(72) 발명자김은혜경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 나용주경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 강승현경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 채병근경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 한상훈경기도용인시기흥구용구대로 1920

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정성 도
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2013년06월04일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/97 ( ) A61Q 19/08 ( ) A61Q 19/00 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2011 년 11 월 25 일 심사청구일자 없음 전체청구항수 : 총 4 항 (71) 출원인 ( 주 ) 아모레퍼시픽 서울특별시중구청계천로 100 ( 수표동 ) (72) 발명자 강현서 경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 고명진 경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 윤동열 (54) 발명의명칭구주아욱추출물또는자작나무수액을함유하는피부항상성유지및노화예방용화장료조성물 (57) 요약 본발명은피부항상성유지와노화예방에도움을주는화장료조성물에관한것으로, 보다상세하게는구주아욱추출물또는자작나무수액을함유하여자외선에의해시간대별발현이감소된유전자를정상화시킴으로써피부세포항상성유지와노화예방효과를가지는화장료조성물에관한것이다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자김은혜경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 나용주경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 강승현경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 채병근경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) 한상훈경기도용인시기흥구용구대로 1920 ( 보라동 ) - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 구주아욱추출물및자작나무수액중 1종이상을유효성분으로함유하는피부항상성유지용화장료조성물. 청구항 2 구주아욱추출물및자작나무수액중 1종이상을유효성분으로함유하는피부탄력개선용화장료조성물. 청구항 3 구주아욱추출물및자작나무수액중 1종이상을유효성분으로함유하는항노화또는항산화용화장료조성물. 청구항 4 제 1항내지제 3항중어느한항에있어서, 상기유효성분은조성물총중량에대하여 0.001~70중량 % 의양으로함유되는화장료조성물. 명세서 [0001] 기술분야본발명은피부항상성유지와노화예방에도움을주는화장료조성물에관한것으로, 보다상세하게는구주아욱추출물또는자작나무수액을함유하여자외선에의해시간대별발현이감소된유전자를정상화시킴으로써피부세포항상성유지와노화예방효과를가지는화장료조성물에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술인간의피부를구성하는세포는크게 3가지로, 표피의대부분을차지하고있는각질형성세포 (keratinocyte), 피부색소인멜라닌 (melanin) 을생성하는멜라닌형성세포 (melanocyte), 진피층을형성하고있는섬유아세포 (fibroblast) 가바로그들이다. 그중, 각질형성세포는피부의최외각층부터표피층의대부분을형성함으로써, 피부의수분증발을억제하고외부유해인자로부터피부를지켜주는수분유지기능그리고장벽기능과연관이깊다. 피부유전학연구를통해각질형성세포에서는수가지유전자들이존재하여표피기능유지에영향을준다는사실이밝혀져있다. 모든생물체는외부환경에따른다양한반응이일어나는데그중에서도생체내에서환경에의해인지된낮과밤의주기는신진대사, 생리학적인반응을주관하는데에중요한역할을한다. 생체리듬 (circadian rhythm) 이란생체내에서특정기간 ( 일반적으로 24시간 ) 을주기로하여반복적으로분자생물학적인반응이일어나는유형을일컫는용어로신체의신진대사를조절하고정상적으로유지하는데에필수적이다. 생체주기는세포수준에서도자동적으로일어나고있으며, 이는세포내에서주기적으로생성되는전사번역피드백루프 (transcriptional/translational feedback loop) 를통해형성된다. 생체리듬유전자의종류로는 Per(Period), tim(timeless), Clock, bmal1/mop3 및 Cry 등이보고되어있다. 최근연구에따르면이유전자중 Per, Clock, bmal1/mop3와같은유전자가피부에서발현된다는사실이보고되고있으며이유전자들이피부생체주기리듬을조절하는기능을하는것으로알려져있다. 특히, Bmal1/mop3(Brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator(arnt)-like protein-1) 은세포수준에서생체리듬을조절하는기능을가진서커디안전사제어인자 (circadian transcriptional regulator) 로, Clock 단백질과헤테로다이머로결합하여 Per 유전자와 Tim 유전자의전사를조절하여하위에다양한생체리듬관련유전자와신진대사조절기전을조절하는것으로알려져있다. 최근에는 Bmal1/mop3 유전자의발현이감소되는경우, 수명감소와더불어노화의현상으로알려져있는근육감소증, 백내장, 피하지방감소현상이나타나고, 발현이감소된조직에서활성산소종 (Reactive Oxygen Species) 의증가현상이생체내 (in vivo) 에서확인됨으로써, Bmal1/mop3이조기노화또는노화관련질병을막는데에중요한역할을하는것으로밝혀졌다

4 선행기술문헌 [0004] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 국내공개특허제 호 발명의내용 [0005] [0006] 해결하려는과제이에본발명자들은피부세포내에서 Bmal1/mop3 유전자를활성화시킨다면, 피부의노화를억제하고피부세포의생체리듬을다시젊은상태로되돌릴수있을것으로생각하고, 천연물질중에서피부항상성유지및피부노화예방에도움을줄수있는물질을찾고자하였으며, 구주아욱추출물과자작나무수액이자외선에의해발현이감소되어흐트러진생체리듬을회복시키는우수한능력이있어피부항상성유지및노화예방효과가있음을발견하여본발명을완성하였다. 따라서, 본발명은구주아욱추출물또는자작나무수액을함유함으로써피부항상성유지및피부노화예방에도움이되는화장료조성물을제공하는것을목적으로한다. [0007] 과제의해결수단 상기한목적을달성하기위하여, 본발명은구주아욱추출물및자작나무수액중 1 종이상을유효성분으로함 유하는피부항성성유지, 피부탄력개선, 항노화또는항산화용화장료조성물을제공한다. [0008] 발명의효과본발명의조성물에사용되는구주아욱추출물과자작나무수액은자외선에의해발현이감소되는유전자의발현을정상화시켜생체리듬을회복시키는능력이우수하므로, 본발명의조성물은피부세포의항상성유지와노화예방에효과적이다. [0009] 도면의간단한설명 도 1 은 Bmal1/mop3 에대한시간대별유전자발현량을나타낸것이다. [0010] [0011] [0012] [0013] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명의조성물은구주아욱추출물또는자작나무수액을유효성분으로함유하여피부항상성유지및피부노화예방에효과적이다. 구주아욱은아욱과아욱속에속하는 1년생또는 2년생식물로학명은 Abelmoschus moschatus/hibiscus abelmoschus이다. 영어로는머스크맬로라고부른다. 키가 0.6~1.8m 정도자라며노란색의큰꽃이피는데가운데가빨갛다. 구주아욱은인도가원산지이며아시아열대지역에서씨를얻기위해널리재배하고있다. 씨는향수를만드는재료로쓰이고일부지역에서는설탕을정제할때쓰는섬유를뽑아내기도한다. 상기구주아욱추출물은구주아욱의꽃, 잎또는씨의추출물을특징적으로포함하며, 구주아욱추출물을얻기위한추출방법은다음과같다. 먼저구주아욱나무의꽃, 잎또는씨를정선하고분말화하여약 20배량의추출용매에서추출한후원액을여과하는등의방법을통하여추출물을얻는다. 이때사용한추출용매에는정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸에테 - 4 -

5 르, 디클로메탄으로이루어진군으로부터선택된 1 종이상의용매를혼합하여추출에사용할수있다. [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] 자작나무는쌍떡잎식물참나무목자작나무과의낙엽교목으로학명이 Betula platyphlla var. japonica이며, 나무껍질은회백색이고여러층의얇은껍질로조성되었으며쉽게벗겨지고내피는등황색이다. 가지는항상아래로쳐져있고적갈색이며광택이있다. 잎은어긋나고보통 2개의잎이한곳에함께나며, 삼각모양둥근달걀꼴이거나달걀모양이며길이는 3~7.5cm이고끝은점차뾰족해지거나꼬리모양으로점차뽀족해진다. 기부는쐐기모양이거나넓은쐐기모양이거나절단형이고가장자리에는이중톱니가있으며털이없다. 측맥은 6~8쌍이고, 수상화서는액생혹은정생한하며, 과서는원기둥모양이고길이가 1~3cm이며아래로드리워진다. 꽃떡잎은 3개로갈라졌는데가운데의갈라진조각은삼각형이며옆의갈라진조각은아래로구부러지고가운데의갈라진조각보다길다. 작은견과는달걀모양이고막질인날개의너비는열매의 2배이다. 나무껍질을백화피라하며, 자작나무의성분으로는수피에트리테르페노이드 (triterpenoid) 의베툴라폴리덴트리올 (betulafolienetriol), 베툴라폴리엔테트라올 (betulafolienetetraol), 베툴린 (betulin), 아세로시드 (aceroside), 아세로제닌 II(acerogenin II), 담마레네디올 II-3-카페에이트 (dammarenediol II-3-caffeate), 담마레네디올 II-3-p-쿠마레이트 (dammarenediol II-3-p-coumarate), 옥틸롤 II-3-카페에이트 (octillol II-3- caffeate) 등을함유하며, 잎에는정유를함유하는것으로보고되어있다. 자작나무는예로부터열독창, 상한시행, 황달, 폐풍독, 통풍, 류머티증, 피부약, 방부약, 종기치료, 타르 (tar) 의제조원료및이뇨제로쓰이고있다. 자작나무수액은땅속에서나무의줄기를통하여잎으로올라가는액을말하며잎이나기전인이른봄에채취한다. 자작나무수액은낮과밤의기온차가 10~15 일때나무의증산작용으로수액채취가가장용이하며, 시기적으로는지역, 위치, 기상상태에따라차이가있을수있으나 4월 20일 ( 곡우 ) 전후 10일이다. 자작나무직경 10cm 당연간약 7.5L를채취할수있다. 자작나무수액의채취방법은지상 30cm 정도나무줄기를 V자형으로자르고홈을내어채취하는사구법과지상 30cm 정도나무줄기에지름 1.2cm 깊이 1.5cm 깊이의천공을낸후호스를연결하여채취하는천공법이있다. 자작나무수액은예로부터한국, 일본, 러시아등지에서음용되어왔다. 본발명의화장료조성물은구주아욱추출물및자작나무수액중 1종이상을유효성분으로함유한다. 상기구주아욱추출물은아욱과식물인구주아욱의씨또는꽃추출물을특징적으로포함한다. 자작나무수액은자작나무과식물인자작나무의줄기를통하여잎으로이동하는액을말한다. 또한, 상기유효성분은조성물총중량에대하여 0.001~70중량 % 의양으로함유한다. 이는 0.001중량 % 미만이면제형내에서의효능이미미하고, 70중량 % 초과이면제형안정성이떨어지기때문이다. 본발명에의한화장료조성물은그제형에있어서특별히한정되는바가없으며, 예를들어, 클렌저, 오일, 로션, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 팩, 젤, 에센스등다양한피부점착타입화장료제형을가질수있다. [0019] 이하, 시험예및실시예를들어본발명을보다상세히설명하지만, 본발명이이들예로만한정되는것은아니 다. [0020] [0021] [0022] [ 시험예 1] 유전자활성화효과피부세포에서의구주아욱추출물, 자작나무수액각각의효능을확인하기위하여인간표피층각질형성세포세포주인 HaCaT(human adult low calcium temperature) 세포를사용하였다. 유전자로는 Bmal1/mop3을선정하였다. 구주아욱추출물또는자작나무수액성분은세포독성평가를위해 WST-1 어세이를수행하였다. HaCaT 세포를 24시간배양후, 다양한농도의구주아욱추출물또는자작나무수액성분이포함된세포배양배지를처치하고 24시간후로슈사의 WST-1(Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 을 10μl 처리한다음, 4시간반응시켰다. 그후몰큘러디바이스사의엘라이저리더 (SpectraMax 190 ELISA reader, Molecular Devices Corporation, USA, CA) 를사용해흡광도를측정하여 (OD450 - OD690) 값을산출후대조군과비교하여세포생존율을결정하였다. 그결과, 80% 이상의세포생존을보이는농도는구주아욱추출물에서는 100ppm 이하, 자작나무수액은 50ppm 이하임을확인하였으며, 이후실험에서는각각시약의처치농도를 WST-1 어세이에서확인된세포독성을 - 5 -

6 보이지않는최대농도에서수행하였다. [0023] HaCaT 세포를 24 시간동안배양한다음, 구주아욱추출물 100ppm 또는자작나무수액성분 50ppm 이포함된세포 배양배지 2ml 를처치하고 24 시간후 10ml 의인산염완충액 (Phosphate Buffered Saline, PBS) 으로세포를두 번세척하고, UVB 20mJ/cm 2 를조사하였다. 조사직후 (0 hour) 세포를수거하고, 구주아욱추출물또는자작나무수액성분을포함한배지 2ml를다시처치해 3시간, 6시간, 9시간을추가로배양한후세포를각시간대별로수거하여 10ml의인산염완충액 (Phosphate Buffered Saline, PBS) 으로세포를두번세척하고, 키아젠사의 RNA 키트 (Qiagen RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA) 를사용하여, 세포내의전체 RNA(total RNA) 를분리하였다. 분리된 RNA는인비트로젠사의역전사키트 (Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit, Invitrogen, Carlsbad, CA) 를이용하여 cdna를합성하고, 실시간역전사중합효소연쇄반응 (real time-reverse transcription polymerase chain reaction, Q-RT-PCR) 으로 Bmal1/mop3 유전자발현변화를정량적으로분석하였다. 유전자발현패턴변화는어플라이드바이오시스템사의택맨유전자발현시스템 (TaqMan gene expression assay kit, Applied Biosystems, ForsterCity, CA) 을이용하여평가하였다. 프라이머로는 Bmal1/mop3 : Hs _m1을사용하였다. 세포에서 Bmal1/mop3이발현된양을실시간 PCR로확인한결과는도 1에나타내었다. [0024] 도 1에서보는바와같이, 각질형성세포내 Bmal1/mop3 유전자가 UVB 조사에의해감소되었을경우, 구주아욱추출물또는자작나무수액성분에의해발현수준이다소회복됨을확인할수있었다. 구주아욱추출물의경우, UVB 조사만한실험군에비하여 Bmal1/mop3 유전자의발현을현저하게증가시켰고, 자작나무수액의경우유사한수준으로 Bmal1/mop3 유전자의발현을증가시켰다. [0025] [0026] [ 참고예 ] 실시예 1~3 및비교예 1 의제조 하기표 1 에기재된조성에따라실시예 1~3 및비교예 1 을제조하였다. 단위는중량 % 이다. [0027] 성분 원료명 실시예 1 실시예 2 실시예 3 비교예 1 수상성분 구주아욱추출물 자작나무수액 정제수 To 100 To 100 To 100 To 100 디소듐이디티에이 글리세린 잔탄검 메칠글루세스 펜틸렌글라이콜 글리세레스 암모늄아크릴로일디메칠타우레이트 / 브이피코폴리머 에탄올상성분 에탄올 하이드로제네이티드캐스터오일 향 방부제 표 1 [0028] [0029] [0030] [0031] < 실시예 1 및비교예 1~3의제조방법 > (1) 수상성분들을실온상에서균일하게혼합하였다. (2) 에탄올상성분들을가열 (50~55?) 하여균일하게용해및혼합하였다. (3) 교반하에상기 (2) 에상기 (1) 을투입하여균일하게가용화한다. [0032] [0033] [ 시험예 2] 피부탄력개선효과 실제사람의피부에서의탄력개선효과를시험하기위하여상기실시예 1~3 및비교예 1 을이용하여다음과같 이시험하였다. 30~40 대여성 60 명을각각 15 명씩 4 조로나누고각조에실시예 1~3 및비교예 1 을나누어준 - 6 -

7 후, 아침저녁매일 2 회씩 4 주간안면에도포하게하였다. 4 주후피부탄력측정기 (Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany) 를이용하여피부탄력개선효과를측정하였으며, 그결과는하기표 2 에 나타내었다. 표 2 의결과값은피부탄력측정기의피부점탄성 (viscoelasticity) 의성질을의미한다. 표 2 [0034] 시험물질 피부탄력효과 실시예 ±0.10 실시예 ±0.09 실시예 ±0.10 비교예 ±0.12 [0035] 상기표 2의결과에서보여지는바와같이, 같이구주아욱추출물과자작나무수액을각각함유한경우비교예 1 대비 170% 이상의피부탄력증진효과를나타내었다. 구주아욱추출물과자작나무수액을동시에함유한실시예 1을사용한경우에는비교예 1 대비 250% 가량피부탄력증진효과를나타내어가장우수한효능을보임을알수있었다. [0036] [0037] [ 시험예 3] 주름개선효과상기표 1의실시예 1~3 및비교예 1의주름개선효과를알아보기위하여다음과같이평가하였다. 30대여성 40 명을각각 10명씩 4조로나누어아침저녁매일 2회씩 8주간지정된눈가부위에실시예 1~3 및비교예 1을각각도포하게한후, 실리콘재질의모사판 (replica) 을제작하여지정부위의주름의상태를화상분석기인비지오미터 (visiometer : SV60, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany) 로측정하였다. 그결과를하기표 3 에나타내었으며, 이결과는 8주후의각각의파라미터 (parameter) 값에서 8주전파라미터값을뺀것의평균을나타낸것이다. 즉, 이값이음수가나올수록주름개선효과가높다는것을의미한다. [0038] 구분 R1 R2 R3 R4 R5 실시예 실시예 실시예 비교예 표 3 [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] R1 : 주름등고선의최고치와최저치의차이값 R2 : 주름등고선을임의로 5칸씩나눈후그중 R1값들의평균 R3 : 5개씩나눈 R1값중최고치 R4 : 주름등고선의기선 (baseline) 에서각각의꼭대기와계곡의값을뺀평균값 R5 : 주름등고선의기선에서각각의주름윤곽을뺀값의평균값 [0044] [0045] 상기표 3에표시된바와같이, 구주아욱추출물과자작나무수액을포함한화장료조성물은비교예 1에비하여피부주름개선효과가탁월하였으며, 특히구주아욱추출물과자작나무수액을모두함유한실시예 1의조성물을도포하였을경우피부주름개선효과가가장우수하였다. 또한, 실시예 1~3, 비교예 1에대해별도로실시한피부안전성평가에서, 본발명의화장료조성물은피부에대한안전성역시우수한것으로나타났다

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Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,