Development of rapid diagnostic kit for Clonorchis egg detection 주 의 ( 주의내용기재 ) : ( 글 14 point 고딕체 )

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1 Development of rapid diagnostic kit for Clonorchis egg detection 주 의 ( 주의내용기재 ) : ( 글 14 point 고딕체 )

2 주 의 1. 이보고서는질병관리본부에서시행한학술연구용역사업의결과보 고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시질병관리본부에서시행한 학술연구용역사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다.

3 편집순서 2 : 제출문 질병관리본부학술연구용역사업최종결과보고서 과제명 간흡충란검출용래피드진단키트개발 수행기관 / 연구책임자 인하대학교산학협력단 / 김동수 발주부서 말라리아기생충과

4 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문 ( 한글 ) 간흡충란검출용래피드진단키트개발 ( 영문 ) Development of rapid diagnostic kit for Clonorchis egg detection Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과제1장최종연구개발목표 제2장최종연구개발내용및방법 제3장최종연구개발결과 제4장연구결과고찰및결론 제5장연구성과및활용계획 제6장기타중요변경사항 제7장연구비사용내역 제8장참고문헌 제9장첨부서류

5 과제명 중심단어 간흡충란검출용래피드진단키트개발 간흡충, 충란, 현장진단방법, 신속진단키트, 단클론항체, 경쟁적라텍스응집법 주관연구기관인하대학교주관연구책임자김동수 연구기간 차장내기생충실태조사에서 14종의기생충질환감염자수는약 189만명으로추산되었고이중담관상피세포암 (cholangiocarcinoma) 을일으키는간흡충의충란양성률은전체인구대비 2.9% 로감염자수는 140만명으로기생충관리의중요한문제점으로대두되었다. 간흡충 ( 肝吸蟲, Clonorchis sinensis) 은사람에게감염되어간흡충증 (clonorchiasis) 을일으키는만성토착기생충이다. 기생충질환의진단에고전적으로사용되고있는 MGL법은장시간소요되는전처리과정, 과도한인력소모, 독성약품처리를위한열악한환경을개선할필요가있다. 또한낮은충란검출률과충란감별진단에필요한전문성을극복할수있는간편하고신속하며일반실험실과현장에서바로적용할수있는새로운현장진단방법 (POCT, point-of-care testing) 개발이필요하다. 본연구에서는간흡충의효율적진단을위하여대변검사전처리과정의간소화, 검출률향상, 충란감별진단의전문성을극복할수있는신속진단키트 (rapid diagnosis test; RDT) 를제조하고그유용성을평가하고자하였다. 간흡충충란을항원으로사용하여간흡충충란특이단클론항체를제작하였다. 간흡충충란을항원으로사용하여 ELISA, strip assay, line assay, dot assay를수행하여민감도와특이도가우수한 4개융합세포주를선별하였다. 정제된간흡충충란단클론항체는충란과특이적으로결합하여충란의표면에형광이발현되는것이관찰되었다. 대변으로부터신속하게간흡충충란을진단하기위해서금또는라텍스입자에충란항원에특이적인항체를축합시키고응집반응을특수재질의유리판에서확인하였다. 경쟁적라텍스응집법 (competitive latex agglutination) 을이용하여진단키트의간흡충충란반응성을확인한결과간흡충충란특이항체는간흡충충란과경쟁적으로결합하여응집반응이관찰되지않았다. 간흡충충란진단키트의민감도확인결과진단키트의민감도는간흡충충란 lysate 10 ug으로예상되었다. 그리고간흡충충란진단키트를제작하거나검체를수집하는과정등에서함입될수있는 8가지성분들에대하여 1,000 ug/ml 농도에서교차반응이관찰되지않았다. 간흡충및장흡충양성환자의대변에대한민감도와특이도는각각 78% 와 95% 이었다. 본연구에서간흡충충란에특이적으로반응하는단클론항체를제작하였고이를이용하여간흡충충란진단키트를개발하였다. 이진단키트는교차반응이없는민감도와특이도가우수한진단키트이다. 그러므로이키트는간흡충의효율적진단을위하여대변검사전처리과정의간소화, 검출률향상, 충란감별진단의전문성을극복할수있는신속진단키트 (rapid diagnosis test; RDT) 가될것으로사료되며향후보정연구를통하여국가기생충진단표준품으로적용됨으로서국가보건안정망구축에기여하며다른기생충질환진단키트개발에응용할수있을것으로사료된다.

6 Title of Project Key Words Development of rapid diagnostic kit for Clonorchis egg detection Clonorchis sinensis, egg, point-of-care testing (POCT), rapid diagnosis test (RDT), monoclonal antibody, competitive latex agglutination Institute Inha University Project Leader Kim Tong Soo Project Period In the research of 7 th Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in Korea 2004, approximately 1.89 million people are estimated to be infected 14 kind s parasites. 2.9% of people were infected with Clonorchis sinensis and about 1.4 million people are estimated to be infected with this parasite. Clonorchis sinensis is endemic in Korea and promotes development of cholangiocarcinoma in human. Recently, C. sinensis was officially classified as a Group 1 biological carcinogen by the World Health Organization. Parasitological microscopic stool examination remains the standard method for diagnosing clonorchiasis. However, MGL method using formalin-ether centrifugal sedimentation technique is time consume, expensive and use toxic reagents. Moreover, it is still difficult to diagnosis by egg and low infection because it need expert technician. More suitable diagnostic method is required for rapid and easy diagnosis such as point-of-care testing (POCT). This study we developed rapid diagnosis test (RDT) and estimate efficiency and utility. This kit is more simple preprocess, enhancing diagnostic efficiency and may overcome weakness of existing diagnosis methods. Using C. sinensis egg lysate for antigen, we made egg specific monoclonal antibody. We selected 4 hybridoma strains by ELISA test, strip assay, line assay and dot assay. Purified monoclonal antibodies are specifically reacted with C. sinensis egg surface by indirect fluorescence assay. Colloidal gold and latex particle (200 um diameter) are conjugated with goat anti-mouse IgG and adsorbed into glass reaction plate for rapid diagnosis of C. sinensis egg from stool. In competitive latex agglutination, C. sinensis specific monoclonal antibody was competitively combined with eggs and observed no agglutination reaction. Sensitivity of rapid C. sinensis egg detection kit was estimated 10 ug of egg lysate. Rapid C. sinensis egg detection kit had no cross reaction with 8 kinds of reagents that could be contaminated in process of stool preprocessing and kit production. The sensitivity and specificity for stool of clonorchiasis and other intestinal parasites are 78% and 95%, respectively. In this study, we made C. sinensis egg specific monoclonal antibody and rapid C. sinensis egg detection kit using this antibody. This kit was ability and had high sensitivity and specificity and had no cross reaction. Additionally, this kit can be a rapid diagnosis test (RDT) and overcome simplify of stool preprocessing course, enhancing of egg detection rate, and necessity expert skill to differential diagnosis of eggs. This rapid C. sinensis egg detection kit could be contributed to eradication of clonorchiasis and should be further studied to develop other parasites rapid diagnostic test kits.

7 학술연구용역사업연구결과 제 1 장최종연구개발목표 1.1 목표 가. 연구목적및필요성 (1) 일반현황 m 기생충감염현황 - 지구온난화현상등지구환경의변화로인하여국내에서퇴치되었던전염병이재등장하고있으며기생충의경우, 식품을매개로하는기생충질환의발생이증가하는추세로국민의건강영유를위협하고있다. - 제7차장내기생충실태조사 (The 7 th Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in Korea, 질병관리본부, 2004; Kim et al., 2009) 에서과거국내기생충감염상을주도하였던회충등과같은토양매개성선충류의감염률이현저히감소되었으나국민들의식문화생활의변화등에따른일부기생충질환이일부지역에따라증가하거나감염률자체가지속되는경향을보여주고있다. 14종의기생충질환감염자수는약 189만명으로추산되었고이중담도상피세포암 (cholangiocarcinoma) 을일으키는간흡충의충란양성률은전체인구대비 2.9% 로감염자수는 140만명으로기생충관리의중요한문제점으로대두되었다. 표 1. 장내기생충실태조사연도별감염현황 ( 질병관리본부, 2004) 년도피검자수충란양성률 회충구충편충간흡충폐흡충요코가와흡충 유무구조충 요충 제1차 ('71) 24, (2, 3, 4, 5차생략 ) 제6차 ('97) 45, 제7차 ('04) 20, m 관리현황 - 질병관리본부에서는이에대한대책으로 2005년부터기생충질환, 특히간흡충감염률이높은고도유행지역을중심으로지속적인퇴치사업을수행하고있으며 2010년까지총 15만여명의지역주민을조사하여간흡충감염자 20,000 여명을투약 치료하였다

8 표 2. 연도별장내기생충검사건수및양성률 ( 질병관리본부, ) 연도시도보건소 ( 수 ) 검사건 ( 수 ) 양성수 ( 양성률 ) 비고 ( 간흡충감염현황 ) ,080 1,549 (14.0%) 1,016 (9.2%) ,014 3,442 (14.3%) 2,656 (11.1%) ,527 3,085 (9.8%) 2,547 (8.1%) ,444 4,287 (9.9%) 3,652 (8.4%) ,562 2,749 (12.2%) 2,371 (10.5%) ,733 3,312 (10.8) 2,874 (9.3%) m 간흡충 ( 肝吸蟲, Clonorchis sinensis) - 사람에게감염되어간흡충증 (clonorchiasis) 을일으키며인체내감염은민물고기의피낭유충이인체에경구감염되면십이지장에서탈낭되며유충들이총수담관으로이동하여간내담도의말단부위에서성충으로자라게됨으로서발생하게되는데간흡충은성충이되기위하여제1, 2 중간숙주를거치는복잡한생활사를영위하고있음 - 우리나라를비롯하여중국과일본그리고동남아시아권에걸쳐광범위하게관찰되는만성토착기생충임 국내감염률 : 전국민대비 2.9% 국내간흡충추산환자 : 약 140만명 - 간흡충의위험성 간흡충은사람의담관에기생하여염증을일으키거나폐쇄성황달, 복통, 소화불량및무기력증등의증세를일으키며만성적인염증이지속된다. 유행지에서의만성감염은담관상피세포암 (cholangiocarcinoma) 발생이다른지역보다 2~3배높은역학적인특성을보인다. 세계보건기구 (World Heath Organization; WHO) 산하국제암연구소 (International Agency for Research on Cancer; IARC) 는간흡충을일으키는생물학적발암원인체 (Group 1; carcinogen to human) 로공인하였다 (Bouvard et al., 2009). - 간흡충충란 간흡충충란은유난원형이며크기는 28~30 x 15~16 이며난개가뚜렷하고난각에심한주름 (muskmelon pattern) 이있는점이특징이다 ( 사진 ). (2) 간흡충증진단방법및문제점 m 간흡충증진단방법 - 기생충질환의치료에앞서필수적으로이루어져야하는것이진단을위한검사법의선택이며검사법의원리와수기를이해하는것이다. - 기생충의검사에는크게대변검사 (stool examination), 혈액검사 (blood examination), 객담검사 (sputum examination), 그리고소변검사 (urine examination) 등이있다. - 이들중에서, 대변을이용한검사법으로는목적에따라정성적방법과정량적방법그리고불확실한선충류의유충이나충란의동정을위한대변배양법이있으며또그각각에는세분화된여러방법이존재한다

9 - 또한대변검사로검출가능한기생충의시기별종류로는충란, 포낭또는영양형, oocyst, 유충, 편절등이있으며충란검사가유용한기생충종류는아래와같다. 구분 검사종류 충란 선충류 흡충류 조충류 회충, 편충, 구충, 동양모양선충, 장모세선충 일본주혈흡충, 만손주혈흡충, 간흡충, 폐흡충 *, 간질, 비대흡충, 이형흡충류, 극구흡충류 유구조충, 무구조충, 왜소조충, 축소조충, 광절열두조충 * 객담검사가더유용함 - 간흡충증충란검사법에는도말법으로직접도말법 (direct smear) 과셀로판후층도말법 (cellophane thick smear) 이있으며집란법으로포르말린 - 에테르침전법 (formalin-ether centrifugal sedimentation technique; Ritchie, 1948) 등이사용되고있다. m 간흡충증충란검사법문제점 - 현재사용중인집란법 ( 포르말린-에테르침전법, MGL 법, 이하 MGL 법 ) 은전처리시간과인건비가많이들어가는방법임 질병관리본부에서 MGL법으로약 2~4만건의대변검사를처리하고있는데이를월별, 주별, 일별에따른검사수로나타내면각각 3,300건, 800건, 170건이다. 일별건수 170건을살펴보면총근무시간을 8시간으로볼때, 시간당 20건이넘는양으로전처리시간이길며 4인이상의인력이동원되어야하고이후진단판정을위한검경에많은시간이소요되어과도한검사에시달리고있는실정이다. 또한 MGL법은인체에치명적인화학약품을사용하여환경오염및검사자의건강에치명적인악영향을주며보건소등일반검사실에서사용을하지못하고강제환풍장치나대변처리상자등과같은특수한처리시설이갖추어져야하는상황이다. - 낮은검출률및전문인력미확보 과거에비하여민물고기의간흡충피낭유충감염률과감염강도는낮아지고있으나국민들의민물고기생식식생활문화는증가하여적은수의간흡충피낭유충에의한재감염이계속일어나고있는것으로판단되며이에따라낮은충체에의한낮은충란생산으로대변내에서현미경검사로충란의검출률이낮아져오진의확률이높아지고있는실정이다. 현미경진단이가능한전문인력의미확보는간흡충진단검사에큰문제로대두되고있는실정이다. (3) 필요성및목적 m 필요성 - 기생충질환의진단에고전적으로사용되고있는 MGL법의단점으로지적되고있는 1) 장시간소요되는전처리과정, 2) 과도한인력소모, 3) 독성약품처리를위한열악한환경을개선할필요가있다

10 - 또한낮은충란검출률과충란감별진단에필요한전문성을극복할수있는간편하고 신속하며일반실험실과현장에서바로적용할수있는새로운진단법 (POCT, point-of-care testing) 개발이필요하다. m 목적 - 간흡충의효율적진단을위하여대변검사전처리과정의간소화, 검출률향상, 충란감별진단의전문성을극복할수있는진단키트 (rapid diagnosis test; RDT) 를제조하고그유용성을평가하고자한다. RDT 제조 - 간편하고신속한현장적용 (point-of-care testing, POCT) 간흡충충란진단법개발및키트제조 RDT 평가 - 개발된진단키트의유용성평가 나. 연구수행체계 m 추진방법 - 본과제는크게 1) 간흡충충란확보및충란특이항체개발, 2) 면역물질탑재용신호탐침 (probe) 과축합체개발, 3) 유효성평가를위한실용화사업부문으로나눌수있음 m 과제역할분담 - 인하대학교 연구과제에필요한환자시료확보 간흡충충란특이항체개발 환자검체 / 대조군각각최소 500건에대한민감도의통계학적유의성검정 - 아산생명공학연구소 면역물질탑재용신호탐침 (probe, 축합체 ) 개발 POCT 키트개발 유효성평가및키트보정 m 과제구성체계 - 간흡충충란확보 - 간흡충충란특이항원개발 - 간편하고신속한현장적용 (point-of-care testing, POCT) 용간흡충충란진단법개발 - 면역물질탑재용신호탐침 (probe) 축합체개발 - POCT 키트개발 - 유효성평가 - 시제품제조 - 환자검체 / 대조군각각최소 500 건에대한민감도의통계학적유의성검정 - POCT 키트보정 - 키트제조 - 4 -

11 다. 공동연구수행필요성 m 본과제는기존의 MGL법을개량하여신속하고간편한검사가가능한진단키트를개발하는데그목적이있으며개발후의검출율비교와대조군환자검체에대한민감도검정을위하여전문가를초빙할예정이다. - 총 10개월의사업기간중간흡충충란특이항체개발과시제품제조에필요한약 7개월의시간외에 3개월정도의기간에검출율비교, 민감도검정등유효성평가와보정을수행한다. - 현재간흡충증을효과적으로진단하기위한표준화된방법이부재한것이현실임 - 피내반응과충란검사법은정확도가많이떨어지고 (30~40% 대 ), 효소면역반응을이용한검사법은정확도는높으나현장에서널리사용되기에는어려움이있으며, 또한효소면역반응키트에사용되는충체항원이제조에있어특이성과재현성이떨어지는단점이있다 (Kim and Hong, 2010). - 간 / 폐흡충증진단을목적으로 1990년대후반에등장하기시작한신속면역크로마토그래피법은효율성이뛰어나나도입되어개발된적이없었다. - 본연구에서는상기에서언급한문제점들을보완하여간흡충증을효과적으로진단할수있는간흡충충란의신속현장진단법을개발하고자한다. - 즉, 간흡충충란의특이항체개발을본과제에서집중적으로수행할예정이며시제품제조는공동연구팀인아산생명공학연구소에서수행할예정이다. 그후, 공동으로유효성평가와 POCT 키트를보정할예정이다. 개발된진단키트보다더편리하고효과적인신속진단키트를개발하여간흡충증을효율적으로관리할수있는시스템을구축하고자한다. 1.2 목표달성도및관련분야에대한기여도 가. 연구결과에대한기여도, 기대효과및활용방안 m 기대효과 - 정책측면및연구 실제간흡충감염지역주민이거주하는농어촌지역이나섬지역에서간편한검사가가능할것으로기대되며이에따른국가기생충표준품으로적용으로국가보건안정망구축기여될수있다. 본연구에서개발될진단키트는기존의진단키트보다특이도와민감도가높으며, 사용법이원스텝 (one-step) 으로무척간편하고고가의장비의도움없이신속하게현장검증 (point-of-care testing, POCT) 이가능한세계최초의간흡충충란검사진단키트이다. 국내 외적으로최초로개발될것으로예상되어국제특허를포함한지적재산권확보, 수출등의경제적파급효과가예상된다. - 제조측면 간흡충증을효과적으로현장에서신속하게진단할수있는키트가본연구과제를통하여개발이되면, 낙도및오지, 그리고보건의료시스템이낙후된지역에서효율적으로질병관리를할수있다. 개발될신속진단키트는중국, 베트남등의국가로수출을하여국가경제에기여할수 - 5 -

12 있다. 개발될신속진단키트는효소면역검사법에비하여생산단가가저렴할것으로예상되어 수월하게국가보건관리사업에적용할수있을것이다. m 활용방안 - 대변검사법이민감도및특이도가높은보편적인진단방법이지만검사시간과인건비가많이소요되어대단위집단검진에적용하기에효율성이크게떨어진다. 따라서기존의검사법을보다효과적으로수행할수있는현장검사법개발이필요하다. - 기존의대변검사법은많은검사시간과노동력이필요하므로일선보건기관및민간기관에서현실적으로자체수행하기에현실적인어려움이있다. 하지만, 본과제에서개발하고자하는키트는이와같은문제점들을한꺼번에해결할수있다. - 본연구에서개발되는대변을이용한신속충란검사키트는혈청학적검사법인간흡충특이항체검출시스템과동시에운영을하게되면획기적으로간흡충질환의퇴치에기여할수있을것이며향후다른기생충질환진단키트개발에응용할수있다. 1.3 국내 외기술개발현황 가. 국내ㆍ외연구동향 ( 연구배경 ) m 보건복지부 ( 구보건사회부 ) 주도아래 1971년제1차기생충감염현황조사사업 (Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in Korea) 이시작된이후 1976년제2차, 1981년제3차, 1986년제4차, 1992년제5차및 1997년제6차조사사업이 5년단위로총 6회에걸쳐실시되었음. 전국민에서기생충감염률등의통계자료가확보되어기생충퇴치를위한정책자료로유용하게활용되었으며과거유행하던기생충질환의감염률이제6차조사에이르러 zero plateau에도달하였다. m 2004년에실시된제7차조사 ( 질병관리본부, 2004) 에서제6차조사 (1997년) 까지계속감소하던간흡충양성률 (2.4%) 이 7차조사 (2004년) 에서 3.7% 로크게증가하였으며특히경제성장에따른식생활의변화, 해외여행증가, 기후환경변화등여러요인들에의하여말라리아, 간흡충, 장흡충류, 머릿니, 요충, 수인성기생원충증등이일부지역에따라증가하거나감염률자체가지속되는경향을보이고있음이나타내고있다. m 또한기생충이증가하게된요인으로최근하천생태계가회복에따른민물고기, 제1, 2 중간숙주의서식증가와우리국민의생식으로인한요인등기생충감염조사나일반건강검진등에서꾸준히감염자를찾는방법개발이요구되는등정부의새로운기생충관리대책이필요하게되었다. 나. 연구배경 m 일반적으로간흡충과폐흡충진단은대변검사, 객담검사, 피내반응법등다양한방법이있으나 1) 민감도와특이도가높지않고, 2) 종간의교차반응, 3) 집단검진방법으로는검사시간과인건비가많이소요되는문제점을내포하고있다. m 이들의단점을보완하기위하여보체결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, - 6 -

13 효소면역법등과 ELISA 방법등 (Walton and Chyu, 1959; Seo et al., 1981) 이연구적용되었으나교차반응, 조항원에의한민감도와특이도의향상에한계가있음이밝혀졌다. m 또한간흡충이나폐흡충증진단을위한특이항원발굴및에재조합단백질적용연구가우리나라, 일본, 중국및동남아시아를중심으로부분적으로진행되어왔으며특히단백질분해효소에대한연구가활발히진행되었다 (Song et al., 1991; Kim et al., 2001; Na et al., 2002; Kang et al., 2004; Li et al., 2004; Nagano et al., 2004; Lee et al., 2006). m 간흡충특이진단법개발을위해서는특이항원을발굴하고기존검사법의문제점으로제기된 1 민감도 / 특이도의향상, 2 현증및과거감염감별능력등을향상시키기위한노력이필요하다

14 제 2 장최종연구개발내용및방법 2.1 연구배경 m 질병관리본부는간흡충감염고도유행지역을중심으로 2005년부터 2010년까지지속적인퇴치사업을수행하여간흡충감염자 20,000 여명을투약 치료하고있으나시간당소요되는과도한검사와비위생적인환경요소를해결하여야하며또한기생충퇴치사업의지방이전에대한대책을마련해야하는시점에놓여있다. - 장내기생충질환의간편하고신속한진단을위하여항체검출키트나대변검사법으로가장널리사용되고있는 MGL법의단점인독성약품사용, 장시간소요되는전처리과정, 많은검사인력필요등을극복할수있는새로운대변검사법을개발하고있으나 진단키트의경우조항원을이용한대량생산에따른항원공급의어려움과간편대변검사장치의제조비상승 민물고기내낮은피낭유충감염에의한낮은충란검출률 대변을이용한기생충란의현미경감별에서숙련된인력의미확보는간흡충퇴치사업의지방이전에큰걸림돌로지적되고있는실정이다. 2.2 연구내용 m 이러한문제를해결하기위하여본과제에서는대변내의간흡충충란을직접적으로탐색할수있는 RDT를개발하고자한다. - 간흡충충란특이항원개발 - 충란특이항원에대한면역물질탑재용신호탐침 (probe) 및축합체개발 2.3 연구방법 간흡충의진단효율을높이기위하여간흡충충란항원을이용한진단키트개발과유효성평가를진행할예정임가 ) 간편하고신속한현장적용 (point-of-care testing, POCT) 용간흡충충란진단법개발및키트제조나 ) 개발된진단키트의유용성평가 1) 간흡충충란수집 - 8 -

15 m 성충수집 - 간흡충피낭유충에감염된중간숙주 ( 참붕어 ) 를간흡충유행지역인섬진강일대중경남진주와산청에서채집하여사용하였다. 2차중간숙주로부터피낭유충을모으기위해, 근육을인공소화액으로 30분간 37 에서처리한다음, 소화된내용물은직경 0.147mm의채로여과한후생리식염수 (0.85% NaCl 용액 ) 로세척하였다. 간흡충피낭유충을입체현미경하에서 500개씩모아토끼에경구감염시켰다. 8주간배양한다음, 간흡충의성충을토끼의담관에서분리한후생리식염수를이용하여 3회세척한다음, 사용시까지 -70 에보관하였다. m 충란수집 - 토끼의담관에서분리한성충을 DMEM 배지 ( 성분을찾을것 ) 에넣어 37 에서 10시간배양한후충란이포함된배양액을분리하여원심 (3,000 xg) 하고생리식염수로세척하여원심한후실험에사용하였다. 2) 간흡충양성혈청수집 - 질병관리본부말라리아 기생충과에서제공될간흡충증항체양성혈청을이용하여본시험을수행하였다. 본시험에이용될혈액들은충란검사및피내반응검사를통해서간흡충증환자로확인된혈액들이다. 이들혈액들을면역블롯 (immunoblot), 유효성평가및키트보정에이용하였다. 3) 간흡충충란특이항원정제및단클론항체제작 m 간흡충충란항원준비 - 확보된간흡충충란을생리식염수를이용하여충분히세정한다음, 단백질분해효소를넣고유리구슬 (glass bead, 20 ) 을넣고분쇄하였다. 그후, 원심분리를통해서상층액을취한다음면역원으로이용하였다. m 간흡충충란단클론항체제작 - 항원면역 각각 100 μg의간흡충충란항원이들어있는용액과같은부피의 complete Freund's adjuvant가섞인현탁액을만들어생후 6~8주가량된암컷생쥐 (BALB/c) 의복강내에주입하였다. 2주후에 incomplete Freund's adjuvant를사용하여같은요령으로한번더주사하고, 다시 2주후에같은요령으로한번더주사하였다. 마지막면역처리후 2일뒤에꼬리에서채혈하여혈청을얻은뒤인산염완충액에희석하여 (1/1,000) ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay) 방법으로항체의역가를결정하였다. 만약역가가낮게나오면 2주후에다시면역화시켰다. - 비장세포 (splenocyte) 와골수종 (myeloma) 세포의융합 면역화된쥐에서비장을꺼내어조직분쇄기로비장을으깬후, 세포혼탁액을용기에담고원심분리하여세포를회수하였다. 골수종세포는세포배양용플라스크에서회수하여 RPMI 1640에현탁하고세포수를계산하였다. 비장세포역시세포수를계산하였다 의골수종세포와 의비장세포를 50 ml 용기로옮겨 RPMI 1640을적당량첨가후 200 g로 5분간원심분리하여세포를회수하였다. 회수된세포를현탁시켜천천히흔들어주면서 1ml의 50% PEG (polyethylene glycol) 용액을 1분동안가하였다. 5분후에 1 ml의 RPMI 1640을 - 9 -

16 30초에걸쳐넣고, 다시 3ml의 RPMI 1640을 30초에걸쳐첨가하였다. 또다시 17 ml의 RPMI 1640을 1분에걸쳐넣은다음 20ml의 RPMI 1640을더넣어주고, 5분동안반응시켰다. 200 g로 5분간원심분리한후배지는제거하였다. 50ml의 1% HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 을함유하는 RPMI 1640에주의하여현탁한후, 피더세포 (feeder cell) 가들어있는 96웰세포배양용용기에 100 μl / 웰씩융합된세포를넣어준후 37, 5% CO 2 인큐베이터에서세포를배양하였다. - 융합세포주의클로닝및복수를이용한항체생산 10일정도후에, 융합세포가군락을형성하여자라는것을확인한후 96웰세포배양용용기에서배지를조금취하여 ELISA 방법으로정제된간흡충항원에대한항체를생산하는 well을확인하였고, 그 well의세포를회수하여 24웰세포배양용용기로옮긴다음배양한후, 안정한단클론세포주가얻어질때까지클로닝을계속하였다. 클로닝이완료되면티플라스크 (T flask) 로옮겨대량으로배양하여얼린후액체질소에보관하였다. 생후 6~8주된쥐 (BALB/c) 의복강에인컴플리트프레운즈아주번트 (incomplete Freund's adjuvant) 를 0.5ml 주사하였다. 1주일째되는날융합세포를인산염완충액에현탁하고계수하여, 쥐한마리당 세포를 0.5 ml 인산염완충액에현탁후복강에주사하였다. 1~2주가지나면서복수가적당히차오르면주사기를이용하여복수 (ascitic fluid) 를채취한후냉동보관하였다. - 단클론항체의정제 채취한복수에황산암모늄 (ammonium sulfate) 을 10% 의농도로첨가한후 30분간혼합하였다. 그리고 15,000 rpm에서 30분간원심분리한후상층액을취하였다. 다시이상층액에황산암모늄을 50% 의농도로첨가한후 4 에서 30분간방치한후다시 15,000 rpm에서 30분간원심분리하여상층액은버리고침전물을 20 mm 인산완충용액 (phosphate buffer, ph 7.0) 에현탁시켰다. 이현탁액을 20 mm 인산완충용액에서 18시간이상투석 (dialysis) 하였다. 투석후, 20 mm 인산완충용액 (ph 7.0) 으로평형화된단백질 G-결합컬럼 (Protein G-coupled column) 에투석액을주입하고, 모두주입되고나면인산완충용액을이용하여흡착하지않은물질들을제거하였다. column에결합된항체는 100 mm 글리신용액 (glycine solution, ph 2.8) 용액으로용출 (elution) 시켰다. 이때 1M Tris (ph 9.0) 용액을용출액의 1/10부피를첨가해주어 ph를보정해주었다. 용출된항체액을농축한후 150 mm 인산완충용액에서투석하였고, 투석이끝난후브래드포드법 (Bradford assay) 을이용하여항체의양을확인하고사용전까지냉동보관하였다. - 단클론항체의선정 정제된단클론항체를대상으로간흡충의충란과반응성이높은항체를선정하기위해서 ELISA 방법과면역점측정법 (immuno-dot assay) 을이용하여측정하였다. gel로부터추출된간흡충충란항원을 96 well ELISA plate에 2 μg / ml의농도로코팅하였다. 정제된단클론항체를각각단계적으로희석하여간흡충충란항원이코팅된플레이트와반응시켰고, 반응후결합되지않은항체를세척과정을통해제거하였다. 고추냉이과산화효소 (horseradish peroxydase) 가결합된산양항생쥐면역글로블린 G (IgG) 를반응시키고, 세척과정을통해반응하지않은과산화효소-IgG를제거하였다. 과산화효소의기질이되는 TMB (tetramethyl benzidine) 를넣고발색시켜반응정도에따른흡광도 (A 450) 를측정하였다. - 간흡충충란특히단클론항체선별을위한전략 : 면역점측정법

17 간흡충충란표면단백질에대한반응성을갖는단클론항체를선별하기위해서는충란이 ELISA plate에코팅이되지않으므로면역점측정법 (immuno-dot assay, 그림 <1> 을이용하여선별하였다. 이를위해서멤브레인에충란을고정화시키고단클론항체를포함하는세포배양액을반응시킨후, 항생쥐 IgG-gold 축합체를반응시켜서확인하였다. 이들두방법을통하여각각선별된간흡충충란항원에대한단클론항체가운데반응성이가장좋은클론을이용하여키트제작용원료생산에사용하였다. 1 2 그림 1. 면역점측정법 (immuno-dot assay) 를이용한간흡충충란 - 특이단클론항체의선별. 1. 충란 - 특이 단클론항체를포함하는경우 ( 붉은색의면역점 (immuno-dot) 의발색반응이나타남. 2. 충란 - 특이 단클론항체가없는경우면역점발색반응이나타나지않음 간흡충충란표면단백질에대한반응성을갖는단클론항체를선별하기위해서는충란이 ELISA plate에코팅이되지않으므로면역점측정접을이용하여선별하였다. 이를위해서멤브레인에충란을고정화시키고단클론항체를포함하는세포배양액을반응시킨후, 항생쥐 IgG-gold 축합체를반응시켜서확인하였다. 이들두방법을통하여각각선별된간흡충충란항원에대한단클론항체가운데반응성이가장좋은클론을이용하여키트제작용원료생산에사용하였다. 4) 간흡충충란특이항체를이용한충란진단키트제조 m 제조내용 - 대변으로부터신속하게간흡충충란을진단하기위해서는금또는라텍스입자에충란항원에특이적인항체를축합시키고응집반응을특수재질의종이나유리판에서확인하도록하였다. 이와같은입자응집법 (particle agglutination) 은류마티스인자 (RF, rheumatoid factor) 나염증성단백질 (CRP) 등과같은진단에있어널리사용되고있는방법인데, 이방법은장비의도움없이육안으로판독할수있으며, 측정법이간편하여누구나쉽게현장에서검사할수있으며, 검사시간도 10분이내로하는빠른정성검사법이다 < 그림 2>

18 그림 2. 본연구를통해서개발하고자하는간흡충충란경쟁적입자응집법진단키트. 충란양성일경우 그림좌측처럼균일한용액이나타나지만, 충란음성일경우충란에입자들이결합하여 우측처럼응집체가형성이됨 m 입자응집법을이용한간흡충충란진단키트의개발은아래와같은순서로진행하였다. - 항체-입자 ( 금또는라텍스 ) 축합체제조 - 축합체반응액제조 - 종이또는유리재질의입자응집반응판제조 - 대변채취용구제조 m 개발된간흡충충란진단키트는아래와같은항목들에대해검증시험을진행하여최대의진단능력을갖는키트로개발하였다. - 민감도 (sensitivity) 시험 : 최소 150 건이상의양성검체를이용하여정확도계산. 본시험은임상시험계획서에따라수행함 - 특이도 (specificity) 시험 : 최소 150 건이상의음성검체를이용하여시험한후, 정확도계산. 본시험은임상시험계획서에따라수행함 - 간섭 ( 방해물질 ), 교차반응성 (cross reactivity) 시험 일반시약및단백질들과의교차반응성 다른항체양성검체들과의교차반응성 세균들과의교차반응성 바이러스들과의교차반응성 - 재현성 (reproducibility) 시험 동일인 (Intra), 사람간 (Inter) 시험 로트 (lot), 시험일 (date), 시험장소 (place) 간시험 - 기존제품과의비교또는상관성시험 5) 간흡충충란진단키트제조방법 - 항체-입자 ( 금또는라텍스 ) 축합체개발 - 축합체반응액개발 - 종이또는유리재질의입자응집반응판개발 - 대변채취용구개발

19 m 항체-입자 ( 금또는라텍스 ) 축합체제조 - 단클론항체의준비 축합반응에필요한만큼이상의충분한항체를확보한후, 탄산염완충용액 (Na-carbonate, ph 9.3) 으로충분히투석하였다. - 금입자 (colloidal gold) 또는라텍스준비 금입자의경우, 일정량의금이온을증류수에녹인후, 100 에서강하게저어주면서적절한환원제를첨가하여콜로이드성금입자를제조하였다. 라텍스입자의경우, 적절한크기의라텍스입자를머크사 (Merk Inc.) 로부터구매하였다. - 금입자- 또는라텍스-단클론항체축합체의제조 금입자-단클론항체축합체 : 100ml의콜로이드성금입자용액 (OD 540=2.0) 을준비하여 37 에서 stirring하였다. 이용액에단백질A 또는간흡충충란특이항원을첨가하여 1시간동안혼합하여축합체를제조하였다. 금축합체의세정은 1% BSA, 2mM borate 용액으로수행하였다. 라텍스-단클론항체축합체 : 50ml의라텍스용액을 0.1M K 2 CO 3 를이용하여 ph를 9.0으로맞추었다. 그후, 준비된항체를넣고 37 에서 1시간동안 stirring하였다. 라텍스축합체의세정은 1% BSA, 2mM borate 용액으로수행하였다. - 제조공정도금입자또는라텍스준비 충란특이단클론항체투입 축합후세정 m 축합체반응액개발 - 축합체를장기간보존하면서도반응을효율적으로일으키기위한반응액을준비하였다. 0.1 탄산완충용액 (ph 9.0) 에 1% casein, 2% sucrose, 0.1% NaN 3, 0.05% Proclim 300을처리하여준비하였다. 이후, 0.8μm필터로여과하였다. - 제조공정유의사항 : 무균상태에서제조를하며멸균된완충용액병을이용하였다. m 종이또는유리재질의입자응집반응판개발 - 종이재질의반응판 종이반응판은금입자-항체축합체를이용하여검사를할때에사용하였다. 셀룰로오스재질의판위에친수성 / 소수성이 3/7정도되는필름을제작하여코팅하였다. 그후, 직경이 1.5 cm가되는원 (circle) 을소수성성분의잉크로 2mm 두께로그려서제조하였다. - 유리재질의반응판 유리재질의반응판은라텍스-항체축합체를이용하여검사를할때에사용하였다. 유리판위에 1.5 cm가되는원 (circle) 을소수성성분의잉크로 2mm 두께로그려서

20 제조하였다. - 제조 : 해당공정의경우, 인쇄및유리판생산전문제작업체에외주를주어수행하였다. m 대변채취용구개발 - 효과적이고재현성있는현장진단검사를위해서는채취용구의도입이필요하다. 이채취용구는개별적으로달라질수있는변채취양을항상일정하게만들어주는고안장치가필요하며, 내부에충란을부유시킬수있는용액을넣을수있어야한다. 또한, 사용, 보관, 폐기에편리한형태로고안한다. m 키트의구성 - 키트의경우아래와같은성분으로구성되며, 이를하나의키트로포장하였다. - 키트구성 1 축합체용액및용액병 2 종이또는유리재질의반응판 3 완충용액이들어있는대변채취용구 m 간흡충충란진단키트의제조공정도 anti-cs egg mab 반응판준비 검체채취용구 입자 - 항체축합체제조 멸균 축합체안정화및분주 완충용액충진 포장 품질관리 m 민감도 (sensitivity) 및특이도 (specificity) 시험 - 질병관리본부에서최소 50 건이상의양성검체를양도받아서본과제로부터개발된키트를 이용하여시험을수행하였다. m 간섭 ( 방해물질 ), 교차반응성 (cross reactivity) 시험 - 본과제로부터개발된키트를이용하여아래각항목에해당하는시험을수행하여본개발키트가성능에문제가있는지확인하였다. - 일반시약및단백질들과의교차반응성

21 표 4 에서와같이 8 가지성분들은해당키트를제작하거나검체를수집하는과정등에서 함입될수있는요소들이다. 이들모두에대해서개발된키트는최대 1,000 ug/ml 이하의 농도에서교차반응또는간섭을하는지를확인하였다. 표 4. 교차반응성시험에사용된물질목록 번호 물질 (compound) 번호 물질 (compound) 1 인간혈청알부민 6 시트르산나트륨 (Sodium citrate) 2 헤모글로빈 (Hemoglobin) 7 헤파린 (heparin) 3 빌리루빈 (Bilirubin) 8 EDTA 4 트리글리세리드 (Triglyceride) 5 포도당 - 다른충란양성검체들과의교차반응성 본키트의타종기생충충란과의교차반응성검사는폐흡충과요코가와흡충검체들에 대해서실시하였다. 표 5. 교차반응성시험에사용된검체목록 번호 검체종류 검체수 양도처 1 폐흡충 (Paragonimus westermani) 양성검체 20 중앙대학교 2 요코가와흡충 (Metagonimus yokogawai) 양성검체 20 인하대학교 - 세균들과의교차반응성 검체내에존재할수있거나또는검체의채취및보관과정에서유입될수있는세균들과의교차반응성을알아보기위해서표 6에나열된세균들에대해서교차반응여부를확인하였다. 표 6. 교차반응성시험에사용된세균목록 번호세균판넬 (bacterial panel) 번호세균판넬 (bacterial panel) 1 Acinetobacter calcoaceticus 12 Serratia marcescens 2 Bacteroides fragilis 13 Salmonella typhimurium 3 Corynebactgerium diphtheriae 14 Salmonella enteritidis 4 Enterococcus faecalis 15 Salmonella enterica arizonae 5 Escherichia coli 16 *Salmonella typhi 6 Gardnerella vaginalis 17 Staphylococcus aureus 7 Klebsiella pneumoniae 8 Lactobacillus plantarum 9 Listeria monocytogenes 10 Proteus vulgaris 11 Pseudomanas aeruginosa - 바이러스들과의교차반응성

22 혈액내에존재할수있는바이러스들과의교차반응성을알아보기위해서표 7 에나열된 바이러스들에대해서교차반응여부를확인하였다. 표 7. 바이러스들과의교차반응성시험에사용된바이러스목록 번호 ATCC No 바이러스명 (Name) 숙주 (Host) 구입처 1 VR-7 Adenovirus type 7 HeLa ATCC 2 VR-1087 Adenovirus type 10 HeLa ATCC 3 VR-1095 Adenovirus type 18 HeLa ATCC 4 VR-5 Adenovirus type 5 HeLa ATCC 5 VR-740 Coronavirus 229E HFF ATCC 6 VR-186 Coxsackievirus A9 HFF ATCC 7 VR-185 Coxsackievirus B5 HFF ATCC m 재현성 (reproducibility) 시험 - 재현성을확인하기위해서동일인 (Intra) 와사람간 (Inter) 시험, 그리고, 제조번호 (Lot) 간, 시험일간, 시험장소간시험을수행하였다. - 동일인 (Intra), 사람간 (Inter) 시험 본키트의재현성시험을위해서는음성표준검체 2종 (NC1과 NC2), 양성표준검체 3종 (PC1H, PC1M, PC1L) 을제작한후이용하였다. 시험방법은우선, 준비된표준검체에대하여개발된진단키트를가지고 용법및용량 에준하여검사하고육안으로검사선의유무를조사하여음성및양성을판정하고이를분석하였다. 동일인 (Intra) 검사는본키트의개발과관련이없는한사람이 3회에걸쳐시험한후, 결과를확인하였고, 사람간 (Inter) 검사는본키트의개발과관련이없는 3명의각기다른사람을통하여시험을수행한후, 결과를확인하였다. - 로트 (lot), 시험일 (date), 시험장소 (place) 간시험 본키트의재현성시험을위해서는음성표준검체 2종 (NC1과 NC2), 양성표준검체 3종 (PC1H, PC1M, PC1L) 을제작한후이용하였다. 시험방법은준비된표준검체에대하여진단키트를가지고 용법및용량 에준하여검사하고육안으로검사선의유무를조사하여음성및양성을판정하고이를분석하였다. 제조번호 (Lot) 간시험은 3 Lot의제품을이용하여수행하였고, 시험일간시험은 2일간격으로 3일에걸쳐시험을, 그리고, 시험장소간시험은사무실내, 로비, 야외로정하여실험을수행하였다. m 기존제품과의비교또는상관성시험 - 본제품과동일원리및동법의기허가제품은현재까지없다. 따라서본시험을수행하지 않았다. 다만, 충란수가현미경으로확인된대변검체를가지고비교시험을수행하였다

23 제 3 장최종연구개발결과 3.1 연구개발결과 1) 간흡충충란수집 m 성충수집 - 간흡충피낭유충을 500개씩모아토끼에경구감염시켰다. 8주간배양한다음, 간흡충의성충을토끼의담관에서분리한후생리식염수를이용하여 3회세척한다음, 사용시까지 -70 에보관하였다. m 충란수집 - 토끼의담관에서분리한성충은 DMEM 배지 ( 성분을찾을것 ) 에넣어 37 에서 10시간배양한후성충을분리하여원심 (3,000 xg) 하고생리식염수로세척하여원심한후실험에사용하였다. 2) 간흡충양성혈청수집 - 질병관리본부말라리아 기생충과에서제공될간흡충증항체양성혈청을이용하여본 시험을수행하였다. 3) 간흡충충란특이항원정제및단클론항체제작 m 간흡충충란단클론항체제작 - 항원면역 간흡충충란항원 100 ug을같은부피의 complete Freund's adjuvant가섞인현탁액을만들어생후 6~8주가량된암컷생쥐 (BALB/c) 의복강내에주입하였다. 2주후에 incomplete Freund's adjuvant를사용하여같은요령으로한번더주사하고, 다시 2주후에같은요령으로한번더주사하였다. 2주후에꼬리미정맥으로 boosting 한후 3일뒤에채혈하여 ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) 방법으로항체의역가를결정하였다. - 비장세포 (splenocyte) 와골수종 (myeloma) 세포의융합 면역화된쥐에서비장을꺼내어조직분쇄기로비장을으깬후, 세포혼탁액을용기에담고원심분리하여세포를회수하였다. 골수종세포는세포배양용플라스크에서회수하여 RPMI 1640에현탁하고세포수를계산하였다 의골수종세포와 의비장세포를 1ml의 PEG (50% polyethylene glycol) 용액을 1분동안가하였다. RPMI 1640을처리하고원심분리한후배지는제거하였다. 50ml의 1% HAT (hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 을함유하는 RPMI 1640에주의하여현탁한후, 피더세포 (feeder cell) 가들어있는 96웰세포배양용용기에 100μl / 웰씩융합된세포를넣어준후 37, 5% CO 2 인큐베이터에서세포를배양하였다. - 융합세포주클로닝 10일정도후에, 융합세포가군락을형성하여자라는것을확인한후 96웰세포배양용용기에서배지를조금취하여 ELISA 방법으로정제된간흡충항원에대한항체를생산하는

24 well 을확인하였다. 간흡충충란항원 1 ug/ml 을코팅한플레이트를사용한 ELISA 테스트 결과흡광도 0.9 이상을나타내는 13 개의 line 을확인하였다 ( 표 8). 표 8. ELISA 를이용한 fusion plate screening 결과 융합세포주의민감도를확인하기위하여간흡충충란항원을 nitrocellulose membrane에 bio-blot을이용하여 1 mg/ml의농도로도포한후 sample pad 없이 strip assay를실시하였다. 검체전개액 (50 mm Tris (ph 8.0), 30 mm NaCl, 0.1% casein, 0.5% tween 20) 40 ul와 anti-cs 충란 culture medium 5 ul, goat anti-mouse IgG gold 5 ul를혼합한후간흡충충란항원이분주된스트립에반응시켰다. 민감도확인결과모두밴드를확인하였고, cell이많이자란 7개 well (3E8, 3H8, 5E3, 5G4, 6H12, 8C9, 16F12) 을우선 cloning을진행하였다 ( 그림 3). 융합세포주의특이도를확인하기위하여대조군으로 anti-dv 배양액과 anti-human IgG 배양액을사용하여간흡충충란항원이분주된스트립에반응시켰다. 특이도확인결과 anti-dv 배양액과 anti-human IgG 배양액은간흡충충란과반응성이없는것으로확인되었다 ( 그림 4). 그림 3. Strip assay 를이용한 fusion plate screening 및민감도확인결과 그림 4. Strip assay 를이용한융합세포주의특이도확인결과

25 간흡충충란표면단백질에대한반응성을갖는단클론항체를선별하기위해서는충란이 ELISA plate에코팅이되지않으므로면역점측정법 (immuno-dot assay) 을이용하여선별하였다. 멤브레인에충란을고정화시키고단클론항체를포함하는세포배양액을반응시킨후, 항생쥐 IgG-gold 축합체를반응시켜서확인하였다. 면역점측점법확인결과모두반응을보였고, 1/16 희석조건에서반응성이좋은 9개세포주 (3D8, 3E8, 3H8, 4G11, 4H2, 5C6, 5G4, 16F12, 20D1) 를 cloning 하였다 ( 그림 5). 그림 5. 면역점측정법을이용한융합세포주의민감도확인결과 충란항원에대한항원성이좋은 well의세포를회수하여 24웰세포배양용용기로옮긴다음배양한후, 안정한단클론세포주가얻어질때까지클로닝을계속하였다 ( 표 9). 표 10은간흡충충란항원 1 ug/ml을코팅한플레이트를사용한 ELISA 테스트결과이다. 클로닝이완료된후티플라스크 (T flask) 로옮겨대량으로배양하여얼린후액체질소에보관하였다. 표 well 세포배양용용기에서배양한융합세포주 표 well 세포배양용용기에서배양한융합세포주의 ELISA 결과

26 24웰세포배양용용기로옮긴다음배양한단클론세포주의민감도를확인하기위하여간흡충충란을이용한면역점측정법 (immuno-dot assay) 을실시하였다. 멤브레인에충란을고정화시키고단클론항체를포함하는세포배양액을반응시킨후, 항생쥐 IgG-gold 축합체를반응시켜서확인하였다. 면역점측정법확인결과대부분우수한반응을보였다 ( 그림 6). 그림 6. 면역점측정법을이용한융합세포주의민감도확인결과 - 단클론항체의정제 생후 6~8 주된쥐 (BALB/c) 의복강에인컴플리트프레운즈아주번트 (incomplete Freund's adjuvant) 를 0.5ml 주사하였다. 1 주일째되는날융합세포를인산염완충액에현탁하고

27 계수하여, 쥐한마리당 세포를 0.5 ml 인산염완충액에현탁후복강에주사하였다. 1~2주가지나면서복수가적당히차오르면주사기를이용하여복수 (ascitic fluid) 를채취한후냉동보관하였다. 채취한복수에황산암모늄 (ammonium sulfate) 을 10% 의농도로첨가한후 30분간혼합하였다. 그리고 15,000 rpm에서 30분간원심분리한후상층액을취하였다. 다시이상층액에황산암모늄을 50% 의농도로첨가한후 4 에서 30분간방치한후다시 15,000 rpm에서 30분간원심분리하여상층액은버리고침전물을 20 mm 인산완충용액 (phosphate buffer, ph 7.0) 에현탁시켰다. 이현탁액을 20 mm 인산완충용액에서 18시간이상투석 (dialysis) 하였다. 투석후, 20 mm 인산완충용액 (ph 7.0) 으로평형화된단백질 G-결합컬럼 (Protein G-coupled column) 에투석액을주입하고, 모두주입되고나면인산완충용액을이용하여흡착하지않은물질들을제거하였다. column에결합된항체는 100 mm 글리신용액 (glycine solution, ph 2.8) 용액으로용출 (elution) 시켰다. 용출된항체액을농축한후 150 mm 인산완충용액에서투석하였고, 투석이끝난후브래드포드법 (Bradford assay) 을이용하여항체의양을확인하고사용전까지냉동보관하였다. - 단클론항체의선정 정제된단클론항체를대상으로간흡충의충란과반응성이높은항체를선정하기위해서 ELISA 방법과면역점측정법 (immuno-dot assay) 을이용하여측정하였다. gel로부터추출된간흡충충란항원을 96 well ELISA plate에 2μg / ml의농도로코팅하였다. 정제된단클론항체를각각단계적으로희석하여간흡충충란항원이코팅된플레이트와반응시켰고, 반응후결합되지않은항체를세척과정을통해제거하였다. 고추냉이과산화효소 (horseradish peroxydase) 가결합된산양항생쥐면역글로블린 G (IgG) 를반응시키고, 세척과정을통해반응하지않은과산화효소-IgG를제거하였다. 과산화효소의기질이되는 TMB (tetramethyl benzidine) 를넣고발색시켜반응정도에따른흡광도 (A 450 ) 를측정하였다 ( 표 11). 면역점측정법 (immuno-dot assay) 을이용하여간흡충의충란과반응성이높은항체를선별하였다. 멤브레인에간흡충충란을고정화시키고단클론항체를포함하는세포배양액을반응시킨후, 항생쥐 IgG-gold 축합체를반응시켜서확인하였다 ( 표 11, 그림 7). 선별된간흡충충란항원에대한단클론항체가운데반응성이가장좋은클론 (16F12) 을이용하여키트제작용원료생산에사용하였다. 표 11. 선정된 4 종의단클론항체의항원성

28 그림 7. 선정된 4 종의단클론항체의해리상수 (Kd, dissociation constant) - 단클론항체의이소타이핑 (isotyping) 분비되는항체의이소타입 (isotype) 을확인하고자이소타이핑키트 (Sigma mouse monoclonal antibody isotyping kit, ISO-1, Sigma) 를사용하여이소타입확인을실시하였다. 얻어진단클론항체들의이소타이핑을키트 (Sigma mouse monoclonal antibody isotyping kit) 를통해서분석한결과단클론항체는 4가지클론모두 IgM 클래스 (class) 로확인되었다 ( 표 11). - 단클론항체의간흡충충란과의반응성확인 정제된간흡충충란단클론항체와간흡충충란과의반응성을확인하기위하여 IFA (Indirect fluorescence assay) 를실시하였다. 슬라이드에간흡충충란을처리한후정제된간흡충충란단클론항체와반응시켰다. 2차항체로 TRITC-conjugated anti-mouse IgG를반응시킨후 confocal laser microscope (100배) 로관찰하였다. PBS를사용한대조군과 normal mouse serum을사용한대조군에서는반응이없었고, 간흡충충란단클론항체는충란과반응하여충란의표면에형광이발현되는것이관찰되었다 ( 그림 8)

29 그림 8. IFA (Indirect fluorescence assay) 를이용한간흡충충란단클론항체와 간흡충충란과의반응성확인 4) 간흡충충란특이항체를이용한충란진단키트제조 m 제조내용 - 대변으로부터신속하게간흡충충란을진단하기위해서는금또는라텍스입자에충란항원에특이적인항체를축합시키고응집반응을특수재질의종이나유리판에서확인하도록하였다. m 입자응집법을이용한간흡충충란진단키트의개발은아래와같은순서로진행하였다. - 항체-입자 ( 금또는라텍스 ) 축합체제조 - 축합체반응액제조 - 종이또는유리재질의입자응집반응판제조 - 대변채취용구제조 m 개발된간흡충충란진단키트는아래와같은항목들에대해검증시험을진행하여최대의성능을갖는키트로개발하였다. - 민감도 (sensitivity) 시험 : 간흡충란을액체질소를이용하여파쇄한다음, lysate를만들어서이를이용하여순차적으로희석하여최소검출한계를구하였다. - 특이도 (specificity) 시험 : 다수의음성변을이용하여키트에위양성의결과가있는지확인하였다. - 간섭 ( 방해물질 ), 교차반응성 (cross reactivity) 시험

30 일반시약및단백질들과의교차반응성 : 1,000 ug/ml의농도로각단백질과시약을처리하였을때에, 간섭반응이일어나지않았다. 다른항체양성검체들과의교차반응성 : 변속에는항체가존재하지않기때문에본연구에서는생략하였다. 세균들과의교차반응성 : 진행중에있음 바이러스들과의교차반응성 : 진행중에있음 - 재현성 (reproducibility) 시험 동일인 (Intra), 사람간 (Inter) 시험 로트 (lot), 시험일 (date), 시험장소 (place) 간시험 - 기존제품과의비교또는상관성시험 : 비교할수있는기존제품이없어본연구에서는생략하였다. 다만, 충란수가현미경을통하여확인된대변검체를가지고비교시험을하였다. 결과를비교하였을때, 대변검체를직접키트에 5ul씩넣고검사를할경우, 평균 200 개 /g의충란이존재할때에해당키트에서양성으로결과가나타났다 ( 표 12). 표 12. 기존제품과의비교실험결과 검체명 영동CS320 영동CS160 순천CS132 춘천CS164 순천CS122 충란수 키트결과 ± 검체명 순천296 순천247 순천234 순천238 순천448 충란수 2, 키트결과 + + ± - - 실험장소 : 질병관리본부, 충북오송 5) 간흡충충란진단키트제조방법 m 항체-금입자축합체제조 ( 그림 9) - 단클론항체의준비 축합반응에필요한만큼이상의충분한항체를확보한후, 탄산염완충용액 (Na-carbonate, ph 9.3) 으로충분히투석하였다. - 금입자 (colloidal gold) 준비 일정량의금이온을증류수에녹인후, 100 에서강하게저어주면서적절한환원제를첨가하여콜로이드성금입자를제조하였다. - 금입자-단클론항체축합체의제조 100 ml의콜로이드성금입자용액 (OD 540=2.0) 을준비하여 37 에서 stirring하였다. 이용액에단백질A 또는간흡충충란특이항원을첨가하여 1시간동안혼합하여축합체를제조하였다. 금축합체의세정은 1% BSA, 2mM borate 용액으로수행하였다

31 그림 9. 금입자에충란항원특이적인항체의축합방법 m 항체-금입자축합체의반응성확인 - 항체-금입자결합체를간흡충충란특이항체와간흡충충란과반응시켜반응성을확인하였다. 단클론항체 3D8과 16F12가간흡충충란과결합하여반응성이잘나타난것을확인하였다 ( 그림 10). 그림 10. 간흡충충란특이항체 - 금입자결합체와간흡충충란과의반응성확인 m 항체-라텍스입자축합체제조 ( 그림 11, 12) - 단클론항체의준비 축합반응에필요한만큼이상의충분한항체를확보한후, 탄산염완충용액 (Na-carbonate, ph 9.3) 으로충분히투석하였다. - 라텍스준비 적절한크기의라텍스입자를머크사 (Merk Inc.) 로부터구매하였다. - 라텍스-단클론항체축합체의제조 50 ml의라텍스용액을 0.1M K 2CO 3 를이용하여 ph를 9.0으로맞추었다. 그후, 준비된항체를넣고 37 에서 1시간동안 stirring하였다. 라텍스축합체의세정은 1% BSA, 2mM borate 용액으로수행하였다

32 그림 11. 라텍스입자에충란항원특이적인항체의축합방법 m 축합체반응액개발 - 축합체를장기간보존하면서도반응을효율적으로일으키기위한반응액을준비하였다. 0.1 탄산완충용액 (ph 9.0) 에 1% 카제인, 2% sucrose, 0.1% NaN 3, 0.05% Proclim 300을처리하여준비하였다. 이후, 0.8μm필터로필터링하였다. 제조공정시무균상태에서제조를하며멸균된완충용액병을이용하였다. m 종이또는유리재질의입자응집반응판개발 - 종이재질의반응판 종이반응판은금입자-항체축합체를이용하여검사를할때에사용하였다. 셀룰로오스재질의판위에친수성 / 소수성이 3/7정도되는필름을제작하여코팅하였다. 그후, 직경이 1.5 cm가되는원 (circle) 을소수성성분의잉크로 2mm 두께로그려서제조하였다. - 유리재질의반응판 유리재질의반응판은라텍스-항체축합체를이용하여검사를할때에사용하였다. 유리판위에 1.5 cm가되는원 (circle) 을소수성성분의잉크로 2mm 두께로그려서제조하였다. - 해당공정의경우, 인쇄및유리판생산전문제작업체에외주를주어수행하였다. m 키트의구성 - 키트의경우아래와같은성분으로구성되며, 이를하나의키트로포장하였다. - 키트구성 1 축합체용액및용액병 2 종이또는유리재질의반응판

33 3 완충용액이들어있는대변채취용구 6) 간흡충충란진단키트의민감도및특이도시험 m 민감도 (sensitivity) 및특이도 (specificity) 시험 - 경쟁적라텍스응집법 (competitive latex agglutination) 을이용한간흡충충란검출 항체-라텍스입자축합체를이용한진단키트의간흡충충란반응성을확인하였다. 200 um 크기의 latex 입자를축합한 anti-mouse IgG를유리판에흡착시켰다. 음성대조군으로 PBS, 3D8 항체, 16F12 항체, PBS와간흡충충란 ( 그림 12, circle 1-4) 을각각사용하여반응시켰고, 실험군으로간흡충충란을 3D8 항체와 16F12 항체 ( 그림 12, circle 5-6) 와각각반응시켰다. 음성대조군실험에서는항체-라텍스입자들의응집반응이관찰되었고 ( 그림 12, circle 1-4), 실험군에서는항체-라텍스축합체가간흡충충란과경쟁적으로결합하여응집반응이나타나지않았다 ( 그림 12, circle 5-6). 현재검체및대조군에대한추가검사를진행중에있다. 그림 12. Competitive latex agglutination 방법을이용한간흡충충란특이항체의간흡충충란 검출실험 간흡충충란특이항체 16F12와항체-라텍스입자축합체를이용한진단키트의간흡충충란반응성을확인하였다. 양성대조군으로 PBS와간흡충충란, 항체-라텍스입자축합체를반응시켰고 ( 그림 13, circle 1), 실험군으로간흡충충란특이항체 16F12와간흡충충란, 항체-라텍스입자축합체를 ( 그림 13, circle 2), 음성대조군으로 PBS, 간흡충충란특이항체 16F12, 항체-라텍스입자축합체를 ( 그림 13, circle 3) 각각사용하여반응시켰다

34 음성대조군실험에서는항체 - 라텍스입자들의응집반응이관찰되었고 ( 그림 13, circle 3), 양성대조군과실험군에서는항체 - 라텍스축합체가간흡충충란과경쟁적으로결합하여응집 반응이관찰되지않았다 ( 그림 13, circle 1, 2). 그림 13. Competitive latex agglutination 방법을이용한간흡충충란특이항체 16F12 의간흡충 충란검출실험 - 간흡충충란특이항체, 항체-라텍스입자축합체, 간흡충충란간의응집반응의최적화 응집반응을최적화하기위하여반응조건을달리하여실험을하였다. 항체-라텍스축합체를한방울 (40-50 ul) 과검체 5 ul를혼합하고, 간흡충충란특이항체 16F12를한방울또는두방울 ( ul) 을반응시켰다 ( 그림 14). 실험결과간흡충충란특이항체 16F12를한방울반응시킨실험군에서응집반응이나타나지않음을확인하였다 ( 그림 14, circle 5). 그림 14. 간흡충충란특이항체, 항체 - 라텍스입자축합체, 간흡충충란간의응집반응의최 적화실험

35 - 간흡충충란추출완충액의최적화 간흡충충란추출완충액 (stool extraction buffer) 의최적화를확인하기위한실험을실시하였다. 최적화된완충액의조성은 0.1 M Carbonate, ph 9.5, 0.5% casein, 0.5% Triton X-100, 500 mm NaCl, 10 mam EDTA 였다 ( 그림 15, circle 2, 3). 그림 15. 간흡충충란추출완충액의최적화실험 - 간흡충충란진단키트의실험방법순서 간흡충충란진단키트의실험방법은먼저검체 5 ul를가하고, 간흡충충란특이항체한방울 ( ul), 항체-라텍스축합체를한방울 (40-50 ul) 혼합한후교반기에서 10-15분동안교반한후판독하였을때가장좋은결과를얻을수있었다 ( 그림 16). 그림 16. 간흡충충란진단키트의실험방법 - 간흡충충란진단키트의민감도

36 간흡충충란진단키트의민감도를확인하기위하여간흡충충란 lysate를각각 0, 23.5 ug, 11.8 ug, 2.35 ug, 1.18 ug을사용하여반응시켰다. 간흡충충란 lysate 23.5 ug, 11.8 ug을사용한실험에서는라텍스의응집이일어나지않았고 ( 양성반응 ) ( 그림 17, circle 2-3), 간흡충충란 lysate 2.35 ug, 1.18 ug을사용한실험에서는라텍스의응집반응이나타났다 ( 음성반응 ) ( 그림 17, circle 2-3). 그러므로본키트를이용한간흡층충란진단키트의민감도는간흡충충란 lysate 10 ug으로예상되었다. 그림 17. 간흡충충란진단키트의민감도 m 간섭 ( 방해물질 ), 교차반응성 (cross reactivity) 시험 - 본과제로부터개발된간흡충충란키트의간섭및교차반응이있는지를확인하였다. - 일반시약및단백질들과의교차반응성 간흡충충란진단키트를제작하거나검체를수집하는과정등에서함입될수있는 8가지성분들에대하여 1,000 ug/ml 농도에서교차반응또는간섭을하는지를확인하였다. 실험결과 8가지성분은간섭및교차반응이관찰되지않았다 ( 표 13). 표 13. 간흡충충란진단키트의교차반응성시험 번호물질 (compound) 농도 (Conc. ug/ml) 결과 (result) 1 인간혈청알부민 (Human albumin) 1,000 2 헤모글로빈 (Hemoglobin) 1,000 3 빌리루빈 (Bilirubin) 1,000 4 트리글리세리드 (Triglyceride) 1,000 5 포도당 (Glucose) 1,000 6 시트르산나트륨 (Sodium citrate) 1,000 7 헤파린 (heparin) 1,000 8 EDTA 1,000 교차반응없음

37 m 대변검체에대한키트의민감도 (sensitivity) 및특이도 (specificity) 시험 - 질병관리본부에서양성검체와음성검체를양도받아서본과제로부터개발된키트의민감도와특이도시험을수행하였다. - 민감도 (Sensitivity) 시험 간흡충충란양성검체를사용하여본연구에서개발한진단키트의민감도를시험하였다. 총 41 검체중 28 검체를양성으로진단하였다. 민감도는 68.3% 이었다 ( 표 14). 표 14. 간흡충충란진단키트의민감도시험 간흡충충란진단키트시험결과 간흡충충란 EPG 양성 음성 합계 100 이상 합계 민감도 68.3% - 특이도 (Specificity) 시험 요코가와흡충충란양성검체를사용하여본연구에서개발한진단키트의특이도를시험하였다. 총 60 검체중 3 검체를양성으로진단하였다. 요코가와흡충과이형흡충의중복감염검체는 12건이었으며그중 1건이양성으로진단되었다. 특이도는 95% 이었다 ( 표 15). 표 15. 간흡충충란진단키트의특이도시험 간흡충충란진단키트시험결과 요코가와흡충충란 EPG 양성 음성 합계 100 이상 0 14 (*4) (*2) (*1) 18 (*3) (*2) 14 합계 특이도 95.0% * 이형흡충중복감염 ( 총 12검체 ) m 간흡충충란복합항체를이용한키트의시험 - 기존키트의민감도와특이도를향상시키기위해서간흡충충란특이단클론항체 16F12 와

38 새로운항체 5G4를혼합하여키트를제작하였다. - 기존키트와같은방법으로간흡충충란양성환자, 요코가와흡충및이형흡충양성환자대변샘플에대하여민감도와특이도시험을실시하였다. - 민감도 (Sensitivity) 시험 간흡충충란양성검체를사용하여본연구에서개발한진단키트의민감도를시험하였다. 총 41 검체중 32 검체를양성으로진단하였다. 민감도는 78% 이었다 ( 표 16)

39 표 16. 간흡충충란진단키트의민감도시험 간흡충충란 EPG 간흡충충란진단키트시험결과 양성 음성 합계 100 이상 합계 민감도 78% - 특이도 (Specificity) 시험 요코가와흡충충란양성검체를사용하여본연구에서개발한진단키트의특이도를시험하였다. 총 60 검체중 3 검체를양성으로진단하였다. 요코가와흡충과이형흡충의중복감염검체는 12건이었으며그중 2건이양성으로진단되었다. 특이도는 95% 이었다 ( 표 17). 표 17. 간흡충충란진단키트의특이도시험 간흡충충란진단키트시험결과 요코가와흡충충란 EPG 양성 음성 합계 100 이상 2 12 (*4) (*2) (*1) 19 (*3) (*2) 14 합계 특이도 95.0% * 이형흡충중복감염 ( 총 12검체 ) 6) 현재진행사항및향후추진사항 - 경쟁적라텍스응집법 (competitive latex agglutination assay) 의추가교차반응시험 - 간흡충충란특이항체 16F12의대량생산 - 간흡충충란특이항체 16F12와라텍스입자의축합체제작 - 간흡충충란특이항체 16F12와라텍스입자의축합체를이용한직접적라텍스응집법 (direct latex agglutination assay) 키트개발 제 4 장연구결과고찰및결론

40 7차장내기생충실태조사 (The 7 th Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in Korea, 질병관리본부, 2004; Kim et al., 2009) 에서 14종의기생충질환감염자수는약 189만명으로추산되었고이중담도암 (cholangiocarcinoma) 을일으키는간흡충의충란양성률은전체인구대비 2.9% 로감염자수는 140만명으로기생충관리의중요한문제점으로대두되었다. 간흡충은 ( 肝吸蟲, Clonorchis sinensis) 사람에게감염되어간흡충증 (clonorchiasis) 을일으키며인체내감염은민물고기의피낭유충이인체에경구감염되면십이지장에서탈낭되며유충들이총수담관으로이동하여간내담도의말단부위에서성충으로자라게된다. 간흡충은우리나라를비롯하여중국과일본그리고동남아시아권에걸쳐광범위하게관찰되는만성토착화기생충이다. 간흡충은사람의담관에기생하여염증을일으키거나폐쇄성황달, 복통, 소화불량및무기력증등의증세를일으키며만성적인염증이지속된다. 유행지에서의만성감염은담관암 (cholangiocarcinoma) 발생이다른지역보다 2~3배높은역학적인특성을보인다. 세계보건기구 (World Heath Organization; WHO) 산하국제암연구소 (International Agency for Research on Cancer; IARC) 는간흡충을담관암을일으키는생물학적발암원인체 (Group 1; carcinogen to human) 로공인하였다 (Bouvard et al., 2009). 간흡충진단방법은대변검사 (stool examination) 를통해확진한다. 현재사용중인집란법 ( 포르말린-에테르침전법, MGL법, 이하 MGL법 ) 은전처리시간과인건비가많이들어가는방법이며, 현미경진단이가능한전문인력확보가필요하다. 또한 MGL법은인체에치명적인화학약품을사용하여환경오염및검사자의건강에치명적인악영향을주며보건소등일반검사실에서사용을하지못하고강제환풍장치나대변처리상자등과같은특수한처리시설이갖추어져야하는상황이다. 과거에비하여민물고기의간흡충피낭유충감염률과감염강도는낮아지고있으며낮은충체에의한낮은충란생산으로대변내에서현미경검사로충란의검출률이낮아져오진의확률이높아지고있는실정이다. 이들의단점을보완하기위하여보체결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, 효소면역법등과 ELISA 방법등 (Walton and Chyu, 1959; Seo et al., 1981) 이연구적용되었으나교차반응, 조항원에의한민감도와특이도의향상에한계가있음이밝혀졌다. 또한간흡충이나폐흡충증진단을위한특이항원발굴및에재조합단백질적용연구가우리나라, 일본, 중국및동남아시아를중심으로부분적으로진행되어왔으며특히단백질분해효소에대한연구가활발히진행되었다 (Song et al., 1991; Kim et al., 2001; Na et al., 2002; Kang et al., 2004; Li et al., 2004; Nagano et al., 2004; Lee et al., 2006). 기생충질환의진단에고전적으로사용되고있는 MGL법의단점으로지적되고있는 1) 장시간소요되는전처리과정, 2) 과도한인력소모, 3) 독성약품처리를위한열악한환경을개선할필요가있다. 또한낮은충란검출률과충란감별진단에필요한전문성을극복할수있는간편하고신속하며일반실험실과현장에서바로적용할수있는새로운진단방법 (POCT, point-of-care test) 개발이필요하다. 간흡충특이진단법개발을위해서는특이항원을발굴하고기존검사법의문제점으로제기된 1 민감도 / 특이도의향상, 2 현증및과거감염감별능력등을향상시키기위한노력이필요하다. 본연구에서는간흡충의효율적진단을위하여대변검사전처리과정의간소화, 검출률향상, 충란감별진단의전문성을극복할수있는진단키트 (rapid diagnosis test; RDT) 를제조하고그유용성을평가하고자하였다. 간흡충충란을항원으로사용하여간흡충충란특이단클론항체를제작하였다. 간흡충충란을항원으로사용하여 ELISA, strip assay, line assay, dot assay를실시하여융합세포주를스크린하였다

41 융합세포주의민감도와특이도를확인한결과 4개 strain (3D8, 3H8, 5G4, 16F12) 이우수한결과를보였다 ( 표 11). 융합세포주를생후 6~8주된쥐 (BALB/c) 의복강에주사한후복수 (ascitic fluid) 를채취하고정제하여키트의재료로사용하였다. 분비되는항체의이소타입 (isotype) 을확인한결과얻어진단클론항체들은 4가지클론모두 IgM 클래스 (class) 로확인되었다. 정제된간흡충충란단클론항체와간흡충충란과의반응성을확인하기위하여 IFA (Indirect fluorescence assay) 를실시하였다. 간흡충충란단클론항체는충란과반응하여충란의표면에형광이발현되는것이관찰되었다 ( 그림 8). 그러므로제작된간흡충충란단클론항체는충란에특이적으로결합하는것을확인하였다. 대변으로부터신속하게간흡충충란을진단하기위해서금또는라텍스입자에충란항원에특이적인항체를축합시키고응집반응을특수재질의종이나유리판에서확인하였다. 항체-금입자결합체를간흡충충란특이항체와간흡충충란과반응시켜반응성을확인하였다. 단클론항체 3D8과 16F12가간흡충충란과결합하여반응성이잘나타난것을확인하였다 ( 그림 10). 경쟁적라텍스응집법 (competitive latex agglutination) 을이용하여진단키트의간흡충충란반응성을확인하였다. 음성대조군실험에서는항체-라텍스입자들의응집반응이관찰되었고, 3D8 항체, 16F12 항체실험군에서는항체-라텍스축합체가간흡충충란과경쟁적으로결합하여응집반응이나타나지않았다 ( 그림 12). 간흡충충란특이항체 16F12와항체-라텍스입자축합체를이용한진단키트의간흡충충란반응성을확인하였다. 음성대조군실험에서는항체-라텍스입자들의응집반응이관찰되었고간흡충충란특이항체 16F12와간흡충충란, 항체-라텍스입자축합체를반응시켰을때항체-라텍스축합체가간흡충충란과경쟁적으로결합하여응집반응이관찰되지않았다 ( 그림 13). 간흡충충란특이항체 16F12 한방울 (40-50 ul), 항체-라텍스축합체한방울 (40-50 ul) 과검체 5 ul를혼합하고반응시켰을때응집반응이나타나지않음을확인하였고 ( 그림 14) 이조건이응집반응의최적화임을확인하였다. 간흡충충란추출완충액 (stool extraction buffer) 의최적화된조성은 0.1 M Carbonate, ph 9.5, 0.5% casein, 0.5% Triton X-100, 500 mm NaCl, 10 mam EDTA 였다 ( 그림 15). 간흡충충란 lysate를사용하여간흡충충란진단키트의민감도확인결과진단키트의민감도는간흡충충란 lysate 10 ug으로예상되었다. 그리고간흡충충란진단키트를제작하거나검체를수집하는과정등에서함입될수있는 8가지성분들에대하여 1,000 ug/ml 농도에서교차반응또는간섭을하는지를확인하였다. 실험결과 8가지성분은간섭및교차반응이관찰되지않았다 ( 표 13). 간흡충충란양성환자, 요코가와흡충및이형흡충양성환자대변검체에대한키트의민감도 (sensitivity) 및특이도 (specificity) 시험결과민감도는 68.3% 이었고 ( 표 14), 특이도는 95% 이었다 ( 표 15). 본키트는특이도가아주우수하였다. 키트의민감도와특이도를향상시키기위해서간흡충충란특이단클론항체 16F12와새로운항체 5G4를혼합하여키트를제작하였다. 개량된키트의민감도는 78% 이었고 ( 표 16), 특이도는 95% 이었다 ( 표 17). 추후에본연구에서개발한간흡충충란특이단클론항체들을사용하여복합항원을제작시민감도와특이도를더욱향상시킬수있을것으로예상된다. 본연구에서간흡충충란에특이적으로반응하는단클론항체를제작하였고이를이용하여간흡충충란진단키트를개발하였다. 이진단키트는간흡충충란 lysate 10 ug을진단할수있고, 진단과정에서오염될수있는여러가지성분들에대해교차반응이없는민감도와특이도가우수한진단키트이다

42 간흡충및장흡충양성환자대변에대한민감도와특이도는각각 78% 와 95% 이었다. 그러므로이키트는간흡충의효율적진단을위하여대변검사전처리과정의간소화, 검출률향상, 충란감별진단의전문성을극복할수있는진단키트 (rapid diagnosis test; RDT) 가될것이다. 향후추가교차반응시험과직접적라텍스응집법 (direct latex agglutination assay) 키트를개발할예정이다. 본연구에서개발한진단키트는기존의대변검사법이갖는높은민감도와특이도를유지하면서단점으로지적되어진검사시간과인건비를효율적으로크게단축할것이다. 그러므로본연구에서개발된대변을이용한신속충란검사키트는획기적으로간흡충질환의퇴치에기여하며국가기생충표준품으로적용되어국가보건안정망구축기여될수있을것이며향후다른기생충질환진단키트개발에응용할수있을것이다

43 제 5 장연구성과및활용계획 5.1 활용성과 과제명간흡충란검출용래피드진단키트개발 과제책임자 김동수 / 인하대학교의학전문대학원기생충학교실 / 기생충학전공 가. 연구논문 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 2 국내 / 국외 SCI여부 나. 학술발표 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지 1 2 국내 / 국제 다. 지적재산권 번호출원 / 등록 1 2 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 라. 정책활용 m 간편하고신속한진단키트사용에따른감염지역주민검사결과확보및기생충예방및홍보관리수립 마. 타연구 / 차기연구에활용 m 일반적으로기생충진단은충란을인체가검물또는조직에서직접검출하는것이가장좋은확진법이며이밖에임상증상과방사선학적검사가진단에도움이되지만다른질병과확실하게감별하거나원인기생충을확진할수있는방법은되지못하는단점이있다. 반면에기생충란을이용하는데는고도의기술훈련이필요하며많은시간과노동력이필요로하는단점을갖고있다. m 이번연구에서개발한충란을이용한진단법은특이도와민감도가높으며, 사용법이원스텝 (one-step) 으로무척간편하고고가의장비의도움없이신속하게현장검증 (point-of-care testing, POCT) 이가능한세계최초의간흡충충란검사진단키트이나흔히진단키트에서나타나는몇가지단점을보완하기위한추가연구가필요하다고사료된다

44 바. 언론홍보및대국민교육 해당사항없음 사. 기타 해당사항없음 5.2 활용계획 - 본연구에서개발될진단키트는기존의진단키트보다특이도와민감도가높으며, 사용법이 원스텝 (one-step) 으로무척간편하고고가의장비의도움없이신속하게현장검증 (point-of-care testing, POCT) 이가능한세계최초의간흡충충란검사진단키트이다. - 본연구에서개발될진단키트는실제간흡충감염지역주민이거주하는농어촌지역이나섬지역, 그리고보건의료시스템이낙후된지역에서간편한검사가가능할것으로기대되며이에따른 국가기생충표준품적용으로국가보건안정망구축기여될수있다

45 제 6 장기타중요변경사항 해당사항없음 제 7 장연구비사용내역 ( 단위 : 원 ) 구 분 비 목 금액사용액구성비잔액 m 인건비소계 12,000,000 11,091, ,220 책임연구원 연구원 연구보조원 12,000,000 11,091, ,220 보조원 m 경비소계 38,000,000 38,055, ,000 ( 입금완료 ) 여 비 2,774,000 3,570, ,140 유인물비 100, , 전산처리비 시약및연구용재료비 32,021,000 31,624, ,140 회의비 400, ,000 임차료 교통통신비 감가상각비 위탁정산수수료 330, , ,000 일반관리비 ( )% 2,375,000 2,375, 이윤 ( )% m 계 50,000,000 49,146, ,220 * 질병관리본부학술및전산용역사업편람에따라구체적으로작성하시기바랍니다

46 제 8 장참고문헌 1) Véronique Bouvarda, Robert Baana, Kurt Straifa, Yann Grossea, Béatrice Secretana, Fatiha El Ghissassia, Lamia Benbrahim-Tallaaa, Neela Guhaa, Crystal Freemana, Laurent Galicheta, Vincent Coglianoa and on behalf of the WHO International Agency for Research on Cancer Monograph Working Group A review of human carcinogens Part B: biological agents 2009; Lancet Oncology 2009; 10(4): ) Kang TH, Yun DH, Lee EH, Chung YB, Bae YA, Chung JY, Kang I, Kim J, Cho SY, Kong Y. A cathepsin F of adult Clonorchis sinensis and its phylogenetic conservation in trematodes. Parasitology 2004; 128: ) Kim TI, Hong SJ. Recent advances in serodiagnosis for clonorchiasis. Hanyang Medical Review, 2010; 30(3): ) Kim TS, Cho SH, Huh S, Kong Y, Sohn WM, Hwang SS, Chai JY, Lee SH, Park YK, Oh DK, Lee JK. A nationwide survey on the prevalence of intestinal parasitic infections in the Republic of Korea, Korean J Parasitol 2009; 47: ) Kim TY, Kang SY, Park SH, Sukontason K, Sukontason K, Hong SJ. Cystatin capture enzyme-linked immunosorbent assay for serodiagnosis of human clonorchiasis and profile of captured antigenic protein of Clonorchis sinensis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2001; 8: ) Korea Centers for Disease Control and Prevention, Korea Association of Health Promotion: Prevalence of intestinal parasites in Korea. The 7th Report. Seoul, Korea, ) Lee EG, Na BK, Bae YA, Kim SH, Je EY, Ju JW, Cho SH, Kim TS, Kang SY, Cho SY, Kong Y Identification of immunodominant excretory-secretory cysteine proteases of adult Paragonimus westermani by proteome analysis. Proteomics 6, ) Li S, Chung YB, Chung BS, Choi MH, Yu JR, Hong ST. The involvement of the cysteine proteases of Clonorchis sinensis metacercariae in excystment. Parasitol. Res. 2004; 93: ) Na BK, Lee HJ, Cho SH, Lee HW, Cho JH, Kho WG, Lee JS, Lee JS, Song KJ, Park PH, Song CY, Kim TS. Expression of cysteine proteinase of Clonorchis sinensis and its use in serodiagnosis of clonorchiasis. J. Parasitol. 2002; 88: ) Nagano I, Pei F, Wu Z, Wu J, Cui H, Boonmars T, Takahashi Y. Molecular expression of a cysteine proteinase of Clonorchis sinensis and its application to an enzyme-linked immunosorbent assay for immunodiagnosis of clonorchiasis. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004; 11:

47 11) Ritchie LS An ether sedimentation technique for routine stool examination. Bull US Army Med Dep, 8(4): ) Seo BS, Lee SH, Cho SY, Chai JY, Hong ST, Han IS, Sohn JS, Cho BH, Ahn SR, Lee SK, Chung SC, Kang KS, Shim HS, Hwang IS. An epidemiologic study on clonorchiasis and metagonimiasis in riverside areas in Korea. Korean J. Parasitol. 1981; 19(2): ) Song CY, Rege AA. Cysteine proteinase activity in various developmental stages of Clonorchis sinensis: a comparative analysis. Comp. Biochem. Physiol. 1991; 99: ) Walton BC, Chyu I. Clonorchiasis and paragonimiasis in the Republic of Korea. Report on a prevalence survey using intradermal tests. Bull. World Health Organ. 1959; 21: 제 9 장첨부서류 해당사항없음