턴을반영한다. 전하프로파일은단백질에대한이온교환 (IEX) 크로마토그래피 ( 예컨대, HPLC) 검정을수행함에의해측정될수있다. 일부구현예에서, " 전하프로파일 " 은교환이온을함유하는이동상의컬럼으로의첨가후소정시점에서이온교환컬럼으로부터용출되는단백질의양을나타내는일련의값을나타낸다. 전형적으로, 적합한이온교환컬럼은음이온교환컬럼이다. 예를들어, 전하프로파일은고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 시스템을사용하는강한 (strong) 음이온교환 (SAX) 크로마토그래피에의해결정될수있다. 일반적으로, 재조합 I2S는강한음이온교환컬럼의고정된양전하상에흡착되고, 증가하는이온강도의구배는소정유속에서이동상을사용하여양으로하전된컬럼과재조합 I2S 종과의이온상호작용강도에비례하여컬럼으로부터재조합 I2S 종을용출시킨다. 음으로보다많이하전된 ( 보다산성 ) I2S 종은음으로보다적게하전된 ( 덜산성 ) I2S 종보다더늦게용출된다. 용출액중단백질의농도는자외선흡광도 (280 nm에서 ) 에의해검출된다. 일부구현예에서, 재조합 I2S는 20 mm TRIS-HCl 중약 ph 8.0에서 Mini Q PE 컬럼의고정된양전하상에흡착

20 되고, 증가하는이온강도의구배는 20 mm TRIS-HCL, 1 M 염화나트륨, ph 8.0 로이루어진이동상을 0.8 ml/min 의유속에서사용하여양으로하전된컬럼과재조합 I2S 종과의이온상호작용강도에비례하여컬럼으로부터 재조합 I2S 종을용출시킨다. [0126] [0127] [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] 일부구현예에서, 전하프로파일은 HPLC 컬럼으로부터용출후시간에대한흡광도유닛의크로마토그램 (chromatogram) 에의해도시될수있다. 크로마토그램은하나이상의피크를포함할수있으며, 그러한세트중각각의피크는유사한표면전하를갖는조성물의재조합 I2S의아집단 (subpopulation) 을확인하게한다. 일부구현예에서, 정제된 I2S 단백질조성물은전하프로파일내 6개이상의피크를나타낸다. I2S의예시적전하프로파일이실시예섹션및도 11에묘사되어있다. 도 11에도시된바와같이, 6개의피크는크로마토그램의전체피크면적에대한기여도를감소시키고음전하는증가시키는순으로표지되어있다 (A에서 F로 ). 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 조성물에대한전하프로파일은단백질표면상의음전하또는양전하의양에기초하여상이한피크개수, 크기, 모양또는시간간격을포함한다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 조성물은 6 개미만 ( 예컨대, 5, 4, 3, 또는 2개미만 ) 의피크를갖는전하프로파일을갖는다. 일부구현예에서, 재조합 I2S의전하프로파일은 5, 4, 3, 2, 또는 1개의피크 ( 들 ) 을가질수있다. 예를들어, 피크 A, B, C, D, E, 및 F 중어느하나, 두개, 세개, 네개또는다섯개의피크가정제된재조합 I2S 단백질조성물중에부재하거나감소될수있다. 전형적으로, 전하프로파일은보다적은피크가존재하는경우보다더균질한것으로간주된다. 글리칸맵핑 (Glycan Mapping) 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질은전형적으로글리칸맵핑으로서일컬어지는, 이들의프로테오글리칸 (proteoglycan) 조성에의해특성화될수있다. 어떠한이론에구속시키고자하는것은아니지만, 분지구조의모양및복잡성과함께글리칸연결은생체내소실 (clearance), 리소좀표적화, 생체이용률및 / 또는효능에영향을미칠수있는것으로여겨진다. 전형적으로, 글리칸맵은효소분해및이후크로마토그래피분석에의해결정될수있다. 적합한글리코실라제, 펩티다제 ( 예컨대, 엔도펩티다제, 엑소펩티다제 ), 프로테아제, 및포스파타제를포함하나, 이로제한되는것은아닌여러효소가효소분해에사용될수있다. 일부구현예에서, 적합한효소는알칼린포스파타제이다. 일부구현예에서, 적합한효소는뉴라미니다제 (neuraminidase) 이다. 글리칸 ( 예컨대, 포스포글리칸 ) 은크로마토그래피분석에의해검출될수있다. 예를들어, 포스포글리칸은펄스형암페로메트리검출법 (Pulsed Amperometric Detection) 과함께고성능음이온교환크로마토그래피 (HPAE-PAD) 또는크기배제고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 에의해검출될수있다. 글리칸맵상에서각각의피크에의해표현되는글리칸 ( 예컨대, 포스포글리칸 ) 의양은당분야에공지되어있고본원에기술되어있는방법들에따라글리칸 ( 예컨대, 포스포글리칸 ) 의표준곡선을사용하여산출될수있다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된 I2S는각각중성 ( 피크그룹 1), 모노시알릴레이티드 ( 피크그룹 2), 디시알릴레이티드 ( 피크그룹 3), 모노포스포릴레이티드 ( 피크그룹 4), 트리시알릴레이티드 ( 피크그룹 5), 테트라시알릴레이티드 ( 피크그룹 6), 및디포스포릴레이티드 ( 피크그룹 7) I2S 단백질을나타내는 7개의피크그룹을포함하는글리칸맵을나타낸다. I2S의예시적인글리칸맵이도 10에도시되어있다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S는 7개미만의피크그룹을갖는글리칸맵 ( 예컨대, 6, 5, 4, 3, 또는 2개의피크그룹을갖는글리칸맵 ) 을갖는다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S은 7개초과의피크그룹 ( 예컨대, 8, 9, 10, 11, 12 또는그초과 ) 을갖는글리칸맵을갖는다. 각각의피크그룹에상응하는글리칸의상대적양은사전설정된참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대한상기피크그룹면적에기반하여결정될수있다. 일부구현예에서, 피크그룹 1 ( 중성 ) 은참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대해약 % ( 예컨대, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %) 범위의피크그룹면적을가질수있다. 일부구현예에서, 피크그룹 2 ( 모노시알릴레이티드 ) 은참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대해약 % ( 예컨대, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %) 범위의피크그룹면적을가질수있다. 일부구현예에서, 피크그룹 3 ( 디시알릴레이티드 ) 은참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대해약 % ( 예컨대, 약 %, %, 약 %, 약 %) 범위의피크그룹면적을가질수있다. 일부구현예에서, 피크그룹 4 ( 모노포스포릴레이티드 ) 는참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대해약 % ( 예컨대, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %,

21 약 %, 약 %, 약 %, 또는약 %) 범위의피크그룹면적을가질수있다. 일부구현예에서, 피크그룹 5 ( 트리시알릴레이티드 ) 는참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대해약 % ( 예컨대, 약 %, 약 %, 약 70-95%, 약 70-90%, 약 %, 약 %, 약 %, 또는약 80-95%) 범위의피크그룹면적을가질수있다. 일부구현예에서, 피크그룹 6 ( 테트라시알릴레이티드 ) 은참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대해약 % ( 예컨대, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 또는약 %) 범위의피크그룹면적을가질수있다. 일부구현예에서, 피크그룹 7 ( 디포스포릴레이티드 ) 은참조표준에서의상응하는피크그룹면적에대해약 % ( 예컨대, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %, 약 %) 범위의피크그룹면적을가질수있다. 글리칸맵핑에대한여러참조표준은당분야에공지되어있으며, 본발명을실시하는데사용될수있다. 전형적으로, 피크그룹 7 ( 디포스포릴레이티드 ) 은정제된재조합 I2S 단백질의표면상의디-M6P의수준에상응한다. [0133] [0134] [0135] [0136] [0137] 정제된 I2S의글리코실화패턴은리소좀표적화에영향을미치는것으로고려된다. 여러시험관내세포흡수검정은당분야에공지되어있으며, 본발명을실시하는데사용될수있다. 예를들어, M6P 수용체에의한 I2S 의흡수율을평가하기위해, 표면상에서 M6P 수용체를발현시키는인간섬유아세포를사용하여세포흡수검정이실시된다. I2S의내재화된양은 ELISA 방법에의해측정될수있다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은시험관내흡수검정에의해측정하는경우, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 초과의세포흡수율로특성화된다. 펩타이드맵핑일부구현예에서, 펩타이드맵핑은아미노산조성, 번역후변형, 및 / 또는세포처리 (cellular processing), 예컨대신호펩타이드의절단, 포르밀글리신전환율및 / 또는글리코실화를특성화하는데사용될수있다. 전형적으로, 재조합단백질은제어된분해또는임의적분해를통해이산된펩타이드단편으로분해되어패턴또는펩타이드맵을생성시킬수있다. 몇몇경우에, 정제된 I2S 단백질은해석적분석전에먼저효소분해로처리될수있다. 분해는해석적분석전에, 펩티다제, 글리코사이드가수분해효소, 포스파타제, 리파제또는프로테아제및 / 또는이들의조합물을사용하여수행될수있다. 펩타이드의구조적조성이당분야에널리공지된방법을사용하여측정될수있다. 예시적방법으로는질량분광법 (Mass spectrometry), 핵자기공명법 (Nuclear Magnetic Resonance(NMR)) 또는 HPLC를포함하나, 이로제한되는것은아니다. 포르밀글리신전환퍼센트펩타이드맵핑은 FGly 전환퍼센트를측정하는데사용될수있다. 상기논의된바와같이, I2S 활성화는하기도시된바와같이포르밀글리신생성효소 (FGE) 에의한시스테인 ( 성숙인간 I2S의 59번위치에해당함 ) 의포르밀글리신으로의전환을필요로한다 : [0138] [0139] 따라서, 포르밀글리신전환율 (%FG) 은하기식을사용하여계산될수있다 : [0140] [0141] %FG를계산하기위해, 재조합 I2S 단백질은프로테아제 ( 예컨대, 트립신또는키모트립신 ) 를사용하여짭은펩타이드로분해될수있다. 짧은펩타이드는예컨대, 크기배제고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 를사용하여분리되고특성화될수있다. 성숙인간 I2S의 59번위치에상응하는위치를함유하는펩타이드는대조군 ( 예컨대, FGly 전환이없는 I2S 단백질또는 100% FGly 전환된 I2S 단백질 ) 과비교하여 59번위치에서의 Cys가 FGly 로전환되었는지를결정하기위해특성화될수있다. FGly를함유하는펩타이드의양 ( 활성 I2S 분자의수에상응함 ) 및 FGly 및 Cys 둘모두를지닌펩타이드의총량 ( 전체 I2S 분자의수에상응함 ) 은상응하는피크면적에

22 기반하여결정될수있으며, %FG 를반영하는비가산출될수있다. [0142] 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은약 70% 이상 ( 예컨대, 적어도약 77%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%) 의인간 I2S (SEQ ID NO:1) 의 Cys59 에상응하는시스테인잔기의 C α - 포르밀글리 신 (FGly) 로의전환율을갖는다. 일부구현예에서, 본발명에따른정제된재조합 I2S 단백질은실질적으로 100% 의인간 I2S (SEQ ID NO:1) 의 Cys59 에상응하는시스테인잔기의 C α - 포르밀글리신 (FGly) 로의전환율을갖 는다. [0143] [0144] [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] [0150] [0151] [0152] [0153] 시알산함량일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질은이들의시알산조성에의해특성화될수있다. 이론에구속시키고자하는것은아니지만, 단백질상의시알산잔기는간세포 (hepatocyte) 상에존재하는아시알로글리코단백질 (asialoglycoprotein) 수용체를통해이들의생체내소실을예방하거나, 감소시키거나억제할수있는것으로간주된다. 따라서, 비교적높은시알산함량을갖는재조합단백질은전형적으로상대적으로긴생체내순환시간을갖는것으로여겨진다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질의시알산함량은당분야에널리공지된방법을사용하여결정될수있다. 예를들어, 재조합 I2S 단백질의시알산함량은효소분해및이후크로마토그래피분석에의해결정될수있다. 효소분해는어떠한적합한시알리다제 (sialidase) 를사용하여달성될수있다. 몇몇경우에, 그러한분해는뉴라미니다제 (neuraminidase) 와같은글리코사이드가수분해효소에의해수행된다. 시알산은펄스형암페로메트리검출법과함께고성능음이온교환크로마토그래피 (HPAE-PAD) 와같은크로마토그래피분석에검출될수있다. 재조합 I2S 조성물중시알산의양은당분야에공지되고본원에기술된방법에따라시알산의표준곡선을사용하여산출될수있다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질의시알산함량은 16 mol/mol 초과일수있다. 시알산함량과관련하여단위 "mol/mol" 은효소의몰당시알산잔기의몰을나타낸다. 몇몇경우에, 재조합 I2S 단백질의시알산은약 16.5 mol/mol, 약 17 mol/mol, 약 18 mol/mol, 약 19 mol/mol, 약 20 mol/mol, 약 21 mol/mol, 약 22 mol/mol 또는그초과이다. 일부구현예에서, 정제된재조합 I2S 단백질의시알산은약 mol/mol, mol/mol, 약 mol/mol, mol/mol, mol/mol, 약 mol/mol, 약 mol/mol, mol/mol, 약 mol/mol, mol/mol, mol/mol, 또는약 mol/mol 범위내에있을수있다. 약학적조성물및투여정제된재조합 I2S 단백질은공지된방법에따라헌터증후군환자에게투여될수있다. 예를들어, 정제된재조합 I2S 단백질은정맥내, 피하, 근내, 비경구적으로, 경피적으로, 또는경점막적으로 ( 예컨대, 경구적으로또는비강내로 ) 전달될수있다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 또는이를함유하는약학적조성물은정맥내투여에의해피검체에게투여된다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 또는이를함유하는약학적조성물은경막내투여에의해피검체에게투여된다. 본원에서사용되는용어 " 경막내투여 " 또는 " 경막내주입 " 은척추 ( 척수를둘러싸는경막내공간 ) 로의주입을나타낸다. 버홀 (burrhole) 또는뇌조 (cisternal), 또는요추천자 (lumbar puncture) 등을통한측뇌실주입 (lateral cerebroventricular injection) 을포함하나, 이로제한되는것은아닌여러기술이사용될수있다. 일부구현예에서, 본발명에따른 " 경막내투여 " 또는 " 경막내전달 " 은요추영역또는요추부위, 즉, 요추 IT 투여또는전달을통한 IT 투여또는전달을나타낸다. 본원에서사용되는 " 요추부위 " 또는 " 요추영역 " 은세번째요추와네번째요추사이에있는영역 ( 등아래부분 ) 을나타내며, 더욱포괄적으로는척추의 L2-S1 부위를나타낸다. 일부구현예에서, 재조합 I2S 또는이를함유하는약학적조성물은피하 ( 즉, 피부아래 ) 투여에의해피검체에게투여된다. 이를위해, 제형이주사기를통해주입될수있다. 그러나, 주사기 ( 예컨대, Inject-ease 및 Genject 주사기 ); 펜형주사기 ( 예컨대, GenPen ); 무바늘장치 ( 예컨대, MediJector 및 BioJector ); 및피하패치전달시스템과같은제형의투여를위한다른장치가이용될수있다. 일부구현예에서, 경막내투여는다른투여경로 ( 예컨대, 정맥내, 피하, 근내, 비경구적으로, 경피적으로, 또는경점막적으로 ( 예컨대, 경구적으로또는비강내로 )) 와함께사용될수있다. 본발명은본원에기술된치료적유효량의재조합 I2S 또는이를함유하는약학적조성물의단독투여및다중

23 투여를고려한다. 재조합 I2S 또는이를함유하는약학적조성물은피검체상태 ( 예컨대, 리소좀저장병 ) 의특성, 중증도및정도에기초하여일정한간격으로투여될수있다. 일부구현예에서, 치료적유효량의재조합 I2S 또는이를함유하는약학적조성물은주기적으로일정한간격 ( 예컨대, 일년마다한번, 6개월마다한번, 5 개월마다한번, 3개월마다한번, 2개월마다 (2개월마다한번 ), 매달 ( 한달에한번 ), 2주마다 (2주마다한번 ), 매주, 매일또는연속적으로 ) 으로투여될수있다. [0154] [0155] [0156] [0157] [0158] [0159] [0160] 재조합 I2S 또는이를함유하는약학적조성물은생리학적으로허용되는담체또는부형제와함께제형화되어약학적조성물을제조할수있다. 담체및치료제는멸균될수있다. 제형은투여형태에적합해야한다. 적합한약학적으로허용되는담체로는물, 염용액 ( 예컨대, NaCl), 염수, 완충된염수, 알코올, 글리세롤, 에탄올, 아라비아검 (gum arabic), 식물성오일, 벤질알코올, 폴리에틸렌글리콜, 젤라틴, 탄수화물, 예컨대, 락토즈, 아밀로즈또는전분, 당, 예컨대만니톨, 수크로즈등, 덱스트로즈, 마그네슘스테아레이트, 탈크, 규산 (silicic acid), 점성파라핀, 퍼퓸오일 (perfume oil), 지방산에스테르, 하이드록시메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈등, 및이들의조합물이포함되나, 이로제한되는것은아니다. 약학적제제는, 요망에따라활성화합물과유해하게반응하지않거나이들의활성을방해하지않는, 보조제 ( 예컨대, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 에멀젼화제, 삼투압에영향을미치는염, 완충제, 착색제, 향료 (flavoring) 및 / 또는방향물질등 ) 과혼합될수있다. 일부구현예에서, 정맥내투여에적합한수용성담체가사용된다. 또한, 상기조성물또는의약은요망에따라소량의습윤제또는에멀젼화제, 또는 ph 완충제를함유할수있다. 상기조성물은액체용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 알약, 캡슐, 서방형포뮬레이션, 또는분말일수있다. 상기조성물은또한좌약으로서통상적인결합제및담체, 예컨대트리글리세라이드로제형화될수있다. 경구제형은표준담체, 예컨대약학적등급의만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘스테아레이트, 폴리비닐피롤리돈, 소듐사카린, 셀룰로즈, 마그네슘카르보네이트등을포함할수있다. 상기조성물또는의약은인간에게투여하기에적합한약학적조성물로서통상적인절차에따라제형화될수있다. 예를들어, 일부구현예에서, 정맥내투여용조성물은전형적으로멸균된등장성수성완충제중의용액이다. 필요한경우, 조성물은또한가용화제및주사부위에서의통증을완화시키기위한국소마취제를포함할수있다. 일반적으로, 성분들은예를들어활성성분의양을표시하는샤셋 (sachette) 또는앰플 (ampule) 과같은기밀밀봉된용기에서물비함유농축물또는건조동결된분말로서단위투여형태로함께혼합되거나개별적으로공급된다. 조성물이주입에의해투여되는경우, 조성물은멸균된약학적등급의물, 염수, 덱스트로즈 / 물을함유하는주입병으로분배될수있다. 조성물이주사에의해투여되는경우, 투여전에주사용멸균수또는염수의앰플은성분들이혼합될수있도록제공될수있다. 본원에서사용되는용어 " 치료학적유효량 " 은대체적으로본발명의약학적조성물에함유된치료제의총량을기준으로하여결정된다. 일반적으로, 치료적유효량은피검체에게유의한이점 ( 예컨대, 진행되는질병또는상태의치료, 조절, 치유, 예방및 / 또는개선 ) 을달성하기에충분하다. 예를들어, 치료적유효량은요망되는치료적및 / 또는예방적효과를달성하기에충분한양, 예컨대리소좀효소수용체또는이들의활성을조절함으로써이러한리소좀저장병또는이의증상을치료 ( 예컨대본발명의조성물을피검체에게투여한후 " 제브라체 (zebra body)" 의존재또는발생, 또는세포공포화 (cellular vacuolization) 의감소또는제거 ) 하기에충분한양일수있다. 일반적으로, 치료를필요로하는피검체에게투여되는치료제 ( 예컨대, 재조합리소좀효소 ) 의양은피검체의특징에기초할것이다. 이러한특징으로는피검체의상태, 질병중증도, 일반적인건강상태, 연령, 성별, 및체중이포함된다. 당업자들은이들인자및그밖의관련된인자에기초하여적합한용량을용이하게결정할것이다. 또한, 객관적및주관적검정이최적의용량범위를확인하기위해임의로사용될수있다. 치료적유효량은통상다수의단위용량을포함할수있는투여용법 (dosing regimen) 으로투여된다. 어떠한특정치료단백질에대해, 치료적유효량 ( 및 / 또는유효투여용법내적합한단위용량 ) 은다른약학적작용제와함께예를들어, 투여경로에기초하여달라질수있다. 또한, 어떠한특정환자에대한특정치료적유효량 ( 및 / 또는단위용량 ) 은치료중인질환및질환의중증도 ; 사용되는특정약학적작용제의활성 ; 사용되는특이적조성물 ; 환자의연령, 체중, 일반적인건강상태, 성별및환자의식이 (diet); 투여시간, 투여경로, 및 / 또는사용된특정융합단백질의배설또는대사 ; 치료기간등을포함하는다양한인자및의료분야에널리공지되어있는유사한인자들에기초할수있다. 추가의예시적약학적조성물및투여방법은 PCT 공개 WO2011/163649( 발명의명칭 : " 이듀로네이트-2-설파타제의 CNS 전달을위한방법및조성물 ") 및 2012년 3월 30일자출원된가출원번호제61/618,638( 발명의명칭 : "

24 이듀로네이트 2 설파타제의피하투여 ")( 이들모두의전체교시내용은본원에참고로포함됨 ) 에기술되어 있다. [0161] 나아가, 어떠한특정피검체에대해, 특정투여용법은개개의요구및효소대체요법의투여를관할또는감 독하는전문가적개인판단에따라시간경과시조절되어야하고, 본원에서언급된그러한용량범위는단지예 시적인것이며청구되는발명의범위또는실시를제한하려는것은아닌것으로이해해야한다. [0162] 도면의간단한설명 도면을함께구성하는하기기재되는도는단지예시를위한것으로, 이로제한하는것이아니다. 도 1은무혈청배지에서생성된재조합 I2S에대한예시적정제도표를도시한다. 도 2는참조 I2S에비한정제된재조합 I2S AF의예시적펩타이드맵을도시한다. 도 3은정제된재조합 I2S AF의예시적 SDS-PAGE( 실버 ) 분석을도시한다. 도 4는이온-교환크로마토그래피에의해평가된정제된재조합 I2S AF의예시적전하프로파일분석을도시한다. 도 5는정제된재조합 I2S AF의예시적글리칸맵프로파일을도시한다. 도 6은재조합 I2S의정화된수거물의바이러스비활성화 UPB 단계후의활성 (U/mg) 의예시적분석을도시한다. 도 7은재조합 I2S의정화된수거물의바이러스비활성화 UPB 단계후의 SEC-HPLC의예시적분석을도시한다. 도 8은정제된재조합 I2S 단백질의실버염색으로처리된예시적 SDS-PAGE를도시한다. 도 9는참조에비한무혈청배양조건 ( 상부패널 ) 하에서성장한 I2S-AF 2D 세포주로부터생성된정제된재조합 I2S 효소에대한예시적펩타이드맵을도시한다. 도 10은참조에비한무혈청세포배양조건하에서성장한 I2S-AF 2D 및 4D 세포주를이용하여생성된정제된재조합 I2S 효소에대해생성된예시적글리칸프로파일을도시한다. 도 11은 I2S 참조대조군에비한무혈청세포배양조건하에서성장한 I2S-AF 2D 세포주를이용하여생성된정제된재조합 I2S 효소에대해생성된예시적전하프로파일을도시한다. [0163] [0164] [0165] [0166] [0167] 발명을실시하기위한구체적인내용실시예실시예 1: 재조합 I2S AF 포집및정제공정본실시예는무혈청배지중생산된재조합 I2S를포집하고정제하기위해단순화된다운스트림정제공정이사용될수있음을입증한다. 예시적정제도식이도 1에도시된다. 이듀로네이트-2-설파타제효소 (I2S) 및포르밀글리신생성효소 (FGE) 를안정하게발현시키는세포주가개발되었다. 예시적세포주의제조및특성화는본원과동일자로출원된미국가출원 ( 발명의명칭 : " 재조합이듀로네이트-2-설파타제를생성하기위한세포 ")( 전체교시내용은본원에참조로포함됨 ) 에기술되어있다. 간략하게, SEQ ID NO:2와표시된아미노산서열을지닌인간 I2S 단백질및 SEQ ID NO:5에표시된아미노산서열을지닌인간포르밀글리신생성효소 (FGE) 를동시발현하도록인간세포주를공학처리하였다. SEQ ID NO:

25 [0168] 전장전구체이듀로네이트 2- 설파타제 [0169] [0170] [0171] SEQ ID NO:5 전장인간 FGE 전구체 : [0172] [0173] [0174] [0175] 전장 I2S 효소의합성후, 25개아미노산신호펩타이드가제거되고, 가용성성숙 I2S 효소가세포로부터분비된다. 화학적으로규정된배지 ( 무혈청 / 동물성분비함유 ; AF) 를생물반응기공정에사용하였다. 개별수득물의부피가감소되었으며, 초여과 / 정용여과공정을통해완충제교환되었다. 비정제된벌크 (UPB) 로불리우는, 상기물질을개별수득물에대해 -50 에서동결시켰다. 다운스트림정제공정이비정제된벌크의해동및풀 (pool) 로시작되었으며, 성공적인바이러스비활성화, 음이온교환 (Capto Q), 혼합모드 ( 세라믹수산화아파타이트 ), 양이온교환 (SP 세파로스 ) 및소수성상호작용 ( 페닐세파로스 ) 크로마토그래피단계, 이후바이러스여과, 및최종농축및정용여과단계를포함하였다. 특히, 상기정제공정은 Q, 수산화아파타이트, SP 및페닐크로마토그래피방식을이용하였다. I2S 정제공정에통상적으로사용되는단백질 G 크로마토그래피및크기배제크로마토그래피는제외되었다. 예시적단계가하기표 3에제시된다

26 [0176] 표 3: 정제공정의예시적단계 [0177] [0178] 정제된 I2S 단백질을펩타이드맵핑, SDS-PAGE (Silver), 크기배제 HPLC 에의해순도를평가하였다. 효소특 이적활성, 포르밀글리신함량, 시알산함량, 글리칸맵, 전하프로파일을표준방법을이용하여측정하였다. 예시적결과를표 4 에도시한다

27 [0179] 표 4: 정제된재조합 I2S 단백질의분석 [0180] [0181] [0182] [0183] [0184] [0185] [0186] 시판되는 I2S 참조에비해예시적인펩타이드맵을도 2에도시한다. 예시적 SDS-PAGE (Silver) 분석결과를도 3에도시한다. 전형적으로, 본원에기재된공정이용시, 약제물질 (drug substance)(ds) 의 HCP 농도는 US를포함하는많은시장에서요구되는 <l00 ppm 사양을충족시키는 <100 ppm이었다. DS의 SEC는 99.5% 였는데, 이것역시많은시장에서의현행 >99.3% 마케팅사양요건을충족한다. 예시적전하프로파일을도 4에도시한다. 예시적글리칸맵을도 5에도시한다. 특히, 정제된 I2S의글리칸맵은시알산및만노오스-6-포스페이트잔기로부터유래된음전하의증가량에따라용출되며, 용출순서대로중성, 모노-시알릴레이티드, 디시알릴레이티드, 모노포스포릴레이티드, 트리시알릴레이티드및하이브리드 ( 모노시알릴레이티드및캡핑된 M6P), 테트라시알릴레이티드및하이브리드 ( 디시알릴레이티드및캡핑된 M6P) 및디포스포릴레이티드글리칸을나타내는 7개의피크그룹을포함한다. 이들모두를고려할때, 이러한실시예는단순화된네개의컬럼정제공정을이용하여동물성분비함유배지에서생산된재조합 I2S를대규모로성공적으로정제할수있음을입증한다. 실시예 2: 재조합 I2S AF의수득및바이러스비활성화안정성연구본연구의목적은재조합 I2S 정화수득물의안정성에미치는온도유지시간및동결-해동주기의효과를평가하는것이었다. 정화된수득샘플을주위및 2-8 에서 7일이하로저장하고, 바이러스비활성화된 UPB 샘플을주위에서 24시간이내로유지시켰다. 정화된수득물에대한동결-해동샘플을 -20, -50, 및 -80 에서동결시키고, 3회이하의주기로동결-해동을겪게하였다. 웨스턴블롯, SEC HPLC, 및활성검정을이용하여안정성을측정하였다. I2S-AF 수득물을 2D 세포주로부터 CCPD에의해원심분리체류장치및요망되는블리딩 (bleeding) 속도를갖는

28 B. Braun 20L 배양기를이용하여생산하였다. 온도유지연구를위해, 각각의정화된수득물을주위및 2-8 에저장하고선택된유지시간에샘플링하였다. 샘플링의양및유지시간을표 5 에나열한다. 동결 - 해동샘 플을 -20, -50, 및 -80 에유지하고수조를이용하여 25 에서해동시켰다. [0187] 표 5. 정화된수득물유지점 (hold point) 안정성 [0188] [0189] [0190] 바이러스비활성화단계는첫번째컬럼을로딩하기전에정제되지않은벌크단계에서수행했다. 정화된수득물의농축및완충제교환에의해 UPB를수행하였다. UF/DF를 Pall 1 sq. ft을이용하여수행하였다. 농축시스템및완충제를 10 mm MES, 155 mm NaCl, ph=6.5로교환하였다. 바이러스비활성화단계에 1% Tween 80 및 0.3% TnBP를첨가하고각시점에 Durapore 주사기필터를이용하여여과하였다. 샘플을표 6에나열된각시점에취하여 -80 에서동결시켰다. 정화된수득물유지점및동결-해동연구에서의샘플을웨스턴블롯및활성 (4-MU 검정 ) 에의해시험하였다. 바이러스비활성화한 UPB 샘플을 SEC HPLC에의해순도를시험하였다. 표 5에서수득물 12 및 18로부터의유지점활성결과는두개의수득물모두가주위및 2-8 에서 7일이내의저장동안아무런유의한변화가없었음을나타내었다. -20, -50, 및 -80 에서 3회이하의동결-해동주기동안저장된수득물 12의활성에서도아무런유의한변화가관찰되지않았다. 표 6. 정제되지않은벌크의바이러스비활성화 [0191] [0192] [0193] [0194] [0195] [0196] [0197] [0198] 바이러스비활성화 UPB 단계의안정성에대한활성및 SEC-HPLC을도 6 및 7에기재한다. 이것은 24시간이내에활성및순도에기반한바이러스비활성화안정성에있어서아무런문제도없었음을나타낸다. 요약하면, 본원에기재된안정성분석에기반하여, 정화된수득물은 2-8 에서 ( 예를들어, 7일이내 ) 수득물품질의유의한변화없이저장될수있다. 정화된수득물은여러번의동결-해동주기를겪을수있고안정성에서의유의한변화없이 -20, -50, 및 -80 에서저장될수있다. SEC HPLC 순도결과에기반하여, UPB 단계에서의바이러스비활성화가활성및순도에서의변화없이주위온도 ( 예컨대, 24시간이내 ) 에서일어날수있다. 실시예 3: 동물성분비함유 IL CD 배지정제및분석의확인수행본연구의목적은화학적으로규정된배지를이용하여동물성분비함유관류로생산된 I2S-AF의풀링된수득물로부터정제를수행하고약제물질를특성화하는것이었다. 본연구는 I2S-AF 정제공정성능및화학적으로규정된배지생물반응기로부터생산된약제물질 (DS) 를평가하였다. 세포배양 I2S-AF 물질을실시예 1에기재된 2S 및포르밀글리신생성효소 (FGE) 를발현하는세포주2D로부터제조하였다. 상기물질을 1L Das Gip 스핀필터배양기에서화학적으로규정된무혈청배지를이용하여 CCPD에서

29 생산하였다. 각각의정화된수득물의개별백 (bag) (HI-21) 을 -20 에서동결된채로받아서 2-8 에서밤새해동시켰다. 동일한부피의각각의정화된수득물을풀링시켜전체수득물풀을나타낸다음, 0.2μm여과시키고, 1 ft 2 의총막면적을갖는 30 kd Pall 오메타센트라메이트카세트 (Omega Centramate Cassette) 를이용하여농축시켰다. 정제되지않은벌크 (UPB) 를 0.2μm여과시키고, 사용전에동결시켰다. [0199] [0200] [0201] 정제예시적컬럼사양및로딩을표 7에기재한다. 역가에의해 3 g/l의표적을 Q 세파로스에로딩시켰다. 후속하여컬럼에이전컬럼용출액의 100% 를로딩시켰고어떠한물질도제거하지않았다. 표 7. 컬럼및로딩사양 [0202] [0203] [0204] 생물반응기로부터의풀링수득물 1 내지 21로부터의 UPB를이용하여 1회의정제런을수행하였다. UPB를 2-8 에서밤새해동시키고, 각각의수득물로부터의동일한부피에의해풀링시켰다. 개별적인컬럼공정단계및완충제제형을표 8-11에서기재하였다. 풀링된 UPB를 0.2 μm병필터시스템 (bottle filter system) 을이용하여여과하고, 1 M 소듐아세테이트를이용하여 ph 6.5로조정하고, Q 세파로스 FF 컬럼상에로딩시키기전에 5 M 염화나트륨를이용하여전도도를 16 ms/cm로조정하였다. Q 세파로스용출액을 0.25M NaPO 4, ph 5.5를이용하여 M NaPO 4 로조정하고, HA 컬럼상에로딩시키기전에 0.22 μm PES 병상부필터 (bottle top filter) 로여과시켰다. HA 용출액전도도를 5 M NaCl을이용하여 1.55 M NaCl로조정하고 ph를 1 M 소듐아세테이트를이용하여 ph 5.5로조정하였다. 조정시간은약 1 시간이었다. 조정된풀을페닐세파로스컬럼상에로딩시키기전에 0.22 μm PES 병상부필터를이용하여여과시켰다. 페닐용출액을 4회농축시키고 0.02 M NaP0 4, M NaCl, ph 6.0으로 6회정용여과하였다. 정용여과된생성물을 2.0 g/l로조정하고모의약제물질를생성하기위해 0.2% 폴리소르베이트 20과함께제형화시켰다. DS의 H1-20의모의풀을추가특성화를위해생성하였다. [0205] 표 8. Q 세파로스 FF 크로마토그래피의예시적인공정상세설명 [0206]

30 [0207] 표 9. HA 크로마토그래피의예시적인공정상세설명 [0208] [0209] 표 10. 페닐세파로스크로마토그래피에대한예시적인공정상세설명 [0210] [0211] 표 11. 페닐용출풀의예시적인정용여과 [0212] [0213] [0214] [0215] ELISA에의한 HCP에의한인프로세스 (In Process) 순도표 12는각각의단계에대한인-프로세스 HOP 제거를기재한다. 인-프로세스 HCP 결과는 HA 단계에서대부분의제거를나타내며높았다. 표 12. 인-프로세스 HCP 제거 [0216] [0217] [0218] 약제물질특성화예시적약제물질로트방출결과를표 13에나열한다. 보이는바와같이, 약제물질는정제된재료에서높은특이적활성및 %FG를가졌다. 예시적약물속성특성화를표 13에도시한다. 최종 UF/DF 단계에서 HCP가 1,870 ng/mg에서 372 ng/mg으로감소하였다

31 [0219] 표 13. 예시적약제물질로트방출 (lot release) [0220] [0221] [0222] [0223] [0224] [0225] [0226] [0227] [0228] 실시예 4. 정제된재조합 I2S 효소의물리화학적및생물학적특성화본실시예의목적은상기기재된방법을이용하여정제된재조합 I2S 단백질의상세한특성화를수행하는것이었다. SDS-PAGE 실험을위해, 두개의분리된무혈청세포배양반응으로 2D 및 4D 인간세포주를이용하여재조합 I2S 단백질을생성하였다. 상기기재된방법을이용하여샘플을수집하고정제시켰다. 정제된 I2S 효소를 SDS-PAGE에의해분석하고, 가시화를위해은염색으로처리하였다. 예시적결과를도 8에도시한다. 도 8에서볼수있는바와같이, 본원에기재된방법을이용하여정제된재조합 I2S 단백질은표준방법을이용하여정제된 I2S 참조샘플과유사한밴딩패턴을나타낸다. 펩타이드맵 I2S-AF 2D 세포주에의해생산된재조합 I2S 단백질을상기기재된방법을이용하여정제시켰다. 정제된재조합 I2S 및참조인간 I2S의샘플을각각단백질분해시키고, HPLC 분석에의해조사하였다. 참조 I2S와비교한예시적펩타이드맵을도 9에도시한다. 포르밀글리신전환퍼센트펩타이드맵핑을이용하여 FGly 전환퍼센트를측정하였다. I2S 활성화는하기도시된바와같이포르밀글리신생성효소 (FGE) 에의한시스테인 ( 성숙인간 I2S의 59번위치에상응함 ) 의포르밀글리신으로의전환을필요로한다 : [0229]

32 [0230] 따라서, 포르밀글리신전환율 (%FG) 은하기식을이용하여계산될수있다 : [0231] [0232] [0233] [0234] [0235] [0236] 예를들어, 50% FG는정제된재조합 I2S의반이어떠한치료적효과없이효소적으로비활성인것을의미한다. 펩타이드맵핑을이용하여 %FG를계산하였다. 간략하게, 정제된재조합 I2S 단백질을프로테아제 ( 예컨대, 트립신또는키모트립신 ) 를이용하여짧은펩타이드로분해시켰다. 짧은펩타이드를분리시키고, HPLC를이용하여특성화하였다. 성숙인간 I2S의 59번위치에상응하는위치를함유하는펩타이드는 59번위치의 Cys가대조군 ( 예컨대, FGly 전환이없는 I2S 단백질또는 100% FGly 전환된 I2S 단백질 ) 과비교하여 FGly로전환되었는지를결정하였다. FGly를함유하는펩타이드의양 ( 활성 I2S 분자의수에상응함 ) 및 FGly와 Cys 둘모두를갖는펩타이드의총양 ( 총 I2S 분자의수에상응함 ) 을상응하는피크면적에기반하여측정할수있으며, %FG를반영하는비율을계산하였다. 예시적결과를표 14에도시한다. 글리칸맵-만노스-6-포스페이트및시알산함량정제된재조합 I2S 단백질의글리칸및시알산조성을결정하였다. 글리칸맵을생성하는음이온교환크로마토그래피를이용하여글리칸조성물의정량을수행하였다. 하기기재된대로, 본원에기재된조건하에정제된재조합 I2S의글리칸맵은효소적분해로부터초래된시알산및만노스-6-포스페이트당형태로부터적어도부분적으로유래된음전하의증가량에따라용출되는 7개의피크그룹으로구성된다. 간략하게, 무혈청세포배양 (I2S-AF 2D 무혈청및 I2S-AF 4D 무혈청 ) 으로부터의정제된재조합 I2S 및참조재조합 I2S를, 시알산잔기의제거를위해 (1) 정제된뉴라미니다제효소 ( 아르트로박터우레아파시엔스 (Arthrobacter Ureafaciens) 로부터분리된 (10 mu/μl), Roche Biochemical (Indianapolis, IN), Cat. # (1U/100μL)), (2) 만노스-6-포스페이트잔기의완전한제거를위해 2시간동안 37±1에서알칼린포스파타제, (3) 알칼린포스파타제 + 뉴라미니다제중어느하나로처리하거나, (4) 처리하지않았다. 각각의효소적분해물을 Dionex CarboPac PA1 Guard 컬럼이장착된 CarboPac PA1 분석컬럼을이용하여펄스형암페로메트리검출법 (HPAE-PAD) 과함께고성능음이온교환크로마토그래피에의해분석하였다. 0.4 내지 2.0 nmole 범위의일련의시알산및만노스-6-포스페이트표준을각각의검정을위해진행시켰다. 100 mm 수산화나트륨에서 48 mm 소듐아세테이트를이용한동용매방법을최소 15분간 1.0 ml/ 분의유속으로주위컬럼온도에서진행시켜각각의피크를용출시켰다. I2S-AF 및참조 I2S 샘플둘모두에대해, 각각의개별적인런으로부터생성된데이터를단일크로마토그래피로각각조합시켜각각의개별적인재조합단백질에대한글리칸맵을나타내었다. 도 10에나타낸대로, 무혈청배지로부터정제된 I2S에대한글리칸맵은중성, 모노-시알릴레이티드, 디시알릴레이티드, 모노포스포릴레이티드, 트리시알릴레이티드및하이브리드 ( 모노시알릴레이티드및캡핑된만노스-6-포스페이트 ) 및디포스포릴레이티드글리칸을구성하는대표적인용출피크 ( 용출순서대로 ) 를나타내었다. 예시적글리캅맵을도 10에도시한다. 각각의재조합 I2S 샘플중평균시알산함량 ( 단백질 1몰에대한시알산의몰 ) 을시알산표준의선형회귀분석으로부터계산하였다. PeakNet 6 소프트웨어를이용하여각각의크로마토그램수행을가시화하였다. 시알산표준및재조합 I2S 검정대조군과시험샘플로부터방출된시알산이단일피크로보인다. I2S에대한시알산의양 (nmole) 을하기방정식을이용하여원시값 (raw value) 으로서계산하였다 : [0237] [0238] [0239] 상기에서, C 는샘플또는재조합 I2S 검정대조군의단백질농도 (mg/ml) 이다. 각각의시험샘플에대해하기식을이용하여단백질 1 몰에대한시알산의몰로서시알산의교정값을계산하였 다 : [0240] [0241] I2S-AF 2D 또는 4D 세포주로부터정제된재조합 I2S 에대한시알산함량을나타내는예시적데이터를표 14 에

33 도시한다. [0242] 표 14: 무혈청세포배양액으로부터정제된 I2S 의예시적인특성 [0243] [0244] [0245] [0246] [0247] [0248] [0249] 특이적활성본원에기재된방법을이용하여정제된재조합 I2S 효소의특이적활성을시험관내설페이트방출검정또는 4- MUF 검정을이용하여분석하였다. 시험관내설페이트방출검정헤파린디사카라이드를기질로서이용하여시험관내설페이트방출활성검정을수행하였다. 특히, 이러한검정은천연유래된기질인헤파린디사카라이드로부터설페이트이온을방출시키는 I2S의성능을측정하는것이다. 방출된설페이트를전도도검출기가장착된이온크로마토그래피에의해정량할수있다. 간략하게, 샘플을먼저 10 mm Na 아세테이트, ph 6으로완충제교환시켜제형완충제중포스페이트이온에의한억제를제한하였다. 그후, 샘플을반응완충제 (10 mm Na 아세테이트, ph 4.4) 를이용하여 mg/ml로희석시키고, 30 μl의반응부피에서 0.3 μg I2S/100 μg기질의효소대기질비로헤파린디사카라이드와함께 37 에서 2 시간동안인큐베이션시켰다. 그후, 샘플을 100 에서 3분간가열시켜반응을중단시켰다. IonPac AG18 guard 컬럼이구비된 Dionex IonPac AS18 분석컬럼을이용하여분석을수행하였다. 1.0 ml/ 분의 30 mm 수산화칼륨를이용하여 15분간동용매방법을이용하였다. I2S 샘플에의해방출된설페이트의양을 1.7 내지 16.0 nmole 범위의설페이트표준의선형회귀분석으로부터계산하였다. 기록가능한값을단백질 1mg에대한유닛으로표시하였고, 여기서 1 유닛은시간당방출된 1 μmole의설페이트로서정의되며단백질농도는 A280 측정으로결정하였다. 예시적결과를표 14에도시한다. 4-MUF 검정정제된재조합 I2S 효소의특이적활성은또한형광성기반 4-MUF 검정을이용하여분석할수있다. 간략하게, 검정은 I2S 기질인 4-메틸움벨리페릴-설페이트 (4-MUF-SO 4 ) 의가수분해를측정하는것이다. I2S에의한 4-MUF- SO 4 기질의절단시에, 분자는설페이트및천연형광 4- 메틸움벨리페론 (4-MUF) 으로전환된다. 결과적으로, 시

34 간경과에따른형광신호에서의전체적인변화를평가함에의해 I2S 효소활성을측정할수있다. 이러한실험을위해, 정제된 I2S 효소를 4-메틸움벨리페릴-설페이트 (4-MUF-SO 4 ), 포타슘염 (Sigma Cat. # M-7133) 의용액과함께인큐베이션하였다. 일련의대조군참조샘플을이용하고, 원액의 1:100, 1:200 및 1:20,000으로희석된시판되는 I2S 효소를이용하여검정의교정을수행하였다. 효소적검정을 37 에서진행시키고교정된형광측정기를이용하여검정하였다. 각각의참조표준에대해수득된형광값을이용하여, 편차계수퍼센트를하기방정식을이용하여결정하였다 : [0250] [0251] 그후, CV 퍼센트값을이용하여각각의샘플에대한교정된평균형광성을계산함으로써, 하기방정식을이용 하여 mu/ml 로서표시된, 기록가능한효소활성을결정하였다 : [0252] [0253] [0254] [0255] [0256] [0257] CFU = 네거티브교정된평균형광성 DF - 희석률 1 밀리유닛의활성은 37 에서 1분동안 1 나노몰의 4-메틸움벨리페릴-설페이트를 4-메틸움벨리페론으로전환시키는데필요한효소의양이다. 전하프로파일상기실험을위해, 각각의정제된재조합 I2S의전하분포를고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 시스템과함께, 강한음이온교환 (SAX) 크로마토그래피로측정하였다. 상기방법은표면전하차이에기반하여, 샘플내에서재조합 I2S 변이체를분리시킨다. ph 8.00에서, 음으로하전된종들은 SAX 컬럼에고정된양전하상에흡착한다. 증가하는이온강도의구배를이용하여컬럼과의이온성상호작용의강도에비례하여각각의단백질종들을용출시킨다. 무혈청성장조건하에 2D 세포주로부터분리된, 100 마이크로그램의정제된 I2S 또는참조재조합 I2S 효소를주위온도로유지된 Amersham Biosciences Mini Q PE (4.6 x 50 mm) 컬럼상에로딩시키고 20 mm Tris-HC1, ph 8.00로평형화시켰다. 20 mm Tris-HC1, 1.0 M 염화나트륨, ph 8.00의이동상을이용하여 0.80 ml/ 분의유속으로구배용출시켰다. 샘플용출액의흡광도를 280 nm 파장에서측정하므로써, 주행동안에단백질농도를계속하여측정하였다. 2D 및 4D 세포주로부터정제된재조합 I2S에대해관찰된전하프로파일을나타내는예시적인결과를도 11에도시한다

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