Vol. 9 No. 12 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 아시아에서유행하는타이간흡충 (Opisthorchis viverrini), 그리고러시아및유럽일대에서유행하는고양이간흡충 (Opisthorchis felineus) 이그원인병원체들이다. 이
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1 간흡충증진단법성능향상과최신개발동향 질병관리본부국립보건연구원면역병리센터말라리아기생충과주정원, 이명노, 조신형, 박미연 * * 교신저자 : miyeoun@korea.kr/ Abstract Improvement and recent status of clonorchiasis diagnostics development Division of Malaria and Parasitic Diseases, Center for Immunology and Pathology, NIH, CDC. Ju Jung-Won, Lee Myoung-Ro, Cho Shin-Hyeong, Park Mi-Yeoun BACKGROUND: Clonochis sinensis, a kind of liver fluke, is a parasite that causes the highest infection rates in Korea. Based from the results of the 8th nationwide survey of intestinal parasites, it is estimated that one million people have been infected with C. sinensis. Chronic infection of C. sinensis causes abnormal liver function and induces cholangiocarcinoma. Therefore, it is important to accurately and rapidly diagnose clonorchiasis caused by C. sinensis infection. METHODOLOGY/RESULTS: Among several diagnostic tools for clonorchiasis, microscopic examination is used as the standard. Although microscopic examination is accurate, its disadvantage is that it requires a well-trained professional staff and above Biosafety Level 2 laboratory to properly diagnose the infection. Accordingly, several kinds of diagnostic tools and materials have been researched and developed. We tried to identify simple strategies in order to detect this parasitic infection. In this regard, we collected relevant references related to diagnosis of clonorchiasis and compared the respective advantages and disadvantages. Moreover, we conducted various experiments to develop more effective diagnostic means. Through high throughput approaches, we identified various antigenic proteins and peptides applicable to sero-diagnostic development for clonorchiasis. CONCLUSION: This report provides the recent methodological advances and the identification of antigens. The integration of data from specific genes, antigens, and metabolites of C. sinensis might bring important information for the development of rapid and simple diagnosis of clonorchiasis. 들어가는말 간흡충증은아직도우리나라에서 100 만명의감염자가있을 진단법개선필요성과현재다양하게이루어지고있는연구개발 현황을살펴보고이를바탕으로한관리전략을고찰해보고자 한다. 것으로추산되는주요기생충감염병이다. 간흡충감염의 진단은현재분변충란검출법이표준검사법이며, 혈액에서간흡충특이항체를검출하는 ELISA 검사법이상용화되어있다. 하지만충란검출및 ELISA 검사법은일정기준요건을갖춘실험실과장비를필요로하며, 고유행지역에서감염여부를신속하고간단하게진단할수있는간편진단법의구축은아직이루어지지않고있다. 이번글에서는간흡충감염퇴치를위한 몸말 사람에게감염되어간흡충증을일으키는종류에는크게 3종류가있는데우리나라뿐만아니라중국남부와베트남북부에서도유행하는중국간흡충 (Clonorchis sinenesis), 베트남남부, 라오스, 캄보디아와태국을포함하는동남 206
2 Vol. 9 No. 12 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 아시아에서유행하는타이간흡충 (Opisthorchis viverrini), 그리고러시아및유럽일대에서유행하는고양이간흡충 (Opisthorchis felineus) 이그원인병원체들이다. 이들중특히중국간흡충과타이간흡충은유행지역에서심각한공중보건문제를일으키는데만성감염에의해간담도에서섬유화를일으키고담도암을유도할수있는높은관련성으로인해국제보건기구 (W HO) 산하국제암연구위원회 (I A RC) 에서는간흡충을 1급발암인자로분류하였다 [1]. 유행지역에서간흡충만성감염의공중보건학적인위협을해소하기위해서는다각적인관리노력이수반되어야한다. 질병관리본부에서는 1971 년시작된전국장내기생충감염실태조사를바탕으로간흡충의감염현황을파악하고, 고유행지역주민을대상으로매년중점관리사업을전개해오고있다. 회충을포함한토양매개기생충이전국조사및치료제배포사업을통해퇴치수준 ( 감염률 1% 이하 ) 을유지하고있는데반하여, 간흡충감염률은 1971년 4.6% 에서 1976 년에 1.8% 로감소하였으나, 그이후조사에는 2% 내외로유지되고있다 [2](Figure 1). 간흡충감염의퇴치가쉽지않은이유는감염경로와 관리체계의어려움을이야기할수있겠다. 유충이감염된민물고기를생식하여일어나는간흡충증은식품매개성이란기호습관때문에감염위험을쉽게낮추기어려운실정이다. 일반적으로약국에서개인이쉽게구매하여복용할수있는기생충치료제는회충등선충류를대상으로하는것이다. 이와같은선충류에효과적인치료제는간흡충의구충효과가없으며, 간흡충감염치료를위해서는검체에서충란을검출하는진단과정을거쳐의사처방으로흡충류에효과가있는치료제인프라지콴텔 (Praziquantel) 을복용해야한다. 분변수거후현미경검경을통한충란검출까지의복잡한진단과정은진단후치료제처방이라는관리절차에서가장어려운과정에속한다. 질병관리본부말라리아기생충과에서는간흡충감염률이높은지역을선정하고각지역보건소와연계하여연간 4만명의주민을대상으로집중적인검체수거, 진단검사및치료제배포를진행하고, 홍보및예방교육등을실시해왔다. 이를통해고유행지역에서의감염률을 10% 에서한자리수대로낮추는성과를나타내고있으나, 1% 이하의퇴치수준에도달하기에는현재의관리체계로는한계가있다. 각유행지역에서 Total Parasites Clonorchis sinensis Positive rates (%) Year Year Figure 1. The results of nationwide survey on intestinal parasites infection in Korea. The infection rate of intestinal parasites has been decreased dramatically (left pannel). The infection rate of C. sinensis has been continued to represent 1~3% range (right pannel). This figure was modified from Ref. #
3 검체수집을통한중앙집중식실험실진단및치료를실시하는실험실진단체계로서는퇴치수준으로감염을낮추기는어렵다. 진단실험실을각유행지역에설치운영하여진단및치료제배포기간을크게줄이면감염률을낮추는데도움이될것이지만, 이를위해수반되어야하는시설구축및전문인력운용을위한예산투입등이효율적일것인가에대한이견이있는실정이다. 이런난관을돌파하기위한방안중의하나로진단법의간편화를제안할수있다. 감염률을더낮추기위해서는개인이감염여부를쉽게확인할수있는기술개발과치료가뒤이어이루어질수있는관리체계개선을고려해야한다. 진단법간편화는검체수거및진단대기등에소요되는시간과노력을크게감소시켜유행지역에서직접적이고자체적인관리를가능케하고, 감염예방교육및홍보효과를상승시키는요인이될것이다. 간흡충감염여부를보다간편하게진단하기위해연구개발되고있는다양한진단법을살펴보면다음과같다. 분변에서충란을직접현미경으로관찰하는것이현재까지는가장정확한진단법이지만앞서언급했듯이이를위해선생물안전 2등급이상의실험실과숙련된진단인력이필요하다. 또한, 현미경검경을통한실험실진단은대량집단검사에적합하지않고, 투약후적은수의충란배출시에는진단 민감도가낮아지는등의단점이있다. 이를개선하기위해분변이나혈액에서간흡충에특이적인항체, 항원또는유전자를진단하는방법들이연구개발되어왔다 (Table 1). 피낭유충감염 6-8 주후에담관에서성충으로자란간흡충은충란을분변으로배출하고, 이기간동안숙주의면역체계는간흡충항원에특이적인항체를생성하여대응한다. 따라서분변에는충란및항원등을포함하는간흡충유래물질이포함되어있을것이며, 혈액에는간흡충특이항체가존재할것이다. 간편진단법의개발은이러한간흡충유래물질을간단하고신속하게검출하는것에목표를두고있다. 검체에따른각진단법의간단한원리와연구개발현황을소개하겠다. 먼저, 분변검체에서간흡충란의유전자를검출하는유전자증폭법 (PCR) 과간흡충유래항원을특이적으로결합분석하는 Copro-ELISA 검사법이있다. 분변에서충란을현미경검경하는대신유전자를검출하는 PCR 진단법연구는간흡충유전자에대응하는특이유전자절편의개발과분변에존재하는유전자중합억제요소의제거에집중되고있으며, 민감도가불안정한 PCR 검사법한계극복이문제점이라할수있다. 분변에서간흡충특이항원에항체를결합시킨후, 이결합물을분리하여검출하므로서감염여부를확인할수있는원리의 Copro-ELISA 진단법은보다간편한검사법이지만, 항원과보다안정하게결합할수있는민감도 Table 1. The current status of diagnosis for clonorchiasis Samples Target Method Ref. Remarks Stools Kato-katz smear (3, 7) Standard diagnosis egg MGL (4) Standard diagnosis Gene Real Time PCR (5) Research Antigen coproantigen caputre ELISA (6) Research Antibody IgG-ELISA (7,10) Development Serum Antigen IgY-IMB-ELISA (8) Research Metabolite screening 단계 - Research Urine Clinic Antigen urine Ov-ES assay (9) Research Metabolite screening단계 - Research Skin Intradermal testing (10) Secondary clinical diagnosis Liver & Bile ducts ultrasonography (11) Secondary clinical diagnosis 208
4 Vol. 9 No. 12 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 높은항체의개발과항원- 항체결합물을간편하고효율적으로분리할수있는정제과정의개선이필요하다. 또다른접근으로영상진단을들수있다. 영상진단은대부분의임상진단기관에서운용하고있는초음파기기를활용하여간내담관의두꺼워짐정도등을척도로간흡충의감염여부를진단하는방법이다. 이방법역시전문가의역량에크게의존적이라는단점이있어임상에서쉽게활용할수있는간편진단법에대한연구개발이더필요한상황이다. 분변이외에혈액을검체로하여혈청학적인진단을시도하는연구들이진행되어왔다. 초창기에피내반응검사 (intradermal test 또는 skin test) 가보조적임상진단수단으로활용되었는데, 간흡충성충의파쇄물인조항원을피부에주사하여면역반응을통해피부가부어오르는정도를측정하여감염여부를판단하는진단법으로정확도가크게떨어져최근에는거의사용하지않는다. 이후에혈액에서간흡충특이항체를검출하는검사방법에대한연구들이이루어져왔으며, 현재간흡충조항원을기반으로하는항체진단키트가상용화되어있다. 이 검사방법의단점은지속적인간흡충조항원확보노력과균일한품질관리가필요하다는것이다. 또한특이항체를검사하는원리이기때문에과거에감염되었던사람이이검사를통해양성으로확인될수있다는단점도있다. 그리고확진이가능한정도로민감도가높지않아이를향상시켜야한다는숙제가있으며, 검사를위해고가의분석장비가필요하다는점도간편진단이라는측면에서단점이라할수있겠다. 하지만혈액을이용한다는것은쉽게검체를얻을수있다는잇점이있으므로이러한단점을극복하기위한연구가진행되고있다. 간흡충의파쇄물인조항원을대체하기위한민감도와특이도가높은항원단백질을발굴하는노력과간흡충감염치료전후를구분할수있는항체검사를위해감염환자혈청에존재하는항체의발현변화를추적하는연구등이진행되고있다. 질병관리본부말라리아기생충과에서는 20여종에달하는항원단백질을발굴하였으며, 이를바탕으로민감도와특이도가높은항원조합물을개발하고있다 (Figure 2). 또한감염정도를항체발현에따라다섯종류로분류하고항체변화 Clonorchis sinensis Proteins Peptides 2DE analysis Text mining Bioinformatics Candidate (4) Candidate (29) Expression (4) Expression (16) Antigen (3) Legumain PCC Antigen (15) Venom 1-3 Tegu 1-5 TIM, CsHCC CsRNP CsNAGAL CsOCIA1 HSP70 HSP90 Candidate (76) Expression (43) Sp7, Sp10 Sp39 Sp32 Sp40 Antigen(9) CsTA4589 CSTA14248 CsTA37 CsTA422 Candidate (103) Tandem Repeat Sequence Proteins Epitope mapping (9) Cysteine proteinase TIM, CsRNP CsVAL2, 3 / Tegu1 ~ 4 Candidate (8) Immunogen (3) Tegu4, HSP70, HSP90 27 antigens Diagnostics & Vaccine Resources Synthesis (53) Epitope (33) CsRe1 ~ 12 CysP 1 ~ 4 CsVAL2p-e1 ~ 4 TIMp-e1 ~ 5 Figure 2. The identification of antigens and epitopes for diagnosis of clonorchiasis. Antigenic candidates have been targeted through proteomic and bioinformatic analysis and 27 proteins and 33 peptides identified as antigen for clonorchiasis
5 원인을분석중에있다. 항원개발과항체변화에대한분석이종료되는시점에서는혈액을이용한간편진단키트개발이가능할것으로기대하고있다. 이외에도혈액에서특이항체가아닌간흡충유래특이항원을검출하여과거감염자를양성으로판정하는단점을극복할수있다는연구보고가있으나, 혈액에미량존재하는항원을검출할수있는민감도높은항체개발이어려운점이다. 최근의연구는병원체및감염숙주에서유래하는엑소좀 (exosome) 과같은분비성과립에서진단물질을발굴하는추세이다. 엑소좀에는병원체고유의유전자 (mirna, DNA) 와단백질이존재하고있고, 체액에분비되어진단활용에용이한장점이있기때문이다. 질병관리본부에서도간흡충과같은기생충을대상으로엑소좀에포함된물질을분석할예정이며, 성공적인연구결과가나타나면소변을통해임신여부를간단히확인하는것처럼혈액이나소변에서간흡충감염여부를개인이쉽게확인할수있을것으로기대한다. 맺는말 간흡충증은감염후증상이바로나타나지않는만성감염질환이지만담관암의원인일정도로간및담도건강에는크게위협적이다. 따라서간흡충만성감염에대해민감도높고간편한진단법을개발한다면그위험을해소하는데크게기여할것이다. 우리나라는간흡충퇴치집중관리사업초기에는분변 1그램당충란수 (Egg per gram, EPG) 로표기되는간흡충감염강도가대부분중감염이었으나, 집중적인사업결과최근감염강도는 100 EPG 이하로낮은경향성을보이고있다. 이단계에서는중앙집중식진단및치료제배포사업과병행하여고유행지역에서의현장진단체계를구축하여관리수준을확대하여야간흡충퇴치라는목표수준에도달할수있을것이다. 이를뒷받침하기위해서는경감염에대해높은민감도를나타내는간편진단법의연구와개발이지속적으로이루어질필요가있다. 질병관리본부에서는항원단백질을활용한간편혈청진단법개발외에도, 대사체및분비과립 등에서진단물질발굴등의다각적인노력을진행할계획이다. 참고문헌 1. IARC. A Review of Human Carcinogens: Biological Agents. IARC Monogr Eval Carcinog Risks Hum. 2012; 100(B): Korea Centers for Disease Control and Prevention. Korea Nation Institute of Health National survey of the prevalence of intestinal parasitic infections in Korea, The 8th Report. Osong Chungcheongbuk-do, Korea. 3. Hong, S. T., et al. (2003). The kato-katz method is reliable for diagnosis of Clonorchis sinensis infetion. Diagnostic and Infectious Disease, 47, Cho, S. H., et al. (2008). Prevalence of Clonorchiasis in Southern Endemic Areas of Korea in Korean J Parasitol, 46(3), Cai, X. Q., et al. (2014). Rapid Detection and Differentiation of Clonorchis sinensis and Opisthorchis viverrini Using Real- Time PCR and High Resolution Melting Analysis. The Scient World J, Rahman, S. M. M., et al. (2012). Coproantigen capture ELISA for detection of Clonorchis sinensis infection in experimentally infected rats. Parasitol Int, 61(1), Han, S. et al. A Combination of the Kato-Katz Methods and ELISA to improve the diagnosis of Clonorchiasis in an Endemic Area, china. PLOS ONE, 7(10) 8. Nie, G., Wang, et al. (2014). Detection of Clonorchis sinensis circulating antigen in sera from Chinese patients by immunomagnetic bead ELISA based on IgY. PLoS ONE, 9(12) 9. Worasith, C., et al. (2015). Advances in the Diagnosis of Human Opisthorchiasis: Development of Opisthorchis viverrini Antigen Detection in Urine. PLoS NTD, 9(10) 10. Kim, Y. J., et al (2010). Performance of an Enzyme-Linked Immunosrobent Assay for Detection of Clonorchis sinensis Infestation in High -and Low-Risk Groups. J Clin Microbiol 48(7), Choi, B. I., et al. (2004). Clonorchiasis and Cholangiocarcinoma: Etiologic Relationship and Imaging Diagnosis. Clin Microbiol Reviews, 17(3),
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