(72) 발명자백상훈경기도용인시기흥구이현로30번길 107 박유창경기도용인시기흥구이현로30번길 107 서진욱경기도용인시기흥구이현로30번길 107 최용운경기도용인시기흥구이현로30번길 107 손종문경기도용인시기흥구이현로30번길 107 김용철경기도용인시기흥구이현로30번길 10

Transcription

1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2012 년 07 월 03 일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2012년06월15일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 38/46 ( ) A61K 38/17 ( ) A61P 31/12 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2012 년 02 월 08 일 심사청구일자 (30) 우선권주장 2012 년 02 월 08 일 61/500, 년 06 월 24 일미국 (US) (56) 선행기술조사문헌 Molecular Genetics and Metabolism 90 ( ) pp Yonsei Med J. Vol52, No2 (2011.3) page 재조합 CHO 세포무혈청현탁배양에의한헌터증후군효소치료제 Iduronate 2-sulphatase 의생산성향상에관한연구, 강원대학교학위논문, 2008, 이보라. KR A (73) 특허권자 주식회사지씨바이오 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 ( 보정동 ) 주식회사녹십자 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 ( 보정동 ) (72) 발명자 진동규 서울특별시강남구언주로 30 길 57 삼성타워팰리스 E 동 3806 호 정요경 경기도용인시기흥구이현로 30 번길 107 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 박창희, 김종관, 권오식 전체청구항수 : 총 6 항심사관 : 손영희 (54) 발명의명칭재조합인간이듀로네이트 -2- 설파타아제를포함하는조성물, 제제및이의제조방법 (57) 요약 본발명의이듀로네이트 -2- 설파타아제 (IDS) 는종래알려진엘라프라제와다른당화패턴및포르밀글리신함량을가지며, 효소활성및안전성이우수하므로, 헌터증후군의치료에효과적으로사용할수있다. 대표도 - 도 3-1 -

2 (72) 발명자백상훈경기도용인시기흥구이현로30번길 107 박유창경기도용인시기흥구이현로30번길 107 서진욱경기도용인시기흥구이현로30번길 107 최용운경기도용인시기흥구이현로30번길 107 손종문경기도용인시기흥구이현로30번길 107 김용철경기도용인시기흥구이현로30번길 107 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 A 부처명 보건복지부 연구사업명 보건의료연구개발사업 연구과제명 헌터증후군효소치료제 IDS의임상1/2상연구 주관기관 ( 주 ) 녹십자 연구기간 ~

3 특허청구의범위청구항 1 서열번호 1로표시된아미노산서열을가지는 IDS를유효성분으로포함하며, 상기서열번호 1의아미노산서열을가지는 IDS의 59번위치의시스테인이포르밀글리신 (FGly) 으로변경된비율이몰비로 65% 이상임을특징으로하는헌터증후군치료용조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 서열번호 1로표시된아미노산서열을가지는 IDS의 59번째시스테인이포르밀글리신으로변경된비율이몰비로 75% 이상임을특징으로하는헌터증후군치료용조성물. 청구항 3 제1항에있어서, 서열번호 1로표시된아미노산서열을가지는 IDS 1몰당 2.0 내지 4.0몰의만노스-6-포스페이트 (M6P) 를포함하는것을특징으로하는헌터증후군치료용조성물. 청구항 4 제3항에있어서, 서열번호 1로표시된아미노산서열을가지는 IDS 1몰당 2.5 내지 3.0몰의만노스-6-포스페이트를포함하는것을특징으로하는헌터증후군치료용조성물. 청구항 5 제1항내지제4항중어느한항에따른조성물을포함하는헌터증후군치료용제제. 청구항 6 제5항에있어서, 약학적으로허용되는담체 ; 및완충제, 카보하이트레이트, 안정화제, 항산화제, 정균제, 킬레이트화제, 아쥬반트, 현탁제, 농후제및보존제로구성된군에서선택된하나이상의물질 ; 을포함하는것을특징으로하는제제. 청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 삭제청구항 10 삭제청구항

4 삭제청구항 12 삭제청구항 13 삭제청구항 14 삭제청구항 15 삭제청구항 16 삭제 명세서 [0001] [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 기술분야본발명은재조합인간이듀로네이트-2-설파타아제 (Iduronate-2-sulfatase, 이하 "IDS" 라함 ) 를포함하는헌터증후군치료용조성물, 제제및이의제조방법에관한것이다. 구체적으로본발명에따른헌터증후군치료용조성물은서열번호 1로표시된아미노산서열을가지는 IDS를유효성분으로포함하며, 서열번호 1의아미노산서열을가지는 IDS의 59번위치의시스테인이포르밀글리신 (Formylglycine(FGly), 2-amino-3-oxopropionic acid) 으로변경된비율이몰비로 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱바람직하게는 80% 이상임을특징으로한다. 또한, 본발명에따른헌터증후군치료용조성물에포함된 IDS는 IDS 1몰당 2.0 내지 4.0몰, 바림직하게는 2.3 내지 3.5몰, 더욱바람직하게는 2.5 내지 3.0 몰의만노스-6-포스페이트 (mannose-6-phosphate) 를가진다. 본발명에따른헌터증후군치료용조성물의제조방법은 (1) 서열번호 1로표시되는 IDS를인코딩하는유전자로형질전환된유전자재조합세포주를배양하여배양액을수득하는단계 ; (2) 상기배양액을음이온교환크로마토그래피, 소수성크로마토그래피, 양이온교환크로마토그래피, 및친화성크로마토그래피과정을통해정제하는단계 ; 를포함하는것을특징으로하며, 특히, 상기배양공정에서첨가물로가수분해산물 (Hydrolysate) 첨가와상기양이온교환크로마토그래피가 ph 4.0 내지 6.0의완충용액을용출을위해사용하여수행되는것을특징으로한다. 본발명에따른 IDS를포함하는치료용조성물및이를포함하는제제는기존에시판중인제품에비해높은안전성 (safety) 및치료효능을가지고있어헌터증후군의치료제로서매우유용하게사용될수있다. [0009] 배경기술헌터증후군또는제2형점액다당질증 (Mucosaccharidosis type II) 은 IDS의결핍으로인해글리코스아미노글리칸 (Glycosaminoglycan, GAG) 과같은뮤코다당체가분해되지못하여리소좀내에축적되는리소좀축적질환 (Lysosomal storage diseases, LSD) 중하나이다. GAG는신체의모든세포내에축적되어여러가지증상을초래하는데, 그러한증상에는두드러진얼굴모습, 큰머리, 간이나비장의비대로인한복부팽만등이포함되며, 청력상실, 심장판막질환, 폐쇄성호흡기질환, 수면무호흡등도동반. 또한, 관절운동에도제한이올수있으며중추신경계의침범으로신경계증상과발달지연이초래될수있다. 헌터증후군은 162,000명당 1 명꼴로발생하는것으로알려져있으며, X 염색체와연관된열성 (X-linked recessive) 양식으로유전되어환 - 4 -

5 자뿐만아니라가족에게큰고통을주고있다. [0010] [0011] 지금까지헌터증후군을치료하기위하여, 골수이식방법, 효소보충방법및유전자요법등이다양하게시도되어왔다. 골수이식방법은증상은현저히개선되지만환자와조직적합항원 (HLA, human leukocyte antigen) 이맞는대상을구하기어렵고, HLA 부적합공여자의수술전후의사망률이높은단점이있다. 유전자요법은정상적인 IDS 유전자를아데노바이러스나레트로바이러스등의바이러스또는비바이러스성벡터를이용하여체내로주입하는방법으로, 현재실험적인수준에머물고있을뿐, 임상적으로사용되고있지는못하다. 효소보충방법은외부에서생산된 IDS를체내에투여하는방법으로, 투여방법이간단한장점이있지만지속적으로효소를투여해야하므로치료비용이많이소요되는단점이있으며, 현재재조합기술에생산되어미국 FDA의승인을받엘라프라제 (Elaprase ; Shire Pharmaceuticals Group) 가시판중에있으나, 단가가매우비싸고, 효과및안전성이낮은단점이있다. 이상살핀바와같이다양한헌터증후군치료방법이개발되어왔지만, 여전히높은치료효능및안전성을가지는헌터증후군의새로운치료제및치료방법에대한수요는절실한상황이다. 선행기술문헌 [0012] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) Bielicki, J. et al. Biochem, J., 271: 75~86, 1990 발명의내용 [0013] [0014] 해결하려는과제본발명의목적은상기와같은문제점을해결하고자, IDS 생산을위한배양및정제공정을획기적으로개선함으로써높은치료효능및안전성을갖는재조합 IDS를포함하는헌터증후군치료용조성물및이를포함하는제제를제공하는것이다. 또한, 본발명의다른목적은상기재조합 IDS를포함하는헌터증후군치료용조성물및이를포함하는제제의제조방법을제공하는것이다. [0015] [0016] [0017] [0018] 과제의해결수단본발명에따른재조합 IDS를포함하는헌터증후군치료용조성물은, 서열번호 1로표시된아미노산서열을가지는 IDS를유효성분으로포함하며, 서열번호 1의아미노산서열을가지는 IDS의 59번위치의시스테인이포르밀글리신 (Formylglycine(FGly)) 으로변경된비율이몰비로 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱바람직하게는 80% 이상임을특징으로한다. 본발명에서의 IDS는이듀로네이트-2-설파타아제 (Iduronate-2-sulfatase) 또는 I2S로지칭되기도하며, 인체의간, 신장, 태반에서분리정제된 IDS는분자크기 (molecular size) 가 56 kda 정도이며 (Bielicki, J. et al. (1990) Biochem, J., 271: 75~86), 25개아미노산을가지는신호펩타이드 (signal peptide) 를포함하는 550개의아미노산으로구성된단량체단백질로발현된후, 신호펩타이드가절단된 525개의아미노산으로변경되어활성을나타내게된다. IDS는당화 (glycosylation) 정도에따라그분자크기가달라지게되는데, 엔도글리코시다제 F(endoglycosidase F) 처리를할경우, SDS-PAGE를이용하면 60~90 kda 정도의크기를가지는것으로밝혀졌다. IDS는두개의이황화결합및 8개의 N-결합된당화부위를갖는데, 진핵생물에서 IDS를생산하는과정에서번역이후수식과정 (post translational modification) 을거치면서상기당화부위에복합체 (complex), 하이브리드 (hybrid) 또는고만노스 (high mannose) 형태의올리고당사슬이결합하여당단백질 (glycoprotein) 형태로생성된다. 배양과정중에배양액내에분비된 IDS는통상적인분리정제과정을거쳐약물로사용될수있으며, IDS는다양한인자, 예를들어, IDS 유전자재조합방법, 형질전환방법 ( 예컨대, 사용된세포주 ), 배양방법및정제방법등에따라다양한당화패턴을갖는 IDS 당단백질을포함할수있다. 본발명을통해 IDS 내만노스-6-포스페이트 (M6P) 의함량및 59번째시스테인의포르밀글리신으로의변경비율이 IDS의치료효능및안전성등의특성에큰영향을미치는것으로확인되었는데, 이는만노스-6-포스페이 - 5 -

6 트 (M6P) 는 IDS 로하여금세포표면의 M6P 수용체에특이적으로결합할수있게하여, 상기효소의세포내로 의도입, 리소좀타겟팅및이로인한축적된 GAG 의분해에도움을주며, 59 번째시스테인이포르밀글리신으 로변경되면 IDS 의효소활성을높이기때문인것으로보인다. [0019] [0020] 본발명에서의 IDS는별도의한정이없다면당이결합된, 즉당화된 IDS 당단백질을의미하며, 본발명에서의 IDS는서열번호 1의아미노산서열을갖는것이바람직하지만, 이에특별히한정되는것은아니며, 본발명에서목적하는 IDS의활성을유지하는한, 서열번호 1의아미노산서열에서일부아미노산잔기의삽입, 결실및치환이일어난아미노산서열을갖는경우도본발명의권리범위에포함됨은본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자 ( 이하 ' 통상의기술자 ' 라한다 ) 에게는자명한것이다. 본발명에서의 IDS " 당화패턴 " 은생성된 IDS 내의 8개의당화위치에결합된올리고당의프로파일 ( 예를들어, 당화위치및결합된올리고당종류 ) 을의미한다. [0021] [0022] [0023] 본발명에따른헌터증후군치료용조성물에함유된 IDS는종래알려진 IDS와동일한아미노산서열 ( 서열번호 1) 을가지나, 상기설명한바와같이당화패턴이상이하며 59번째시스테인이포르밀글리신으로변경된비율역시상이한것을특징으로한다 ( 실시예 <1-5> 및 <1-6> 참조 ). 즉, 본발명에따른헌터증후군치료용조성물에함유된 IDS는서열번호 1의아미노산서열을가지는 IDS의 59번위치의시스테인이포르밀글리신 (FGly) 으로변경된비율이몰비로 65% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱바람직하게는 80% 이상임을특징으로하는반면, 종래시판중인엘라프라제에서의포르밀글리신으로의변경비율은약 50% 정도로알려져있다 (Genet Med 2006:8(8): ). 포르밀글리신은 IDS의기질분해능력, 즉 IDS의활성에깊이관여하므로, 상기와같은본발명에따른치료용제제와엘라프라제의 IDS 내 59 번위치에서의포르밀글리신변경비율차이로인해본발명에따른치료용조성물및이를포함하는제제는기존의엘라프라제에비해높은헌터증후군에대한치료효능을나타낸다. 또한, 본발명에따른헌터증후군치료용조성물또는제제에포함된 IDS는 IDS 1몰당 2.0 내지 4.0몰, 바림직하게는 2.3 내지 3.5몰, 더욱바람직하게는 2.5 내지 3.0몰의만노스-6-포스페이트 (mannose-6- phosphate) 를가진다. M6P는 IDS의세포내로흡수및리소좀타겟팅에기여하므로, IDS 내 M6P 함량이높은본발명에따른치료용제제는 IDS의세포내흡수및리소좀타겟능력이우수하여궁극적으로리소좀내에축적된 GAG를효과적으로분해할수있는것으로확인되었다. [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] 본발명에따른 IDS를포함하는헌터증후군치료용제제는본발명에따른치료용조성물을약학적으로허용되는담체와함께적합한형태로제형화시킴으로써제공될수있다. " 약학적으로허용되는 " 담체란생리학적으로허용되고인간에게투여하였을때, 통상적으로위장장애, 현기증등과같은알레르기반응또는이와유사한반응을일으키지않는비독성의물질을말한다. 한편, 본발명에따른제제는투여경로에따라적합한담체와함께제형화될수있다. 상기본발명에따른제제는경구적또는비경구적으로투여될수있으나이에한정되지는않는다. 비경구적투여경로로는예를들면, 경피, 비강, 복강, 근육, 피하또는정맥등의여러경로중에적합한형태가사용될수있다. 본발명의제제를경구투여하는경우본발명의제제는적합한경구투여용담체와함께당업계에공지된방법에따라분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼등의형태로제형화될수있다. 적합한담체의예로는락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨및말티톨등을포함하는당류와옥수수전분, 밀전분, 쌀전분및감자전분등을포함하는전분류, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 나트륨카르복시메틸셀룰로오즈및하이드록시프로필메틸-셀룰로즈등을포함하는셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈등과같은충전제가포함될수있다. 또한, 경우에따라가교결합폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산또는나트륨알기네이트등을붕해제로첨가될수있다. 나아가, 상기제제는항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제및방부제등을추가로포함될수있다. 또한, 비경구적으로투여하는경우본발명에따른제제는적합한비경구용담체와함께주사제, 경피투여제및비강흡입제의형태로당업계에공지된방법에따라제형화될수있다. 상기주사제의경우에는반드시멸균되어야하며박테리아및진균과같은미생물의오염으로부터보호되어야한다. 주사제의경우적합한담체의예로는이에한정되지는않으나, 물, 에탄올, 폴리올 ( 예를들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜및액체폴리 - 6 -

7 에틸렌글리콜등 ), 이들의혼합물및 / 또는식물유를포함하는용매또는분산매질일수있다. 보다바람직하게는, 적합한담체로는행크스용액, 링거용액, 트리에탄올아민이함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는주사용멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌글리콜및 5% 덱스트로즈와같은등장용액등이사용될수있다. 상기주사제를미생물오염으로부터보호하기위해서는파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살등과같은다양한항균제및항진균제가추가로포함될수있다. 또한, 상기주사제는대부분의경우당또는나트륨클로라이드와같은등장화제가추가로포함될수있다. 이들제형은제약화학에일반적으로공지된처방서인문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania) 에기술되어있다. 흡입투여제의경우, 본발명에따라사용되는제제를적합한추진제, 예를들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소또는다른적합한기체를사용하여, 가압팩또는연무기로부터에어로졸스프레이형태로편리하게전달할수있다. 가압에어로졸의경우, 투약단위는계량된양을전달하는밸브를제공하여결정할수있다. 예를들면, 흡입기또는취입기에사용되는젤라틴캡슐및카트리지는화합물, 및락토즈또는전분과같은적합한분말기제의분말혼합물을함유하도록제형화할수있다. [0029] [0030] [0031] 그밖의약학적으로허용되는담체로는다음의문헌에기재되어있는것을참고로할수있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 또한, 본발명에따른제제는하나이상의완충제 ( 예를들어, 식염수또는 PBS), 카보하이트레이트 ( 예를들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈또는덱스트란 ), 안정화제 ( 아황산수소나트륨, 아황산나트륨또는아스코르브산 ) 항산화제, 정균제, 킬레이트화제 ( 예를들어, EDTA 또는글루타치온 ), 아쥬반트 ( 예를들어, 알루미늄하이드록사이드 ), 현탁제, 농후제및 / 또는보존제 ( 벤즈알코늄클로라이드, 메틸- 또는프로필-파라벤및클로로부탄올 ) 가추가로포함될수있다. 또한, 본발명의제제는포유동물에투여된후활성성분의신속, 지속또는지연된방출을제공할수있도록당업계에공지된방법을사용하여제형화될수있다. 상기와같은방법으로제형화된제제는유효량으로경구, 경피, 피하, 정맥또는근육을포함한여러경로를통해투여될수있다. 본발명에서 ' 유효량 ' 이란환자에게투여하였을때, 진단또는치료효과의추적을가능하게하는 IDS의양을말한다. 본발명에따른제제의투여량은투여경로, 투여대상, 대상질환및이의중증정도, 연령, 성별체중, 개인차및질병상태에따라적절히선택될수있다. 바람직하게는, 본발명의 IDS를포함하는제제는질환의정도에따라유효성분의함량을달리할수있으나, 통상적으로 1회투여시 0.1 내지 10 mg /kg, 바람직하게는 0.5 내지 1.0 mg /kg 의유효용량으로투여될수있다. [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] 본발명에따른치료용조성물의제조방법은 (1) 서열번호 1로표시되는 IDS를인코딩하는유전자로형질전환된유전자재조합세포주를배양하여배양액을수득하는단계 ; (2) 상기배양액을음이온교환크로마토그래피, 소수성크로마토그래피, 양이온교환크로마토그래피, 및친화성크로마토그래피과정을통해정제하는단계 ; 를포함하는것을특징으로하며, 특히, 상기배양공정에서첨가물로가수분해산물 (Hydrolysate) 첨가와상기양이온교환크로마토그래피가 ph 4.0 내지 6.0의완충용액을용출을위해사용하여수행되는것을특징으로한다. [0037] [0038] [0039] [0040] 보다구체적으로본발명에따른치료용조성물의제조방법은 (1) IDS를인코딩하는유전자를포함하는발현벡터로숙주세포를형질전환시켜유전자재조합세포주를수득하는단계 ; (2) 상기형질전환된유전자재조합세포주를무혈청배지에서가수분해산물을첨가시켜배양하여배양액을수득하는단계 ; (3) 상기배양액을음이온교환크로마토그래피, 소수성크로마토그래피, 양이온교환크로마토그래피, 및친화성크로마토그래피과정을통해정제하며, 상기양이온교환크로마토그래피를 ph 4.0 내지 6.0의용출완 - 7 -

8 충용액을이용하여수행하는단계 ; 및 [0041] [0042] 4) 상기정제된 IDS 에약학적으로허용가능한담체를혼합하는단계 ; 를포함한다. [0043] [0044] 상기방법중단계 (1) 은 IDS를인코딩하는유전자를포함하는발현벡터로숙주세포를형질전환시켜유전자재조합세포주를수득하는단계이다. IDS의아미노산서열및이를인코딩하는유전자서열은당업계에공지되어있는데, 서열번호 1의아미노산서열을갖는 IDS를인코딩하는유전자를이용하는것이바람직하지만, 이에한정되는것은아니며, 서열번호 1의아미노산서열에서일부아미노산잔기가삽입, 결실또는치환된경우라도 IDS의활성을유지하며본발명의목적에부합하는한제한없이이를인코딩하는유전자서열을이용하는것도가능하다. 또한, 상기유전자를포함하는발현벡터는당업계에알려진통상적인방법을이용하여제조할수있다. 상기발현벡터는벡터의도입을확인할수있는마커유전자를포함할수있으며, 상기마커유전자의예로는디하이드로폴레이트환원효소 (dihydrofolate reductase) 유전자 (dhfr) 등을들수있으며, pjk-dhfr-or2-ids 벡터 ( 도 2 참조 ) 를사용하는것이바람직하지만, 이에한정되는것은아니다. 한편, 상기단계 (1) 에사용될수있는숙주세포의예로는차이니즈햄스터난소세포 (CHO), 인간배아신장세포 (HEK), 유아햄스터신장세포 (BHK), 원숭이신장세포7(COS7 : monkey kidney cells) 세포, NSO 세포등동물유래세포를들수있으나, 이에제한되는것은아니며, 바람직하게는 CHO 세포를사용할수있다. CHO 세포주는높은세포성장속도및생산성을나타내며, 유전자조작이용이하고, 대규모현탁배양에서증식이용이하며, 무단백 (protein free) 배지에적응성이뛰어나, 바이오의약품생산에가장널리사용하고있는세포주중하나이다. 상기단계 (1) 에서의형질전환과정은당업계에통상적으로알려진방법에따라수행할수있다. [0045] [0046] 상기방법중단계 (2) 는 IDS 발현벡터로형질전환된유전자재조합세포주를무혈청배지에서배양하여배양액을수득하는단계이다. 상기배양은숙주세포의종류에따라당업계에최적화된배지및조건을사용하여수행될수있다. 상기배양시무혈청 (serum free) 배지를사용하는것이바람직한데무혈청배지는동물유래혈청 ( 예컨대, 소혈청등 ) 이포함되어있지않아, 상기혈청으로인한부작용또는위험성의가능성을낮출수있다. 하나의실시양태에있어서, IDS 발현벡터로형질전환된유전자재조합세포주는대량생산을위해점진적으로부피를늘려가면서배양시킬수있다. 예를들어, 본발명의유전자재조합세포주는쉐이커플라스크에서배양시킨후, 수백 ~ 수천 L 규모의생물배양기를이용하여배양시킬수있다. 상기배양공정중가수분해산물첨가물이포르밀글리신함량에중요하다. 바람직한가수분해산물의첨가농도는최종배양기내에서 0.1 ~ 10.0 g/l 이다. 본발명에서가수분해산물은동물또는식물유래물질을통상적인방법에의해가수분해시킨것이이용될수있으며, 보다구체적으로는대두 (soybean), 감자 (patato), 맥아 (wheatgerm) 및효모 (yeast) 유래물질을포함하는군에서선택된 1 종이상을가수분해시킨것등이이용될수있지만, 이에제한되는것은아니다. [0047] [0048] [0049] [0050] 상기방법중단계 (3) 은단계 (2) 에서얻은배양액으로부터음이온교환크로마토그래피, 소수성크로마토그래피, 양이온교환크로마토그래피, 및친화성크로마토그래피과정을통해 IDS를정제하는단계이다. 상기 4가지크로마토그래피는상기제시된순서대로수행하는것이바람직하나, 필요에따라그순서를변경하여사용할수있음은본발명이속하는기술분야에서통상의기술자에게는자명한것이다. 크로마토그래피의순서와더불어목적하는성분을용출시키기위해사용된레진및용출완충용액의 ph가본발명의 IDS의당화패턴및포르밀글리신함량에중요하다. 음이온교환크로마토그래피는배양액내에존재하는색소와여러가지종류의불순물을제거하기위해수행하는것으로서, Q 세파로오스레진을충진시킨컬럼으로부터 ph 5.5 내지 7.5의용출완충용액을이용하여용출시키는것을포함한다. 소수성크로마토그래피는음이온교환크로마토그래피에서제거하지못한색소와불순물들을제거하기위해 - 8 -

9 수행하는것으로서, 페닐세파로오스 용하여용출시키는것을포함한다. 레진을충진시킨컬럼으로부터 ph 5.0 내지 7.0 의용출완충용액을이 [0051] [0052] 양이온교환크로마토그래피는포르밀글리신함량을높이고기타불순물을제거하기위해수행하는것으로서, 양이온교환용레진을충진시킨컬럼으로부터 ph 4.0 내지 6.0의용출완충용액을이용하여용출시키는것을포함한다. 양이온교환용레진은 GE Healthcare 사의 CM Sepharose Fast Flow, SP Sepharose Fast Flow, S Sepharose Fast Flow 및 Capto MMC 등을사용할수있지만, 이에한정되는것은아니다. 바람직하게는, 상기용출완충용액의 ph는 4.0 ~ 6.0이다. 친화성크로마토그래피는양이온교환크로마토그래피에서사용하였던글리세롤을제거하고용출액의부피를 줄이기위하여수행하는것으로서, 블루세파로오스 TM (Blue Sepharose TM ) 레진을충진시킨컬럼으로부터 ph 6.0 내지 8.0 의용출완충용액을이용하여용출시키는것을포함한다. [0053] 상기각각의크로마토그래피조건은통상의기술자에의해최적화되어사용될수있다. 상세한크로마토그래 피조건은본명세서의실시예 <1-5> 를참조한다. [0054] [0055] 본발명에따른 IDS를유효성분으로포함하는조성물의제조방법에는혼입될가능성이있는바이러스를불활화시키는공정이추가로포함될수있다. 상기불활화과정은다양한방법을이용하여수행될수있으며, 바람직하게는 ph 3.0 ~ 4.0의범위에서일정시간방치하거나또는높은 ph에서일정시간방치함으로써수행될수있다. 상기불활화과정은정제과정중에수행될수있으며, 바람직하게는크로마토그래피과정중에, 보다바람직하게는소수성크로마토그래피과정과양이온교환크로마토그래피과정사이에수행될수있다. 한편, 상기크로마토그래피과정을거친 IDS는통상적인농축, 여과등을거쳐약물의유효성분으로사용될수있다. [0056] [0057] 상기와같이제조된약물은약학적으로허용가능한담체와혼합되고적절한제형화단계를거쳐제제화될수있다. 본발명에따른제조방법에의해생성된 IDS를포함하는조성물은종래알려진 IDS를포함하는조성물에비해 1) 포르밀글리신함량이높아치료제로서유리하며, 2) M6P 함량이높아리소좀내 GAG 분해에유리하며, 3) 동물유래의혈청을포함하지않아안전하고, 4) 99.9% 이상의순도를가져안전성및유효성이우수한장점을갖는다. [0058] 발명의효과 본발명의방법에따른재조합 IDS 를포함하는치료용조성물및제제는기존에시판중인엘라프라제에비해 높은치료효능및안전성을가지고있어, 헌터증후군의치료에매우효과적이고유용하게사용될수있다. [0059] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의 IDS 를발현하는벡터를제조하기위한중간단계에사용하는벡터 pjk-dhfr-ids-s1 를제조 하는과정을나타내는도면. 도 2는도 1의 pjk-dhfr-ids-s1 벡터로부터 IDS를발현하는벡터 pjk-dhfr-or2-ids를제조하는과정을나타내는도면. 도 3은형질도입된세포주 CHO-DG44로부터 IDS를분리및정제하는과정을나타내는흐름도. 도 4는 N-말단서열분석을위한 IDS의 SDS-PAGE 결과를나타는도면. ( 레인 M은마커이고, 레인 1은탈당화되지않은 IDS이며, 레인 2는 PNGase F로처리한 IDS이고, 레인 3은탈당화된 IDS를의미 ) 도 5는본발명에따른 IDS의아미노산서열을분석하는과정을나타낸흐름도. 도 6은본발명에따른 IDS의아미노산서열을 MALDI-MS/MS 및 LC-ESI-MS/MS로분석한결과를나타내는도면

10 도 7은본발명의 IDS의이황화결합위치를알아보기위한비환원시료와환원시료의 RP-HPLC 결과를나타내는도면. 도 8은본발명의 IDS의이황화결합위치를알아보기위한 MALDI-MS 결과를나타내는도면. 도 9는본발명의 IDS의이황화결합위치를알아보기위한 MALDI-MS/MS 결과를나타내는도면. 도 10은본발명의 IDS의 MALDI-MS/MS 결과를통해얻어진아미노산의이황화결합위치를표시한도면. 도 11은본발명의 IDS의당질화여부를살펴보기위해 IDS를다양한당절단효소로처리한후 SDS-PAGE로확인한결과를나타내는도면. 도 12는본발명의 IDS의만노스-6-포스페이트함량을살펴보기위해수행한 HPAEC-PAD 크로마토그래피결과를나타내는도면. 도 13은본발명의 IDS의순도를살펴보기위해수행한크기배제크로마토그래피결과를나타내는도면. 도 14는본발명의 IDS의천연기질에대한활성을살펴보기위해수행한이온크로마토그래피결과를나타내는도면. 도 15는본발명의 IDS의세포내흡수를알아보기위한정상섬유아세포에첨가된 IDS 농도대비세포내흡수된 IDS 양에관한라인웨버-버크플롯 (Lineweaver-Burk Plot) 결과를나타내는도면. 도 16은정상인간섬유아세포및헌터증후군환자세포로흡수되는본발명의 IDS의양을나타내는도면. 도 17은본발명의 IDS의포르밀글리신함량측정결과를나타내는도면. 도 18은본발명의 IDS를제조하는과정중, 양이온교환크로마토그래피에전후의등전포커싱 (IEF : Isoelectric focusing) 결과를나타내는도면. (M은마커이고, 레인 1은양이온교환크로마토그래피의 Load액이며, 레인 2는양이온교환크로마토그래피의용출액, 레인 3은양이온교환크로마토그래피의 regeneration액을의미 ) [0060] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명을실시예를통하여보다상세하게설명하고자한다. 그러나하기의실시예들은본발명을상세하게설명하기위한것일뿐, 본발명의범위가이들실시예에예시한것들로한정되는것은아니다. 본발명에서인용한모든문헌은본발명의명세서에서참조한것이다. [0061] [0062] [0063] 실시예 1: IDS의제조 <1-1> 유전자획득문헌 [S. Beckebaum et al., Immunology, 2003, 109: ] 에기재된방식에따라인간혈액으로부터말초혈액단핵세포 (PMBC) 를분리하였다. 상기방법을통해분리된 PBMC 세포로부터문헌 [M. J. Holland et al., Clin. Exp. Immunol., 1996, 105: ] 에기재된방식에따라총 RNA를추출하였다. 상기총 RNA로부터 cdna 라이브러리를확립하기위하여, 올리고 (dt) 프라이머및단일-가닥합성키트 (Boehringer mannheim) 를사용하여단일가닥 cdna를합성하였다. 구체적으로, 1 μg총 RNA를에펜도르프튜브에넣고 DEPC가처리된증류수를넣어 12.5 μl가되도록조절한후, 20 pmol의올리고 (dt) 프라이머를 1 μg첨가하여 70 에서 2분동안가열한후냉각하였다. 이반응액에반응완충액 4 μg, dntp 1 μg, RNase 억제제 1 μg및역전사효소 1 μg를첨가하여 42 에서 1시간반응시켜단일가닥 cdna를합성하였다. 상기 cdna 주형으로하고서열번호 2 내지 4에기재된서열을갖는프라이머를사용하여 PCR을수행하여인간 IDS 유전자를증폭시켰다. 상기프라이머각각에는클로닝과정을위하여제한효소인식부위를도입하였다. [0064] [0065] [0066] <1-2> 발현벡터제조 A. pjk-dhfr-ids-s1 벡터의제조상기실시예 <1-1> 에서획득한 IDS 유전자의앞부분에비코딩서열로항체의경쇄신호서열 ( 인간 IgG 경쇄부분서열유래 ) 을추가하여 PCR을수행하였다. 증폭된유전자를겔전기영동을한후, 겔추출키트를사용

11 하여인간 IDS 유전자를분리하였다. 상기분리된 IDS 유전자와 pjk-dhfr-or2 벡터 (Aprogen) 를 EcoRV 및 ApaI 으로절단한다음, 16 에서 20시간동안라이게이션하여연결하고, 상기얻어진벡터를 E. coli(dh5a) 에형질전환시켰다. 형질전환된균주를 50 μg /ml의암피실린이함유된 LB 플레이트에도말한후하룻밤동안배양하였다. 상기플레이트상의콜로니를선별하여배양한후, 이들로부터플라스미드를분리하였다 ( 도 1 참조 ). [0067] [0068] [0069] [0070] B. 재조합인간 IDS 발현플라스미드의제조상기단계에서제조한플라스미드의비코딩서열을재조합인간 IDS의신호서열로다시바꾸기위하여, pjkdhfr-or2 벡터에서브클로닝하였다. 구체적으로, pjk-dhfr-ids-s1 벡터를 EcoRV 및 ApaI으로절단하여 IDS 일부유전자 (1233 bp) 를얻고, 이를동일한제한효소로절단한 pjk-dhfr-or2 벡터에삽입하여 pjk-dhfr-ids- S2를제조하였다. 이후앞부분에비코딩서열과신호서열을첨가하기위해다시 pjk-dhfr-ids-s1을주형으로하고 IDS N1 정방향프라이머 ( 서열번호 5) 및 IDS 4 역방향프라이머 ( 서열번호 7) 를이용하여 94 에서 5분, 94 에서 1분, 55 에서 30초, 72 에서 40초를 30번반복한후 72 에서 10분간반응시키는조건에서 PCR을수행하였다. 상기 PCR을통해 448 bp의 IDS 유전자의일부를수득하였으며, 이를주형으로하고 IDS N2 정방향프라이머 ( 서열번호 6) 및 IDS 4 역방향프라이머 ( 서열번호 7) 를이용하여상기와동일한조건으로 PCR을수행하여 476 bp의 DNA 단편을합성하였다. 이후, pjk-dhfr-ids-s2 벡터를 EcoRV 제한효소로절단하였으며, 같은효소를이용하여재조합사람 IDS 일부유전자 (476 bp) 를각각절단하였다. 절단된단편을겔전기영동을실시하여벡터및 IDS 476 bp 단편을순수분리하였다. 상기벡터및삽입물을 T4 DNA 라이게이즈를사용하여 16 에서 12시간라이게이션반응시켜 pjk-dhfr-or2-ids 플라스미드를제조하였다. 상기과정을도 2에나타내었다. [0071] 상기제조과정을통해올바른 IDS 발현용플라스미드가제조되었는지확인하기위해, pjk-dhfr-or2-ids 플라스미드로 DH5a를형질전환시킨다음, 암피실린 (50 μg /ml) 이함유된 LB 배지에 24시간동안배양하여콜로니를얻고, 상기콜로니로부터플라스미드를분리하여삽입물의크기를확인하였다. 또한, T7 프라이머 ( 서열번호 8) 를이용하여 DNA 서열을분석하였다. [0072] [0073] [0074] [0075] [0076] <1-3> 재조합인간 IDS 발현세포주의선별 A. CHO-DG44의형질도입본발명에따른 IDS를발현시키기위해차이니즈햄스터난소세포인 CHO-DG44를숙주세포로사용하였다. CHO- DG44는이중결손방법으로내생의 dhfr 유전자기능을상실시킨세포주이다. dhfr 유전자는디하이드로폴레이트환원효소 (dihydrofolate reductase, DHFR) 를암호화하는유전자이며이단백질은핵산의 de novo 합성에관여하는테트라하이드로폴레이트 (FH4) 를폴레이트로부터디하이드로폴레이트 (FH2) 를거쳐합성하는데관여하는효소이다. 이들세포내에서, dhfr의양은 MTX의농도에의존적인것으로알려져있다. MTX는 dhfr의기질인폴산과유사한구조를가지고있어디하이드로폴레이트환원효소가폴산에결합하는것을경쟁적으로저해하며, 이로인해대부분의디하이드로폴레이트환원효소의활성이상실된다. 따라서, 충분한양의 dhfr이증폭되지못한세포는생존에필요한핵산을합성하지못하게되므로사멸하게되는반면, 증폭이충분히일어난세포는상대적으로많은양의 dhfr이존재하기때문에고농도의 MTX에서도생존하게된다. 이러한시스템을동물세포에적용함으로써형질도입세포주에서 dhfr 유전자의증폭및그로인한목적하는구조유전자의증폭이일어난세포주를선별할수있다. 실시예 <1-2> 에서제조한 IDS 발현벡터 pjk-dhfr-or2-ids는상기목적을위하여증폭가능한마커로서 dhfr 유전자를도입시켰으며, MTX와 dhfr 유전자를이용한유전자의증폭을실시하였다. 구체적으로, DG44 세포주 ( 콜롬비아대학의 Chaisin 박사로부터입수 ) 를 10 ml DMEM/F12 배지 ( 뉴클레오티드및뉴클레오시드, 및 10% 우태아혈청 (FBS) 함유 ) 에현탁한후 1000 rpm에서 5분동안원심분리하여세포를모으고, 이를 50 ml 배양용배지가들어있는 T-175 플라스크에접종하여 37±1, 5±1% CO 2 배양기에서배양하 였다. 유전자형질도입하루전에 T-175 플라스크에서배양중인 DG44 세포의배양액을제거한후 PBS 완충액

12 으로 2 회세척하고, 세포에트립신을처리하여떼어낸다음, 개의세포를 T-25 플라스크에접종하여 37±1, 5±1% CO 2 배양기에서 24 시간동안배양하였다. 상기세포의세균및진균의오염이없음을현미경 상관찰을통해확인하였고, 마이코플라스마 (mycoplasma) 의오염여부를 PCR-ELISA 를통해확인하였다. [0077] 상기오염되지않은 DG-44 세포에실시예 <1-2> 에서제조한 IDS 발현벡터 pjk-dhfr-or2-ids를리포펙타민키트로형질도입시켰다. 구체적으로, 발현벡터 5 μg과리포펙타민 50 μl를각각 Opti-MEM I 800 μl에희석하고거품이생기지않도록 DNA와리포펙타민을섞어혼합물을상온에서 15분간정치하였다. 그동안 DG44는멸균된 PBS를이용하여 1회세척하고 Opti-MEM I을이용하여 3회세척하였다. 상기 DNA-리포펙타민혼합액을 DG44 세포에잘넣어주고, Opti-MEM 6.4 ml를첨가하여 37±1, 5±1% CO 2 배양기에서 5시간동안배양하였다. 배 양후, DMEM/F12 8 ml 및 FBS 1.6 ml 를첨가하여 48 시간더배양하여세포막의회복및세포의성장이이루어 지게하였다. [0078] [0079] [0080] B. 제네티신 (G418) 저항성세포주선별상기배양된세포를 0.25% 트립신으로처리하여떼어내고세포수를측정하여 세포 / 웰 /100 μl가되도록 MEM-알파배지 (10% 투석된 FBS 및 550 μg /ml의 G418 함유 ) 에현탁한다음, 96-웰플레이트에분주하였다. 다음날동일한배지를 100 μl / 웰로더첨가하여 2-3주동안콜로니가형성될때까지배양하였다. 콜로니형성을계속관찰하면서용기면적의약 50% 이상자랐을때동일한배지로교환해주고 3일간배양한후에배양액을수확하여효소분석을수행하였다. 3일간격으로각웰의배양액을흡입하여제거한후새로운배지 200 μl를첨가하여배양을실시하였다. 배양후 3~4일째형질도입이되지않은세포주, 즉제네티신 (geneticin) 에저항성을가지지못하는세포주가사멸하여 96 웰플레이트의바닥에서떨어지기시작함을현미경에서관찰할수있었다. 선별된클론들을 96-웰플레이트에서순차적으로 24 웰, 6 웰플레이트그리고 100 mm 디쉬로옮겨주면서배양하였다. 100 mm 디쉬에서 80~90% 컨플루언시 (confluency) 를보이는수준까지자랐을때발현량을다시측정하였다. 세포를 0.25% 트 립신을사용하여떼어낸후세포수를측정하여 6- 웰플레이트에 세포 / 웰 /3 ml 로해당배지를넣어주고 3 일간배양하여증가된세포수를측정하고발현된단백질의양을정량하였다. 정량결과에따라 15 개의클론을 선별하였다. [0081] [0082] [0083] C. 발현량이우수한 IDS 발현세포주선별상기선별된 15개의클론을증가된 MTX 농도하에서배양시켜 IDS의증폭이일어난세포주를선별하였다. 구체적으로, 세포 /100 mm/ 디쉬 /10 ml로세포를 MTX가포함된배지에접종하여 80~90% 수준까지배양한후 1/10 부피에해당하는세포를다시 100 mm 디쉬 /10 ml에접종하여이를 2회반복하였다. 최소 3 계대이상의세포배양을반복하여증가된 MTX 농도의조건에서도세포가충분히적응할수있도록하였다. MTX 농도의증가는최초 5 nm MTX에서 3일간의분석에의해선별된클론들로부터시작하였으며, 이후 MTX 농도의변화는 20 nm로하였다. 각단계에서 MTX 증폭에적응된클론들은 3일간세포를배양하여세포성장속도를측정하였다. 이들세포주를대상으로 IDS 발현량을측정하여, IDS 유전자증폭이이루어진, 즉, 재조합 IDS의발현량이증가된세포주를선별하였다. 상기선별된세포주중발현량이가장높은세포주 NI4를이후실험에사용하였다. [0084] [0085] [0086] D. 한계희석법에의한단일세포주선별상기수득된세포주 NI4에다른세포주가섞여있을가능성이있으므로이들세포주를단일세포주로분리하는과정을실시하였다. 20 nm MTX에의해증폭된 NI4 클론을대상으로한계희석을통한서브클로닝을수행하여최종대상세포주를선정하는작업을진행하였다. 먼저, NI4를 IMDM 배지 (Gibco BRL 社, Cat#12200) 가담긴 96-웰플레이트에 0.5 세포 / 웰로희석하여접종하고, 3일간격으로배지를교환하면서배양하였다. 배양 3일째부터현미경으로관찰하여웰에 2개이상의콜로니가형성되는웰을제외하고, 웰당한개의콜로니만형성된웰을선별하여, 배양 15일후 96 웰배

13 양플레이트로다시계대하고세포의컨플루언시가 90% 에도달하였을때새로운배지로교환을실시하였다. [0087] 상기 NI4 로부터총 263 개의단일세포주가선별되었고, 이들로부터최대 IDS 활성을나타내는세포주 S46 을 선별하여, 이를 NI4-S46 으로명명하였다. [0088] [0089] [0090] <1-4> 세포의배양 A. 쉐이커플라스크배양상기선별된 NI4-S46 세포주를하기와같이대량으로배양하여본발명의 IDS를생산하였다. 상기세포주를 EX-cell 302 무혈청배지 ( 글루타민, 덱스트란설페이트, pluronic F-68 함유 ) 가담긴 125 ml 배양플라스크에넣고 5±1% CO 2, 37±1 조건하에서배양하였다. 이후, 세포를쉐이커플라스크 (shaker flask) 를이용하여 2~3 일간격으로 1:5~1:8 비율로계대배양하였다. 계대시약 2,400 ml 까지점차적으로부피를늘려가며배양하 였다. 이들을여러개의쉐이커플라스크에배양하여생물배양기에접종할수있는충분한양이되면다음 단계를수행하였다. [0091] [0092] B. 30L 생물배양기 (working volume 20L) 배양쉐이커플라스크에서배양중인세포가 세포 /ml 이상이되면세포를모아, 30L 생물배양기에접종하여배양하였다. 세포배양시용존산소량 10% 이상, 배양온도 37±1, ph 7.0±0.2를유지하였다. 필요한경우, 배양액을채취하여현미경으로세포의상태를관찰하고세포수, 세포활성, ph, 글루코스농도및글루타민농도를분석하고, 상기분석결과충분한세포성장이이루어지면 150 L 생물배양기에접종하였다. [0093] [0094] C. 150L 생물배양기 (working volume 100L) 배양 30L 생물배양기에서배양중인세포가 세포 /ml 이상이되면, 150 L 생물배양기에접종한후배양하였다. 세포배양시용존산소량 10% 이상, 배양온도 37±1, ph 7.0±0.2를유지하였다. 필요한경우, 배양액을채취하여현미경으로세포의상태를관찰하고세포수, 세포활성, ph, 글루코스농도및글루타민농도를분석하고, 상기분석결과충분한세포성장이이루어지면 650 L 생물배양기에접종하였다. [0095] [0096] D. 650L 생물배양기 (working volume 500L) 배양 150L 생물배양기에서배양중인세포가 세포 /ml 이상이되면, 650L 생물배양기에접종한후배양하였다. 세포배양시용존산소량 10% 이상, 배양온도 34±1, ph 6.9±0.2로 3일간유지하였다. 3일후부터배양온도 32±1, ph 6.9±0.2로유지하였다. 필요한경우, 배양액을채취하여현미경으로세포의상태를관찰하고세포수, 세포활성, ph, 글루코스농도및글루타민농도를분석하고, 상기분석결과에따라글루코스및글루타민공급량을조절하여세포성장이이루어지게하였고배양공정중가수분해산물을첨가하여포르밀글리신증가를유도하였다. [0097] [0098] <1-5> IDS 의정제 하기일련의 4 단계의크로마토그래피를이용하여실시예 <1-4> 에서수득된배양액으로부터 IDS 를분리하였다. [0099] [0100] [0101] A. 배양액회수및여과 650L 배양기에접종 10일이후세포활성도가 80~85% 범위인경우, 세포배양을중단하고밀리포어 (Millipore) POD 필터시스템및 D0HC(Millipore) 필터를이용하여 0.9 bar 이하의용기압력에서배양액으로부터세포를분리하였다. 세포가분리된배양상등액을 Pre-filter(Millipore, μm ) 와 μm필터를이

14 용하여여과한후멸균된 1 회용비닐백에담아회수하였다. 회수된배양액을 2~8 에보관하였다. [0102] [0103] B. 농축및버퍼교환상기 A에서회수한배양여과액부피를한외여과 (ultrafiltration) 장치 (Tangential Flow Filtration Membrane System) 를사용하여약 10배농축하였다. 한외여과장치내멤브레인 (Cut off: 30K, Pall) 을주사용수를이용하여 20~25 L/ 분의속도로세척한후 20 mm 인산나트륨 ( 인산이수소나트륨일수화물과인산수소나트륨헵타수화물 ) 이첨가된완충용액 (ph 7.0~8.0) 을이용하여평형화하였다. 평형이이루어지면배양액회수액을멤브레인에주입시켜통과하지못하는분획을회수하였다. 최종회수액의부피가초기배양여과액부피의약 1/10이되면농축과정을멈추고농축액의 3~4배에해당하는완충용액을연속적으로교환시켜전도도와 ph 가기준내에들어오면공정을멈추었다 [ 기준-전도도 : 5.0 ms/cm, ph 7.0~8.0]. [0104] [0105] [0106] C. 음이온교환크로마토그래피상기 B에서획득한배양회수액으로부터색소와여러가지종류의불순물들을제거하기위하여, Q 세파로오스 (Q Sepharose, GE Healthcare) 레진을충진시킨정제용컬럼 (GE Healthcare) 을이용하여음이온교환크로마토그래피를수행하였다. 상기컬럼을 20mM 인산나트륨 ( 인산이수소나트륨일수화물과인산수소나트륨헵타수화물 ) 첨가평형완충용액 (ph 7.0~8.0) 으로평형화한다음, 상기 B에서얻은농축액을 μm필터 (Sartorius) 로여과하여 100~120 cm/h의선유속으로컬럼에로딩하였다. 로딩을완료하고상기평형완충용액으로 1차세척한다음, 소량의염화나트륨이첨가된세척완충용액 (ph 5.5~7.5) 으로 2차세척하였다. 2차세척이완료후, 염화나트륨이첨가된용출완충용액 (ph 5.5~7.5) 을이용하여목적단백질을용출하였다. [0107] [0108] D. 소수성크로마토그래피음이온교환크로마토그래피에서제거하지못한색소와불순물들을제거하기위하여, 페닐세파로오스레진 (Phenyl Sepharose, GE Healthcare) 을충진시킨정제용컬럼 (GE Healthcare) 을이용하여소수성크로마토그래피를수행하였다. 상기컬럼을염화나트륨이첨가된평형완충용액 (ph 5.0~7.0) 으로평형화한다음, 상기 C에서얻은용출액을 μm필터 (Sartorius) 로여과하여 70~100 cm/h의선유속으로컬럼에로딩하였다. 로딩을완료하면, 상기평형완충용액으로세척하고, 글리세롤이첨가된용출완충용액 (ph 5.0~7.0) 으로목적단백질을용출하였다. [0109] [0110] E. 낮은 ph를이용한바이러스불활화숙주세포또는공정에사용되는부원료로부터유래될수있는바이러스를낮은 ph 조건을이용하여불활화하였다. 구체적으로, 상기 D의과정으로얻은용출액에 25% 아세트산을첨가하여 ph를 3.0 ~ 4.0로조정한후 2 시간동안불활화하였다. 2 시간경과후 0.5 M 수산화나트륨용액을이용하여 ph를 4.0~5.0로조정하고다음공정에사용하였다. 낮은 ph 불활화공정은 12±2 에서실시하였다. [0111] [0112] F. 양이온교환크로마토그래피 IDS는당을포함하는당단백질로서당사슬말단에결합되어있는시알산의함량에따라다른등전점을갖는이성질체로존재하게된다. 시알산은음전하를띠는당으로시알산의함량이다르면양이온교환용레진에결합하는정도에차이가발생하게된다. 이러한특성을이용하여시알산의함량과활성 ( 포르밀글리신함량 ) 이높은 IDS를얻고기타불순물 [Product impurity (Aggregated IDS, processed IDS), process impurity (Host Cell protein)] 을제거하기위해양이온교환크로마토그래피를수행하였다. 구체적으로 Capto TM MMC 양이온교환용레진을충진시킨컬럼 (GE Healthcare) 을글리세롤이첨가된평형완충용액 (ph 4.0 ~ 5.0) 으로평형화한다음, E의과정에서얻은불활화물을 μm필터 (Sartorius) 로여과하여 100~120 cm/h의선유속으로컬럼에로딩하였다. 로딩후, 상기평형완충용액으로세척하고, 글리세롤이첨가된용출완충용액 (ph 4.0~6.0) 으로시알산함량 ( 등전점이 3.5 이하 ) 과활성 ( 포르밀글리신함량 : 80±15%) 및순도 (SE-HPLC, 98% 이

15 상 ) 가높은 IDS 를용출시켰다. [0113] [0114] G. 친화성크로마토그래피양이온교환크로마토그래피에서사용한글리세롤을제거하고, 용출액의부피를줄이기위하여친화성크로마토그래피 (Blue Sepharose, GE Healthcare) 를수행하였다. 블루세파로오스 (Blue Sepharose) 레진을충진시킨컬럼 (GE Healthcare) 을글리세롤이첨가된평형완충용액 (ph 4.5~5.5) 으로평형화시킨다음, 상기 F 과정으로부터얻은용출액을 μm필터 (Sartorius) 로여과하여 100~120 cm/h의선유속으로컬럼에로딩하였다. 로딩을완료하면세척완충용액 (ph 4.5~5.5) 으로세척하고, 용출완충용액 (ph 6.0 ~ 8.0) 으로목적단백질을용출하였다. [0115] [0116] H. 농축및버퍼교환상기 G에서얻은용출액의단백농도를조정하고, 정제된단백질을제형화 (formulation) 완충용액으로교환하기위해한외여과장치 (Tangential Flow Filtration Membrane System) 를사용하였다. 한외여과장치내멤브레인 (Cut off: 10K, Pall) 을주사용수를이용하여 450~650 ml/ 분의속도로세척하고, 폴리소르베이트 20이첨가되지않은제형화완충용액 (2.25 g/l 인산이수소나트륨일수화물, 0.99 g/l 인산수소나트륨헵타수화물, 8 g/l 염화나트륨, ph 6.0 ~ 7.0) 을이용하여평형화한다음, 목적단백질을농축하였다. 농축액의 3~4배부피에해당하는완충용액을연속적으로교환시켜전도도와 ph가기준내에들어오면공정을멈추었다 ( 기준-전도도 : 15.0±3.0 ms/cm, ph 6.0~7.0). 농축액의농도를 4.0±0.5 mg/ml으로조정하였다. [0117] [0118] [0119] I. 극미세여과숙주세포또는공정에사용되는부원료로부터유래될수있는바이러스를제거하기위하여나노필터 (NFP, Millipore) 를사용하여극미세여과를수행하였다. 주사용수를이용해나노필터를적신후필터에대한완전성시험 (integrity test) 를실시하였다. 완전성시험에합격한나노필터에폴리소르베이트 20을첨가하지않은제형화완충용액 (2.25 g/l 인산이수소나트륨일수화물, 0.99 g/l 인산수소나트륨헵타수화물, 8 g/l 염화나트륨, ph 6.0~7.0) 1 L를흘려주어평형화하였다. 평형이완료되면상기 H 단계에서얻은농축액을약 2 bar의압력으로통과시켜극미세여과액을회수하였다. 여과가완료후, 제형화완충용액으로세척하고, 상기세척액과극미세여과액을모아단백농도를측정하였다. [0120] [0121] J. 원액제조공정상기 I 과정에서얻은여과액에폴리소르베이트 20을첨가하지않은제형화완충용액을첨가하여단백농도를조정하였다. 그후폴리소르베이트첨가한후 0.2 μm필터로여과하여원액을생산하였다. 생산된원액은분주하여초저온냉동고 (-70±10 ) 에보관하였다. [0122] [0123] [0124] K. 완제품제조공정초저온냉동고에보관중인원액을 28±1 항온수조에서녹인후제형화완충용액 (2.25 g/l 인산이수소나트륨일수화물, 0.99 g/l 인산수소나트륨헵타수화물, 8 g/l 염화나트륨, 0.23 g/l 폴리소르베이트 20, ph 6.0~7.0) 을이용하여단백농도가약 2.05±0.2 mg/ml이되도록희석하였다. 이후, 상기희석액을 0.2 μm제균필터로여과하여최종원액을생산하였다. 상기원액을자동충전기를사용하여 6 ml 바이알에약 3.3 g씩충전하였다. 충전이완료되면이물검사를통과한바이알을포장하여완제품을생산하였다. 세포주배양으로부터완제품을제조하는공정을도 3에나타내었다. [0125] 비교예 1: 엘라프라제 의제조

16 [0126] 종래시판 ( 처방 ) 중인재조합 IDS 인엘라프라제를비교예로사용하였다. [0127] [0128] [0129] 실험예 1: 본발명에따른 IDS의구조및특성분석 <1-1> 아미노산서열분석 - 내부서열분석 (Internal sequencing) 탈당화된 IDS를 SDS-PAGE를통해분리한후겔슬라이싱 (gel slicing) 하여분리하였다. 이후, 다양한엔도프로티나아제 ( 트립신, 키모트립신, AspN, 키모트립신 / 트립신, AspN/ 트립신, GluC 및 GluC/ 트립신 ) 를처리한후그분해산물을 MALDI-MS/MS 및 LC-ESI-MS/MS로분석하였다 ( 도 5). 상기분석결과, 총 525개의아미노산서열을확인하였다. 상기확인된아미노산서열은인간 IDS의이론서열과동일하였다 ( 도 6 참조 ). [0130] [0131] [0132] [0133] <1-2> 이황화결합분석이황화결합은폴리펩타이드내 2개의시스테인잔기의 SH기사이에형성되는가교결합으로서, 단백질의고차구조를안정적으로유지하는데중요한역할을한다. 이론상으로 IDS의 525개아미노산내에는 6개의시스테인이존재하고이중 4개의시스테인이이황화결합을형성한다. 본실험예에서는 IDS에서이황화결합을형성하는시스테인의정확한위치를확인하고자하였다. 먼저, 당에의한간섭을제거하기위하여, IDS에 PNGase F를처리하여탈당화된 IDS를획득하였다. 이황화결합을형성하지않는시스테인에의한간섭요인을제거하기위하여, 4-비닐피리딘을사용하여 SH기가비특이적으로 S-S 결합을형성하는것을차단한비환원시료를준비하고, 한편, DTT를이용하여이황화결합을끊어준다음다시 4-비닐피리딘을사용하여차단하여환원시료를준비하였다. 상기비환원시료및환원시료에실험예 <1-3> 의결과를바탕으로선정한트립신과 AspN을처리하였다. 상기처리된펩타이드단편을 RP-HPLC를이용하여분리하고, 비환원시료와환원시료의 RP-HPLC 크로마토그램을비교하여비환원시료에는존재하지만환원시료에는존재하지않는피크를분리하였다 ( 도 7 참조 ). 보다정확한분석을위해, 상기분리한피크들을추가적으로엔도프로티나아제로처리하여크기를줄인다음, MALDI-MS를이용하여이황화결합을포함하는피크를분석하였다 ( 도 8 참조 ). 이황화결합을포함하는피크를다시 MALDI-MS/MS를이용하여서열분석하였고 ( 도 9), 이를통해 525개 IDS 아미노산중어느시스테인에서이황화결합이형성되는지분석하였다. 분석결과도 10에서보는바와같이, C146-C159 및 C397-C407 위치에서이황화결합이형성되는것으로나타났다. [0134] [0135] [0136] <1-3> 포르밀글리신 (formylglycine) 함량분석 IDS는글리코사미노글리칸 (GAG) 의일종인헤파란설페이트 (heparan sulfate) 와더마탄설페이트 (dermatan sulfate) 를분해한다. 이러한기질분해능력은활성부위의 59번째아미노산인시스테인이번역후수식되어포르밀글리신 (FGly) 으로존재하여야달성될수있다. 따라서, 본실험예에서는 IDS의기질분해능력을분석하기위해, 59번위치의시스테인 (Cys59) 이포르밀글리신으로얼마나수식되어있는지분석하고자하였다. 분석방법은 MS(Mass Spectroscopy) 를기반으로한정량분석법으로서방사성동위원소로표지된합성기질 (AQUA 펩타이드 ) 을시료에스파이킹 (spiking) 하여분석하는아쿠아 (AQUA, absolute quantification) 방법을이용하였다. Cys59 위치의포르밀글리신을정량하기위하여단계적으로희석된 AQUA 펩타이드를시료에스파이킹한다음, 검정곡선 (calibration curve) 를작성하였다. LC-ESI-MS를이용하여분석한후 FGly 형태의펩타이드와 Cys 형태의펩타이드비율을측정하고, 이를 AQUA 검정곡선에대입하여포르밀글리신의함량을계산하였다. 분석결과, 80±15% 의비율로 Cys59가 FGly로바뀌어있음을확인하였다. 종래시판중인엘라프라제가약 50% 비율로 Cys59가 FGly로바뀌어있음을고려할때 (Elaprase Science Discussion, EMEA, 2007; Genet Med 2006:8(8): ) 본발명의 IDS를포함하는치료용조성물및이를포함하는제제는엘라프라제에비해활성이훨씬높을것으로예상된다. [0137] <1-4> 당질화여부및유형확인

17 [0138] [0139] 본발명의 IDS의당질화여부및당질화유형을확인하고자, IDS를여러가지당절단효소를처리하고, SDS- PAGE 겔을이용하여분리한후그이동정도를분석하였다. 구체적으로 IDS 시료에표 1에열거된 4 가지의당절단효소를조합하여처리한후, SDS-PAGE 겔을이용하여분리하였다. [0140] [0141] 분석결과, 도 11에도시된바와같이, IDS는 PNGase F와 Endo H에의해서는절단되었으나, O-glycosidase에의해서는절단되지않았다. 따라서, 본발명의 IDS는 N-당질화단백질인것으로확인되었다. 또한, IDS는 PNGase F에의해서완전히절단되었으나 Endo H에의해서는약하게절단되어크기감소가적음을알수있었다. 한편, PNGase F는 3가지유형의당질화위치에모두작용하는효소이지만 Endo H는고만노스 (high mannose) 유형과하이브리드 (hybrid) 유형의당질화위치에만작용하는효소이다. 이결과들을통해 IDS에는콤플렉스유형, 고만노스 (high mannose) 유형그리고하이브리드유형의세가지당질화유형이존재함을확인하였다. [0142] [0143] <1-5> 만노스-6-포스페이트 (Mannose-6-phosphate) 함량분석만노스-6-포스페이트 (M6P) 는세포의 M6P 수용체와반응하여 IDS가리소좀내로들어가헤파란설페이트나더마탄설페이트를가수분해할수있도록돕는역할을한다. 본실험예에서는 TFA를이용하여 IDS를산가수분해한후 HPAEC-PAD (Bio-LC) 를이용하여만노스-6-포스페이트의함량을측정하였다. [0144] IDS를 6.75M 트리플루오로아세트산 (TFA) 으로가수분해한후액체크로마토그래피 (High Performance Anion- Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection; HPAEC-PAD) 를이용하여분석하였다. 농도를알고있는 M6P를동일한조건에서분석하여면적을비교함으로써당단백질몰대비 M6P의몰비를구하였다. 분석은각각 3회반복하였다. M6P 표준물질및 IDS의 M6P 조성크로마토그램을도 12에나타내었고 M6P의몰비를표 2에정리하였다. [0145] [0146] 표 2 에서보는바와같이, 1 몰의 IDS 당약 3 몰의 M6P 가존재하는것으로나타났으며, 이러한결과로볼때 본발명의 IDS 를포함하는치료용조성물및이를포함하는제제는생체내에서리소좀내 GAG 를분해하는능

18 력이우수할것으로사료된다. [0147] [0148] <1-6> 질량분석당화된 IDS와탈당화된 IDS의질량을 MALDI-TOF-MS를사용하여측정하였다. 탈당화된 IDS는당화된 IDS에 PNGase F를처리하여분리하였다. MALDI-TOF-MS는 Delayed Extraction laser-desorption mass spectrometer와연결된 Voyager-DE PRO Biospectrometry (Applied Biosystems, USA) 기기를사용하여시험을수행하였고, 기기는소혈청알부민 (BSA) 과 IgG1을사용하여보정하였다. 분석결과를표 3에나타내었다. [0149] [0150] 표 3 에서보는바와같이, 당화된 IDS 의분자량 (molecular size) 은 77,244 Da 이고탈당화된 IDS 의분자량은 59,399 Da 으로아미노산서열에기초한이론분자량 59,298 Da 과유사하였다. [0151] [0152] [0153] <1-7> 순도측정크기배제크로마토그래피 (size exclusion chromatography) 방법을이용하여 IDS의순도를평가하였다. 크기배제크로마토그래피는상대적인분자량및모양에따라단백질을분리하며컬럼공극 (pore) 의크기보다큰단백질은한꺼번에배출되며이후분자량또는크기의역순으로배출된다. 사용된기기는얼라이언스 (alliance) 2695 HPLC 시스템 (Waters, WI, USA) 을사용하였으며, 2487 UV/VIS 검출기 (Waters, WI, USA) 를이용하여 214 nm에서단백질을검출하여엠파워 2 소프트웨어 (Empower 2 Software) 를이용하여분석하였다. 컬럼은 TSK G3000SWXL 컬럼및 TSK SWXL 컬럼용가드컬럼 (Tosoh, Japan) 을사용하였다. IDS를제형버퍼로 1.0 mg/ml 농도로희석한후 10 μl부피로컬럼에적용하였다. 이동상 (20 mm 나트륨인산염완충액, 200 mm NaCl, ph 7. 0) 으로 0.5 ml/min의유속으로 60분간분석하였다. 분석결과, 도 13에서보는바와같이, IDS 단량체는약 16.4분의지연시간을가지고있으며 100% 의순도를유지하고있는것으로나타났다. [0154] [0155] <1-8> 합성기질을이용한활성측정 합성기질인 4- 메틸움벨리페릴 -L- 이듀로니드 -2- 설페이트 Na 2 (4-methylumbelliferyl -L-iduronide-2-sulfate Na 2, MU-IdoA-2S) 와 IDS 를 4 시간동안반응시키면기질로부터설페이트가 1 차적으로유리된다 (1 차반응 ). 1 차반

19 응후에 LEBT(lysosomal enzymes purified from bovine testis) 를첨가하면기질인 4-메틸움벨리페릴-L-이듀로니드 (1차반응시설페이트가유리된반응물 ) 와 2차효소반응이진행되어 L-이듀로니드가유리되고최종적으로 4-메틸움벨리페릴만남게된다. 남아있는 4-메틸움벨리페릴은형광을띠게되므로형광의세기를측정 (Ex.355nm/Em.460nm) 하여 IDS의활성을평가하였다. 평가결과, 본발명의 IDS는 19 ~ 55 nmol/min/ μg범위의비활성을나타내었다. 상기활성은 IDS 아미노산잔기 59번의시스테인이번역후전사되어효소의활성부위에포르밀글리신 (FGly) 이존재함을의미한다. [0156] [0157] [0158] <1-9> 천연기질을이용한활성측정 IDS와천연기질과의반응여부를확인하기위하여헤파린이당류 (heparin disaccharide) 와 IDS를반응시켜유리된설페이트이온을확인하였다. 반응액을이온컬럼 (Vydac 302IC) 에주입하고이동상 0.49 g/l 프탈산을유속 2 ml/min으로흘려주어유리된설페이트이온을 290 nm의파장에서음성모드로검출하였다. 확인결과도 14에서보는바와같이, IDS는천연기질인헤파린이당류의설페이트이온을가수분해하는것으로나타났으며, 이는생체내에있는더마탄설페이트와헤파란설페이트의 O-결합된설페이트를분해할수있음을의미한다. [0159] [0160] <1-10> 시험관내세포흡수활성정상인간섬유아세포 (normal fibroblast cell) 및헌터증후군환자세포를이용하여세포내로의 IDS 흡수능력을측정하였다. 구체적으로, 정상섬유아세포와헌터증후군환자세포 ( 삼성서울병원제공 ) 를배양한후 IDS를농도별로첨가하여 37 및 5% CO 2 배양기에서약 20 시간동안배양하여세포내로 IDS가흡수되도록하였다. 세포를회수한다음, 파쇄하여얻어진세포파쇄액으로부터세포내에흡수된 IDS 의양을측정하였다. [0161] 정상섬유아세포에첨가된 IDS 농도대비세포내로흡수된 IDS 의양으로부터미카엘리스 - 멘텐 (Michaelis- Menten) 그래프와라인웨버 - 버크플롯 (Lineweaver-Burk Plot) 을작성하여 K uptake ( 포화된 IDS 가 1/2 이되는 IDS 농도 ) 값을계산하였다. 상기계산된 K uptake 값은 18.0 nm 이하였다. 이는 IDS 의 M6P 와세포표면의 M6P 수용체의작용을통해 IDS 가세포내로흡수된다는것을의미한다 ( 도 15 참조 ). [0162] 또한, 전술한방법과동일하게정상인간섬유아세포뿐만아니라헌터증후군환자세포로흡수되는 IDS 의양 과활성을측정해본결과, 두세포모두 IDS 의양과활성이증가함을확인하여 IDS 의세포내흡수능력을확 인하였다 ( 도 16 참조 ). [0163] [0164] 실험예 2: 임상시험을통한 IDS의효과분석헌터증후군으로확인된 31명의환자를 3 그룹으로나누고, 본발명의 IDS 단백질을투여한다음, 여러가지헌터증후군관련변수의변화를분석하였다. 한편, 양성대조군으로서헌터증후군치료제로시판중인엘라프라제 (Elaprase 를투여하여비교하였다. [0165] [0166] <2-1> 소변 GAG 변화 (1차유효성평가변수 ) 측정세그룹의헌터증후군환자그룹에각각엘라프라제 (0.5 mg/kg) 및본발명의 IDS(0.5 mg/kg 및 1.0 mg/kg) 를 24주간투여한후소변에서 GAG (Glycosaminoglycan) 의양을선행문헌 (Conn. Tissue Res. Vol.28, pp , 1990.; Ann. Clin. Biochem. Vol.31, pp , 1994.) 에기재된방법에따라측정하였다. 측정결과를표 4에나타내었다. [0167]

20 [0168] 표 4에서보는바와같이, 엘라프라제투여시환자의소변내 GAG가 18.7% 감소한반면, 본발명의 IDS를투여한결과소변내 GAG가동량에서 29.5% 감소하였다. 또한, 본발명의 IDS를 1.0 mg/kg의양으로투여한결과, GAG 함량이 41.1% 감소하였다. 상기결과는본발명의 IDS가 GAG가분해되지않아축적되는질환인헌터증후군을치료하는데효과적임을보여준다. [0169] [0170] <2-2> 6-MWT(6 minute walking test) 변화 (2차유효성평가변수 ) 측정 24주간엘라프라제및본발명의 IDS를투여한헌터증후군환자를대상으로, 6분동안걷는거리를선행기술 (Am. J. Respir. Crit. Care Med., Vol.166. pp , 2002.) 에기재된방법에따라측정하고, 그결과를표 5에나타내었다. [0171] [0172] 표 5에서보는바와같이, 엘라프라제투여환자의경우 6-WMT 변화율이 1.3% 에불과한반면, 본발명의 IDS 를투여한환자의경우동량에서 18.2% 로증가하였다. 헌터증후군환자의경우관절구축으로인해정상인에비해걷는것이쉽지않으나, 본발명의 IDS는이를개선할수있어헌터증후군의개선에효과적임을알수있었다

21 도면 도면

22 도면

23 도면 3 도면

24 도면 5 도면

25 도면 7 도면 8 도면

26 도면 10 도면

27 도면 12 도면

28 도면 14 도면 15 도면

29 도면 17 도면 18 서열목록 서열목록전자파일첨부