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기성 최
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1 ISSN (PRINT) ISSN (ONLINE) 약학회지제 62 권제 3 호 153~157 (2018) Yakhak Hoeji Vol. 62, No. 3 DOI /psk 종설 Short Report 구리양이온을탐지하기위한퀴놀론형광프로브의합성및검증 이석범 이남걸 최성욱 # 충남대학교신약전문대학원 (Received March 2, 2018; Revised April 26, 2018; Accepted April 26, 2018) Synthesis and Evalution of a Quinolone Derivative as the Fluorescent Probe for a Cupric Ion. Seok Beom Lee, Nam-Geol Lee, and Sungwook Choi # Graduate School of New Drug Discovery and Development, Chungnam National University, Daejon, Korea Abstract A fluorescent probe based on a quinolone scaffold was investigated as selective fluorescent copper ion probes under aqueous environment. The fluorescence intensity of probe 6 was significantly enhanced in a Cu 2+ -concentration dependent manner and it can selectively detect Cu 2+ among various other metal cations including Zn 2+, Hg 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+, Cd 2+ and Pb 2+. Keywords Probe, Quinolone, Copper, Fluorescence 서 론 (Introduction) 인체에존재하는금속원소들은효소작용에있어중요한구성성분으로써생리과정에서직접참여하여산화, 환원반응을일으키며신진대사와세포활성화에관여한다. 1) 구리 (Copper) 는신체내에세번째로풍부하게존재하는금속으로주로세포, 조직, 간, 뇌, 심장등에존재한다. 2) 그리고구리는세포내에서에너지생산에필요한 4가지주요미네랄중의하나로써혈관벽의탄력조성, 신경막의보호작용, 면역유지, 멜라닌색소형성등의중요한역할을한다. 3) 구리는페노옥시다아제 (phenoloxidase) 4) 의구성성분으로써철분을산화시켜세포막을통과할수있게하고, 시토크롬산화효소의일부분으로구리의결핍증상은드문편이지만심장질환, 성장장애, 빈혈증, 백혈구의감소, 뼈의손실같은증세가나타나며또한프리온질병 5), 루게릭병 6) 과연관이있다. 유전적결함에 # Corresponding Author Sungwook Choi Graduate School of New Drug Discovery and Development, Chungnam National University, Daejeon, 34134, Republic of Korea Tel.: Fax.: swchoi2010@cnu.ac.kr 의한윌슨병 7) 은구리가담즙을통해배설되지않고간, 뇌, 신장에축적되어뇌를손상시킨다고알려져있다. 또한, 구리는치매의가장흔히형태인알츠하이머병 8) 과연관이있는아밀로이드 (Amyloid) 형성과정에도연관되어있다. 알츠하이머는베타아밀로이드가과도하게응집및섬유화가일어나기억력, 사고력및추진력의점진적감퇴을야기하는치명적인뇌질환이다. 이때베타아밀로이드단백질이구리이온과결합하게되면, 베타아밀로이드를제거하는 LRP1(Low density lipoprotein receptorrelated protein 1) 의기능을막고, 축적되면서산화환원반응을통해 ROS(Reactive oxygen species) 를생성하여아밀로이드섬유화를가속화한다고알려져있다. 9) 이와같이구리와관련된여러질병들을고려해볼때우리몸속의구리양이온을효과적으로측정하여미리질병을예방하는방법을찾아야한다. 현재여러장비를이용하여진단이가능하지만비용이많이들고시간이오래걸리는단점이있다. 따라서이러한목적으로본연구에서는퀴놀론 (Quinolone) 을기반으로한저분자화합물을이용한형광프로브를고안하고합성하였다. 실험방법 (Experimental Methods) 시약및분석기기 153

2 154 이석범 이남걸 최성욱 시약은 Aldrich, Acros, TCI 그리고삼전화학등의제품을사용하거나필요한경우합성하여사용하였다. 본실험에서사용한용매및언급하지않은시약은부차적인정제과정을거치지않고시판품을이용하였다. TLC(Thin Layer Chromatography) 는 Kieselgel 60 F 254 plate(merk) 을사용하여합성과정을관찰하였고합성후화합물의정제는 MPLC(Biotage) 을이용하였다. 모든화합물의 1 H-NMR 및 13 C-NMR spectra는 Bruker 300 MHz spectrometer(fourier 300, 1 H=300 MHz, 13 C=75 MHz) 로측정하였으며, chemical shift는 ppm(parts per million) 으로나타내고 spectra는내부표준물질인 TMS(tetra methyl silicone), CDCl 3, 그리고 DMSO를참조하였다. N-(3-Bromo-phenyl)-acetamide (1) 3-Bromo-phenylamine(4.5 g, mmol) 과 Et 3 N(7.3 ml, mmol) 을 CH 2 Cl 2 (13 ml) 에녹인뒤, Ac 2 O(3.7 ml, mmol) 를 0 o C에서적가하고상온에서 5시간동안교반하였다. 반응액에 CH 2 Cl 2 와 1M HCl을가하고포화식염수로유기층을씻어주었다. 유기층을 Na 2 SO 4 를이용하여건조및감압농축하였다. 별도의정제과정없이살색고체 N-(3-bromo-phenyl)- acetamide(1, 5.2 g, 92%) 을얻었다. 1 H NMR(300 MHz, CDCl 3 ) δ 8.68(s, 1H), 7.78(s, 1H), 7.37(d, 1H, J=7.5 Hz), (m, 1H), 2.14(s, 3H); 13 C NMR(75 MHz, CDCl 3 ) δ , , , , , , , Bromo-2-chloro-quinoline-3-carbaldehyde (2) DMF(4.4 ml, mmol) 에 POCl 3 (20.8 ml, mmol) 를 0 o C에서적가하고 5분간교반한후 N-(3-bromo-phenyl)- acetamide(1, 4 g, mmol) 을적가하였다. 혼합물을 80 o C에서가열교반하고 16시간후상온으로식혔다. 얼음물에혼합물을넣은후 1 M NaOH 수용액으로중화시켜 ph 7을맞추고감압여과장치를통해고체를얻었다. 고체를 EtOAc로재결정하여상아색고체 7-Bromo-2-chloro-quinoline-3-carbaldehyde(2, 1.8 g, 36%) 을얻었다. 1 H NMR(300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.37(s, 1H), 8.98(s, 1H), 8.27(s, 1H), 8.22(d, 1H, J=8.8 Hz), 7.9(dd, 1H, J=8.7 Hz); 13 C NMR(75 MHz, DMSO-d 6 ) δ , , , , , , , , , Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde (3) 7-Bromo-2-chloro-quinoline-3-carbaldehyde(2, 1.5 g, 5.55 mmol) 에 70% acetic acid를가하고 95 o C에서 14시간동안가열교반하였다. 혼합물을상온으로식힌후얼음물에넣어주고 30분동안교반하고감압여과장치를통해거른후동결건조시켜살색고체 7-Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde(3, 1.2 g, 90%) 을얻었다. 1 H NMR(300 MHz, DMSO-d 6 ) δ (s, 1H), 10.23(s, 1H), 8.47(s, 1H), 8.47(s, 1H), 7.86(d, 1H, 8.5 Hz), 7.56(d, 1H, J=1.5 Hz), 7.42 (dd, 1H, J=8.4 Hz); 13 C NMR(75 MHz, DMSO-d 6 ) δ , , , , , , , , Bromo-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3- carbaldehyde (4) 7-Bromo-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde(3, 1.2 g, 4.76 mmol) 을 DMF(19 ml) 에녹인뒤, 0 o C에서 60% sodium hydride(266 mg, 6.66 mmol) 을넣고 20분간교반한다. Methyl iodide(449 μl, 7.14 mmol) 을적가하고상온에서 12시간동안교반한다. 혼합물에 H 2 O을넣어반응을종결시키고감압여과장치를통해거른후동결건조시켜노란색고체 7-Bromo- 1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3-carbaldehyde(4, 1.2 g, 97%) 을얻었다. 1 H NMR(300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 10.26(s, 1H), 8.46(s, 1H), 7.91(d, 1H, J=8.4 Hz), 7.81(d, 1H, J=1.1 Hz), 7.51 (dd, 1H, J=8.4 Hz), 3.65(s, 3H); 13 C NMR(75 MHz, DMSO-d 6 ) δ , , , , , , , , , Diethylamino-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline- 3-carbaldehyde (5) 7-Bromo-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3- carbaldehyde(4, 200 mg, mmol) 을 DMSO(3 ml) 에녹인뒤, copper(i) oxide(53.8 mg, mmol), sodium tert-butoxide (144.7 mg, mmol), 그리고 diethylamine(233 μl, 7.52 mmol) 를넣고 90 o C에서 60시간동안가열교반한다. 혼합물을상온으로식힌후혼합물에 H 2 O을넣어반응을종결시켰다. EtOAc로추출하고유기층을 MgSO 4 를이용하여건조및감압농축하였다. 농축된혼합물을 MPLC를이용하여정제하여붉은색고체 7- Diethylamino-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3- carbaldehyde(5, 58.2 mg, 30%) 을얻었다. 1 H NMR(300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 1.26(m, 6H), 3.54(q, 4H, J=7.1 Hz), 3.68(s, 3H), 6.31(s, 1H), 6.68(d, 1H, J=9.1 Hz), 7.48 (dd, 1H, J=6.8 Hz), 8.23(d, 1H, J=7.8 Hz),10.38(s, 1H); 13 C NMR (75 MHz, DMSO-d 6 ) δ , , , , , , , , , 98.40, 56.20, Diethylamino-1-methyl-3-(pyridin-2-ylmethylenehydrazonomethyl)-1H-quinolin-2-one (6) 7-Diethylamino-1-methyl-2-oxo-1,2-dihydro-quinoline-3- carbaldehyde(5, 50 mg, mmol) 을 EtOH(1 ml) 에녹인뒤, pyridin-2-ylmethylene-hydrazine(27 mg, mmol) 을넣어주고상온에서 8시간동안교반하였다. 혼합물을감압농축시킨후 Vol. 62, No. 3, 2018

3 구리양이온을탐지하기위한퀴놀론형광프로브의합성및검증 155 MPLC로정제하여붉은색고체 7-Diethylamino-1-methyl-3- (pyridin-2-ylmethylene-hydra-zonomethyl)-1h-quinolin-2- one(6, 15 mg, 22%) 을얻었다. 1 H NMR(300 MHz, DMSO-d 6 ) δ 8.89(s, 1H), 8.7(d, 1H, J=6.3 Hz), 8.58(s, 1H), 8.49(s, 1H), 8.12(d, 1H, J=7.8 Hz), 7.93(d, 1H, J=8.5 Hz), 7.69(d, 1H, J=8.9 Hz), 7.5(dd, 1H, J=6.8 Hz), 6.78(d, 1H, J=9.1 Hz), 6.41(s, 1H), 3.63(s, 3H), 3.54(q, 4H, J=7.1 Hz), 1.19(t, 6H, J=6.9 Hz); 13 C NMR(75 MHz, DMSO-d 6 ) δ 169.2, 165.7, 163.7, 152.5, 149.9, 147.1, 143.5, 138.2, 135.8, 132.9, 127.6, 123.1, 121.9, 118.1, 108.9, 107.4, 58.2, 45.1, 14.3; HRMS (EI): m/z, calcd for C 21 H 23 N 5 O (M + ): ; found: 형광프로브 6의형광세기측정구리양이온의농도에따른프로브 6의형광세기를측정하기위해프로브 6(1 mm, 40 mm phosphate buffer, 0.1 M NaCl, ph 7) 과 1mM부터 5mM까지 Cu(ClO 4 ) 2 6H 2 O를 acetonitrile 에녹여서준비한다. 당량별로 2μL씩구리용액을프로브 6가녹아있는인산완충용액 (1998 μl) 에넣어주고 10분동안복합체가형성될시간을주었다 ( 프로브 6의최종농도 =1 μm, 구리이온의최종농도 =1~5 μm). 프로브 6의선택성을확인하기위해프로브 6(1 mm, 40 mm phosphate buffer, 0.1 M NaCl, ph 7) 과 Cu(ClO 4 ) 2 6H 2 O, Zn(ClO 4 ) 2 6H 2 O, Hg(ClO 4 ) 2 3H 2 O, Ni(ClO 4 ) 2 6H 2 O, CoCl 2 6H 2 O, FeCl 2 6 H 2 O, Cd(ClO 4 ) 2 6H 2 O, Pb(ClO 4 ) 2 3H 2 O을각각 acetonitrile 에녹여각각 5mM 금속용액을준비한다. 각각의금속용액 2 μl를프로브 6 가녹아있는인산완충용액 (1998 μl) 에넣어주고 10분동안복합체가형성될시간을주었다 ( 프로브 6의최종농도 =1 μm, 금속양이온의최종농도 =5 μm). 프로브 6와구리양이온복합체의결합화학양론을알아보기위해 Job plot 실험을수행하였다. 프로브 6(1 mm), 인산완충용액 (40 mm phosphate buffer, 0.1 M NaCl, ph 7) 과 Cu(ClO 4 ) 2 5 6H 2 O(1 mm) 을준비하고인산완충용액 (190 μl) 에프로브 6와구리양이온을첨가하여 10분동안복합체가형성될시간을주었다. 구리양이온의몰분율범위는 0.0부터 1.0까지조절하여형광세기를측정하였고프로브 6와구리양이온의전체농도는 50 μm을유지해야한다. Thermo Genesis 10S UV-Vis spectrum를이용하여여기 (excitation) 파장을측정하였고, 얻은파장값을 Perkin Elmer LS55 fluorescence detector를이용하여형광세기를측정하였다. 실험결과및고찰 (Results and discussion) 본연구에서퀴놀론유도체화합물은출발물질로 3-Bromophenylamine을이용하여아세틸화 (acetylation) 반응을통해 1번화합물을 92% 수율로얻었고 Vilsmeier-Haack 10) 반응을통해 2 Scheme 1 Synthesis of probe 6 J. Pharm. Soc. Korea

156 이석범 이남걸 최성욱 Table I Synthesis of 7-diethylamino-1-methyl-2-oxo-1, 2-dihydroquinoline-3-carbaldehyde via Buchwald-Hartwig reaction and Ullmann reaction.

NaOt-Bu, 110 o C 38 h 21 4 Et 2 NH, Cu 2 O, NaOt-Bu, DMSO, 90 o C, 60 h 30 Fig.

4 156 이석범 이남걸 최성욱 Table I Synthesis of 7-diethylamino-1-methyl-2-oxo-1, 2-dihydroquinoline-3-carbaldehyde via Buchwald-Hartwig reaction and Ullmann reaction. Entry Condition Yield (%) 1 Et 2 NH, Pd 2 (dba) 3, BINAP, Cs 2 CO 3, Toluene, 100 o C 16 h 7 2 Et 2 NH, Pd 2 (dba) 3, BINAP, Cs 2 CO 3, Toluene, 100 o C 48 h 21 3 Et 2 NH, CuI, Hydroxysuccinimide, NaOt-Bu, 110 o C 38 h 21 4 Et 2 NH, Cu 2 O, NaOt-Bu, DMSO, 90 o C, 60 h 30 Fig. 3 Fluorescence responeses of probe 6 (1 μm) in the presence of various metal ions (5 μm Cu 2+, Zn 2+, Hg 2+, Ni 2+, Co 2+, Fe 3+, Cd 2+, Pb 2+ in a buffer solution (40 mm phosphate buffer, 0.1 M NaCl, ph 7, λ ex =430 nm, λ em 번화합물을 36% 수율로얻었다. 2번화합물을산화 (Oxidation) 반응을통해 3번화합물을 90% 수율로얻었고 3번화합물을메틸화반응 (Methylation) 시켜 97% 수율로 4번화합물을얻었다. 5 번화합물은 Buchwald-Hartwig 반응과 Ullmann 반응을이용하여 30%, 21% 수율로얻었다 (Table I). 마지막으로프로브 6을하이드라존화 (hydrazonation) 반응을통해 22% 수율로얻었고 1 H NMR과 13 C NMR 분석방법을통해합성한화합물의명확성 을파악하였다. 합성한퀴놀론프로브 6을이용한수용액상의구리양이온검출을위해구리양이온을당량별로첨가하여형광측정을한결과, Fig. 2와같이구리양이온의농도가증가함에따라형광의세기가증가하는것을관찰하였다. 인체내의구리양이온과선택적으로결합하는지알아보기위해아연, 수은, 니켈, 코발트, 철, 카드뮴, 납과같은 7종의금속양이온을추가로첨가하여형광측정하였다. Fig. 3과같이수용액상에서프로브 6와구리양 Fig. 4 Job s plot for determining the stoichiometry of complex (Probe 6 Cu 2+ ). The total concentration of complex was 50 μm in a buffer solution (40 mm phosphate buffer, 0.1 M NaCl, ph 7, λ ex =430 nm, λ em 이온이있을경우가다른금속양이온들이있을때보다형광의세기가 5배정도차이가나는것을볼수있고다른금속양이온이복합체의형광의세기에영향을주지않는것을검증하였다. 프로브 6와구리양이온의결합화학양론값을알아보기위해일반적으로사용하는 Job s plot 실험을시행하였다. Fig. 4와같이프로브 6와구리양이온은 1:1로결합하는것을알수있다. LOD 값은 M로측정되었고그래프는일정하게증가하는것을확인하였다. 결론 (Conclusion) Fig. 2 Fluorescence responeses of probe 6 (1 μm) toward different concentration of copper cation in a buffer solution (40 mm phosphate buffer, 0.1 M NaCl, ph 7, λ ex =430 nm, λ em 현재퀴놀론은형광물질개발연구에서많이이용되는발색단이며의약품개발에서도중요한유도체로많이이용되고있다. 본연구에서사용된퀴놀론유도체는 N-(3-bromo-phenyl)- acetamide을출발물질하여아세틸화 (acetylation) 반응, Vilsmeier- Vol. 62, No. 3, 2018

5 구리양이온을탐지하기위한퀴놀론형광프로브의합성및검증 157 Haack 반응, 산화 (Oxidation) 반응등을통해합성하였고합성한퀴놀론유도체를이용하여수용액상에존재하는구리양이온존재하에서의특정파장의형광을측정하였으며구리양이온에대한선택성을형광세기변화로확인하였다. 구리양이온의농도가증가함에따라형광의세기가증가하는것이관측되었으며이는구리양이온과의복합체형성으로인한화합물의 C=N 이성질체화 (Isomerization) 가억제되어형광의세기가증가한다라고생각된다. 11) 다음실험으로몸속에서구리양이온이아닌다른금속양이온과결합을했을때형광을낼수있기때문에선택성이있는지, 또는프로브 6와구리양이온이복합체를형성하고다른금속양이온이형광세기에영향을미치는지를알아보려고 7종의금속양이온을프로브 6에첨가하여형광의세기를측정했다. 그결과다른금속들과복합체를형성하지않아형광의세기가높게나타나지않았고, 다른금속양이온들이복합체의형광세기에영향을미치지않는것을검증하였다. 마지막으로프로브 6와구리양이온의결합화학양론을측정하기위해 Job s plot 실험을하였다. 최고발광파장은몰분율이 0.5일때가장강한형광세기를나타냈으며이를통해프로브 6와구리양이온은 1:1의비율로결합하여우리가고안한복합체를형성하는것을알수있었다. 그러므로합성된프로브는서론에서언급한것처럼금속의양을측정하여질병의정확한진단과효과적인치료에도움을줄수있을것이다. 감사의글 (Acknowledgement) 본연구는충남대학교의학술연구비지원을받아수행되었으며이에감사드립니다. References 1) Bertini, I., Cavallaro, G. and McGreevy K. S. : Cellular copper management a draft user's guide. Coord. Chem. Rev. 54, 506 (2010). 2) Mathie, A., Sutton, G. L., Clarke, C. E. and Veale, E. L. : Zinc and copper: pharmacological probes and endogenous modulators of neuronal excitability. Pharmacol. Ther. 111, 567, (2006) 3) Puig, S. and Thiele, D. J. : Molecular mechanisms of copper uptake and distribution. Curr. Opin. Chem. Biol. 6, 171, (2002) 4) Marbach, K. Fernández-Larrea, J. and Stahl, U. : Reversion of a long-living, undifferentiated mutant of Podospora anserina by copper. Curr. Genet. 26, 184, (1994). 5) Brown, D. R., Qin, K., Herms, J. W. and Madlung, A. : The cellular prion protein binds copper in vivo. Nature. 390, 684, (1997). 6) Gaggelli, E., Kozlowski, H., Valensin, D. and Valensin, G. : Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis). Chem. Rev. 106, 1995, (2006). 7) Li, Y., Togashi, Y., Sato, S., Emoto, T., Kang, J., Takeichi, N., Kobayashi, H., Kojima, Y., Une, Y. and Uchino, J. : Spontaneous hepatic copper accumulation in Long-Evans Cinnamon rats with hereditary hepatitis. A model of Wilson's disease. J. Clin. Invest. 87, 1858, (1991) 8) Choo, X. Y., Alukaidey, L., White, A. R. and Grubman, A. : Neuroinflammation and copper in Alzheimer s disease. Int. J. Alzheimers. Dis. 2013, 1, (2013). 9) Pal, A. and Prasad, R. : An overview of various mammalian models to study chronic copper intoxication associated Alzheimer s disease like pathology. Biometals. 28, 1, (2015) 10) Srivastava, A. and Singh, R. : Vilsmeier-Haack reagent: a facile synthesis of 2-chloro-3 formylquinolines from N-arylacetamides and transformation into different functionalities. Indian J. Chem. 44B, 1868, (2005) 11) Wu, J. S., Liu, W. M., Zhuang, X. Q., Wang, F., Wang, P. F., Tao, S. L., Zhang, X. H., Wu, S. K. and Lee, S. T. : Fluorescence turn on of coumarin derivatives by metal cations: a new signaling mechanism based on C= N isomerization. Org. Lett. 9, 33, (2007). J. Pharm. Soc. Korea

이주형.PDF

이주형.PDF Synthesis of Fluorobenzene Derivatives Containing Cyclopropane Ring 2002 Synthesis of Fluorobenzene Derivatives Containing Cyclopropane Ring 2002 2002 Spiperone D 2 antagonist. Cyclopropylation Spiperone