조직배양 기술을 이용한 괄루근(栝樓根, Trichosnathis Radix) 기원식물 하늘타리 부정근 배양에 대한 소고(小考)

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욱환 자
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1 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(2): pissn / eissn 조직배양기술을이용한괄루근 ( 栝樓根, Trichosnathis Radix) 기원식물하늘타리부정근배양에대한소고 ( 小考 ) * 주수지인턴연구원, 김용구박사후과정, 강영민교수 책임연구원 한국한의학연구원한약연구부 A study on propagation of the Trichosnathis Radix (Trichosanthes kirilowii Maxim. Root) using tissue culture techniques Joo Suji, Kim Yong-goo, Kang Youngmin * Herbal Medicine Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 34054, Republic of Korea Abstract The genus Trichosanthes (Cucurbitaceae) is a perennial vine plant native to China, Japan, Mongolia and Taiwan. However, the species T. kirilowii Maxim. and T. kirilowii var. japonica Kitam. are native plants mostly in Korea and Japan. T. kirilowii, is used as a Korean and Chinese medicinal herb. However, the roots which are used in traditional medicine take several years to mature when cultivated in a traditional way. Fortunately, through tissue culture techniques, the roots can be produced in a shorter period of time. This in vitro study therefore was conducted to identify and establish the optimal medium and plant growth regulator type and concentrations suitable for adventitious root formation and biomass enhancement of T. kirilowii roots. The wild roots were collected, disinfected and cultured in MS and DJ solid and liquid agitator culture basal media supplemented with auxin-based hormone IBA to induce adventitious roots and increase the biomass within a minimal time frame. We expect to establish a system of root cultivation of T. kirilowii for the stable supply of substantial mass production in the future by providing a standard in vitro propagation protocol for the root cultivation. Keywords: Trichosanthes kirilowii Maxim., Trichosanthes kirilowii var. japonica Kitam., adventitious root, plant growth regulators, tissue culture, in vitro propagation protocol Correspondence: Kang Youngmin University of Science & Technology, Korean Medicine Life Science Major, Campus of Korea Institute of Oriental Medicine Herbal Medicine Research Division, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 34054, Republic of Korea Tel: , Fax: , ymkang@ust.ac.kr Received , revised , accepted , available online doi: /khmi

2 주수지외. 조직배양기술을이용한괄루근기원식물하늘타리부정근배양에대한소고 서론 하늘타리 (Trichosanthes kirilowii Maxim.) 와노랑하늘타리(Trichosanthes kirilowii var. japonica Kitam.) 는박과(Cucurbitaceae) 하늘타리속(Trichosanthes) 에속하는다년생덩굴식물이며우리나라 중부이남에분포한다 1-3). 이중한약재로사용되는괄루근( 栝樓根, 생약명 Trichosanthis Radix) 은 하늘타리또는쌍변괄루 ( 雙邊栝樓, Trichosanthes rosthornii Harms.) 의뿌리의표피를제거한것으 로규정되어있다 3). 하늘타리는한국, 일본, 몽골, 대만등에서자생하는박과의다년생덩굴성초본으 로잎은호생이고둥근모양이며, 단풍잎처럼 5~7 갈래로갈라지며각열편에톱니가있고, 아랫부분은 심장형이며잎표면에짧은털이있다. 덩굴손은잎과대생( 對生 ) 이며, 다른물체에 5m 정도까지감겨 올라간다. 7~9 월에백색꽃이피고열매는구형으로 10 월에성숙되며많은종자가들어있고주황색으 로익는다 4-7). 8) 하늘타리뿌리는녹말을내어식용하였으며, 열매, 씨앗및뿌리를약용으로사용해왔다. 한방에서 는열매( 瓜蔞 ) 와뿌리( 栝樓根 ) 를해열, 해수, 이뇨, 변비, 어혈, 황달, 피부병, 결핵, 유방암, 적백리, 당뇨병등의치료에사용한다 2). 또한 trichosanthin (TCN), TAP-29, trichokirin, α-kirilowin, β -kirilowin, karasurin 과같은다양한 ribosomal inactivating protein (RIP) 들이하늘타리의종자와 근경에서생합성되는것으로알려져있다 9-12). 이중 trichosanthin 은항진균성물질로항암작용은 물론 HIV (human immunodeficiency virus) 의복제를억제하는것으로도알려지고있다 13). 약용식물은기원이확실하고외관이균일하고양호하며약효성분의함량이기준치이상이고안전성 이확보된것이라고할수있다 3). 하지만, 한약재의수요증가로인한수입과시장의유통물량은증가하 고있으나, 약재의기원이나품질기준이명확하지않은상황이다. 또한한약재는생육지, 재배관리, 채집시기등에따라외관, 색상등이다를수있고, 성분함량에차이가있을수있다 14-15). 하늘타리는국내에서재배가거의이뤄지지않아야생하늘타리를그대로채취해서식 약용목적으 로사용하고있으나수요대비공급양이부족하기때문대부분중국에서수입하고있다 16). 뿌리를 약용으로이용하고재배기간이수년간이소요되는경우는조직배양을통해식물체의개체형성능을 이용하여세포나조직이세포전체의형태를형성하거나식물체를재생하게하여단기간에대량으로 뿌리를생산할수있는효과적인방법으로활용될수있다 17-18). 일례로, 재배기간이긴인삼은산업적 으로응용하기에어려운점이있다. 이와같은문제점을해결하기위해조직배양에의해생산된인삼 캘러스나부정근을사용하기위한연구가지속적으로진행되고있으며 19), 또한부정근을이용한기내 배양연구방법은부정근증식기간의단축과이차대사물질의생산비율이높아천연물을연구하는데 적합하다고보고되어있다 20). 본논문에서는한약재기원식물하늘타리에서부정근을유도하기위한 기내증식법을소개함으로써관련연구자들에게미래연구의방향과방법에대한정보를제공하고자 한다. 136

3 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(2): pissn / eissn 본론 1. 하늘타리의기원및각국약전비교 하늘타리의기원정보는각국공정서및이를정보화한한약기원사전에수록되어있다 2,21-24). 각 나라의공정서를비교함으로써, 한약의기원식물을정리하여그차이를비교할필요가있다. 이를통해 정확한기원에대한정보를연구자에게제공할수있기때문이며, 본논문에서는이를바탕으로하늘타 리의기원및세부내용을비교분석하였다. 하늘타리의기원및자세한내용은표 1 에정리하였다. Table1. The authentic herbal medicines originated from Trichosanthes species in national pharmacopoeia. Country Pharmacopeia information Origin 한국 3) 중국 21) 일본 22) 대만 22) - 출전 : 대한민국약전제 11 개정(KP 11) - 약명 : 괄루근( 栝樓根 ) - 생약명 : Trichosanthis Radix - 영문약명 : Trichosanthes Root - 약명 : 괄루인( 栝樓仁 ) - 생약명 : Trichosanthis Semen - 영문약명 : Trichosanthes Seed - 출전 : 중화인민공화국약전 2015년판 (ChP 2015) - 약명 : 천화분( 天花粉 ) - 생약명 : Trichosanthis Radix - 약명 : 과루자( 瓜樓子 ) - 생약명 : Trichosanthis Semen - 약명 : 초과루자( 炒瓜蒌子 ) - 생약명 : Trichosanthis Semen Tostum - 약명 : 과루( 瓜蔞 ) - 생약명 : Trichosanthis Fructus 하늘타리 (Trichosanthes kirilowii Maximowicz) 또는쌍변괄루 ( 雙邊栝樓. Trichosanthes rosthornii Harms) ( 박과 Cucurbitaceae) 의뿌리로피부를제거한것 하늘타리또는쌍변괄루의잘익은씨 박과( 호로과葫蘆科 ) 식물하늘타리( 괄루栝樓. Trichosanthes kirilowii Maxim.) 또는쌍변괄루( 雙邊栝樓. Trichosanthes rosthornii Harms) 의뿌리를말린것. 가을철과겨울철에채취하여, 씻어서겉껍질을제거하고길게자르거나세로로쪼개어말림 박과식물하늘타리또는쌍변괄루의잘익은씨를말린것. 가을철에잘익은열매를채취하여쪼개어씨를꺼내고씻어서햇볕에말린다. 과루자( 瓜樓子 ) 를포제가공한것. 과루자를가지고초법( 炒法 ) 에따라약한불로살짝부풀어오를때까지볶은다음꺼내어식힌다. 박과식물하늘타리또는쌍변괄루의잘익은열매를말린것. 가을철에열매가잘익었을때열매꼭지째로잘라서통풍이잘되는그늘에서말린다. - 약명 : 과루피( 瓜蔞皮 ) 박과식물하늘타리또는쌍변괄루의잘익은열매의껍질을말린것. 가을철에 - 생약명 : Trichosanthis Pericarpium 잘익은열매를채취하여, 쪼개어열매속및씨를제거하고그늘에서말린다. 하늘타리 Trichosanthes kirilowii Maximowicz, - 출전 : 일본약국방제17 개정(JP 17) 노랑하늘타리( 키카라스우리キカラスウリ) Trichosanthes kirilowii - 약명 : 괄루근( 栝楼根 ) Maximowicz var. japonica Kitamura 또는오오카라스우리 ( オオカラスウリ ) - 생약명 : Trichosanthis Radix Trichosanthes bracteata Voigt ( 박과 Cucurbitaceae) 의피층( 皮層 ) 을 - 영문약명 : Trichosanthes Root 제거한뿌리 - 약명 : 괄루인( 栝楼仁 ) - 생약명 : Trichosanthis Semen - 영문약명 : Trichosanthes Seed 하늘타리, 노랑하늘타리또는오오카라스우리의씨 - 출전 : 대만중약전제 2 판(THP II) 박과( 호로과葫蘆科, Cucurbitaceae) 식물하늘타리( 괄루栝樓. - 약명 : 괄루근( 栝樓根 ) Trichosanthes kirilowii Maxim.) 또는쌍변괄루( 雙邊栝樓. Trichosanthes - 생약명 : Trichosanthis Radix rosthornii Herms) 의뿌리를말린것 - 영문약명 : Trichosanthes Root - 약명 : 괄루인( 栝樓仁 ) 박과식물하늘타리또는쌍변괄루의잘익은씨를말린것 137

4 주수지외. 조직배양기술을이용한괄루근기원식물하늘타리부정근배양에대한소고 북한 24) 기타 - 생약명 : Trichosanthis Semen - 영문약명 : Trichosanthes Seed - 출전 : 조선인민민주주의공화국약박과(Cucurbitaceae) 하늘타리(Trichosanthes kirilowii Maxim.) 의뿌리. 전제7 판(DP VII) 가을에뿌리를캐여물에씻고겉껍질을벗긴다음썰거나쪼개서햇볕에 - 약명 : 하늘타리뿌리말림 - 생약명 : Radix Trichosanthis - 약명 : 하늘타리씨 - 생약명 : Semen Trichosanthis [ 하늘타리가공및법제] - 천화분 ( 天花粉 ) - 하늘타리뿌리 박과하늘타리의여문씨. 익은열매를따서씨를모아햇볓에말린다. [ 주의사항] 천오( 川烏 ) 제천오( 制川烏 ) 초오( 草烏 ) 제초오( 制草烏 ) 부자( 附子 ) 와함께사용하면안된다. 2. 하늘타리기내배양방법의종류 기내에서기본적으로무균식물체및조직이만들어지고나서번식을하는방법은여러가지가있을 수있지만, 약용부위가덩이뿌리인하늘타리의경우는 1 차적으로고체배지및액체배지를이용한번 식이가능하다. 한천( 寒天, agar) 을넣어일정온도이상으로열을가하여만들어지는고체배지는배양 용기에서식물체를지지하는역할을하기때문에정지된상태에서식물체를배양할때사용한다. 반면 에액체배지는한천을넣지않고액체상태에서 100 rpm 전후의교반(shaking) 혹은현탁 (suspension) 을통해식물을회전배양할때사용된다. 3. 하늘타리기내배양장단점 가. 배양상태및배양조건에따른장점 고체배양은배양용기에서식물체를지지하는역할을하며정지된상태에서식물체를배양할수있다. 초기생장촉진을위한호르몬테스트를통해부정근을유도하기쉽다. 액체배양은현탁배양을하기 때문에 3 차원적으로모든조직이영향을받고, suspension 되는동안 biomass 의증대가고체배양보 다높다. 또한부정근을대량으로배양이가능하고계대배양이쉽다. 간단한배지테스트및호르몬 테스트를위해서는고체배양이용이하며, 특정부위의재분화와 biomass 증진을유도하기위해서는 액체배양이더편리하다 30). 하늘타리의부정근을유도할경우식물생장조절제의영향즉, 종류별, 농도 별, 시기별등을고려해서최적생산배지의조건을확립하는것이중요하며고체배지와액체배지의 상태를고려하여최적시기및조건(cf. 4 주전후) 에계대배양( 繼代培養, subculture) 을하는것이중 요하다. 나. 배양상태및배양조건에따른단점 고체배양은계대가불편하며소규모대량번식의한계점이있다. 액체배지는장기간동안액체배양 을할경우식물생장조절제(cf. auxin) 에악영향을미쳐서다시고체배지로치상했을경우재분화 (regeneration) 혹은전형성능( 全形成能, totipotency) 이상실될수있다. 138

5 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(2): pissn / eissn 하늘타리한약자원식물의기내배양 가. 하늘타리의무균기내식물체생산 국내주요산지( 제주도및중부이남) 에서자생하는하늘타리종자나식물체는수집하여증식에이용 할경우에는형태학적분류및유전적검증을통해그기원을확인한후기내배양의재료로사용하는 것이바람직하다 25-26). 뿌리를 1 차증류수와 100% ethanol 로표면소독후, 70% (v/v) ethanol 에 30 초간침지한뒤멸균수로세척하였다. 3% (v/v) NaOCl (sodium hypochlorite) 용액에총 10 분간 표면살균후세척된시료를 MS (Murashige & Skoog, 1962) 와 DJ (De Greef & Jacobs, 1979) 배지를 기본배지로실험에이용하였다. 나. 하늘타리기내식물을이용한부정근유도 하늘타리의뿌리조직을선발하여 DJ 기본배지와 MS 기본배지에식물생장조절제(plant growth regulator) 중 auxin 계 IBA (3-indole butyric acid) 를 1.0 mg/l, 5.0 mg/l 를각각첨가한배지에 치상하여 4 주간식물체의부정근(adventitious root) 을유도하였다. 식물생장조절제인 IBA 는뿌리와 캘러스를형성하는데사용되며, 다른옥신과비교하였을때더많은양의뿌리를생산하는것으로 알려져있다 29). 다. 생물반응기를이용한액체교반기배양( 부정근배양) 하늘타리의뿌리는약용으로써활용도가높아서뿌리비대방법과표준육묘생산체계구축은미래 한약자원을확보하고효율적인재배기술을선점하는데필요한체계적인생산기술개발의일환으로 큰의의가있다 30). 기내식물체를바탕으로부정근증식에효과적인배지조성확립을위해배양을 실시하였다. 그리고최소한의시간으로뿌리가최대로비대되거나 biomass 를증대시키기위해옥신 계호르몬인 IBA 를추가적으로첨가할수있다. MS 와 DJ 를기본고체배지로사용하였고 IBA 1.0 mg/l 와 5.0 mg/l 를각각첨가하였다. 하늘타리뿌리는 4 주간 IBA 1.0 mg/l 와 5.0 mg/l 가각각 첨가된 MS 와 DJ 기본고체배지에서부정근배양을하였다(Fig. 2, 3). 기본 MS 배지와 DJ 배지에서 가늘고긴부정근이유도되는것이확인되었다(Fig. 2-d, Fig. 3-d). IBA 1.0 mg/l 가첨가된 MS 배지에서는작은돌기를형성하는형태의부정근이유도되는것을확인하였다(Fig. 2-e). DJ 배지에서 유도된부정근은전체적으로형태와근정단부분이정상적이며, 측근형성이양호함을보였다(Fig. 3-e). IBA 5.0 mg/l 가첨가된 MS 배지에서유도된부정근은전체적으로시간이지날수록비대되는 것을확인하였다(Fig. 2-f). DJ 배지에서유도된부정근은전체적으로짧고뿌리끝이무딘형태가 관찰되었다(Fig. 3-f, Table 2). 생물반응기(bioreactor) 를이용하여대량증식방법이약용식물의 bio- mass 생산에많이이용되고있다. 고체배지를통해부정근의증식에효과적인배지조성을확립한 후액체배지를통한부정근증식에효과적인배지조성을확립을위해액체교반기배양을실시하였다 (Fig. 4). 139

6 주수지외. 조직배양기술을이용한괄루근기원식물하늘타리부정근배양에대한소고 Figure 1. Establishment for in vitro propagation of Trichosanthes kirilowii. Figure 2. Induction of adventitious root from root on MS medium with various concentrations of IBA after 4 weeks of culture. (a d: MS, b e: MS + IBA 1.0 mg/l, c f: MS + IBA 5.0 mg/l) (Bar = 1 cm) 140

韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(2):135-144.

0 mg/l, c f: DJ + IBA 5.0 mg/l) (Bar = 1 cm) Figure 4.

7 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(2): pissn / eissn Figure 3. Induction of adventitious root from root on DJ medium with various concentrations of IBA after 4 weeks of culture. (a d: DJ, b e: DJ + IBA 1.0 mg/l, c f: DJ + IBA 5.0 mg/l) (Bar = 1 cm) Figure 4. Growth of adventitious roots of in Trichosanthes kirilowii liquid culture. (a: MS, b: MS + IBA 1.0 mg/l, c: MS + IBA 5.0 mg/l, d: DJ, e: DJ + IBA 1.0 mg/l, f: DJ + IBA 5.0 mg/l) 141

8 주수지외. 조직배양기술을이용한괄루근기원식물하늘타리부정근배양에대한소고 Table 2. Effect of medium on the adventitious root. Media IBA concentration (mg/l) Adventitious root 0 ++ MS DJ 결론 본논문은국내한약재중하나인하늘타리의뿌리배양법에대한정보를제공함으로써, 각국공정서 의기원내용, 기원식물의범위, 뿌리배양방법, 기내배양시요구되는유의사항등다양한사례를 소개하였다. 이를통해국내한약재기원식물의중요성을강조하고효과적인생산사례를소개함으로 써추후에실질적인대량생산의안정적인공급을위한하늘타리뿌리배양의체계가확립되길기대해 본다. 감사의글 한국한의학연구원주요사업 안정적한약자원확보기술개발( 총괄 K18400, 세부 K18405: 한약자원 국내생산기반기술개발) 의지원으로수행하였고, 시료수집과시료보존에도움을주신한약연구부 연구자들에게감사를표합니다. 참고문헌 1. Lee, Y. N. New Korean illustrated plant book I. Seoul:Kyohaksa. 2000:639, Zhu, Y. P. Chinease Material Medica. Harwood Academic Publishers. 1998: 대한민국식품의약품안전처. 한약재안전및품질관리규정. 식품의약품안전처고시제 호. 4. Kim, T. J. Korea's Resources Plants (IV). Seoul National University Pub Jung B. S., Shin M. K. Encyclopedia of Traditional Drug (2nd ed). Younglim Pub. 1998: Huang, Y., He, P., Bader, K. P., Radunz, A., & Schmid, G. H. Seeds of Trichosanthes kirilowii, an energy-rich diet. Zeitschrift für Naturforschung C. 2000;55(3-4): Hoe, J. Dong-Eui-Bo-Gam. (1st ed.). Bub-In Pub. 1999:682,1238, LEE, Y. N. A New Korean Illustrated Plant Book. Gyo Hak Sa.[in Korean] Lee-Huang, S., Huang, P. L., Kung, H. F., Li, B. Q., Huang, P., Huang, H. I., & Chen, H. C. TAP 29: an anti-human immunodeficiency virus protein from Trichosanthes kirilowii that is nontoxic to intact cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 1991:88(15); Toyokawa S., Takeda T., Ogihara Y. Isolation and characterization of Trichosanthes kirilowii 142

9 韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2018;6(2): pissn / eissn Max. var. japonicum Kitam, Chem. Pharm. Bull. Tokyo. 1991;39: Casellas P., Dussossoy D., Falasca A. L., Barbieri L., Gullemot J. C., Ferrara P., Bolognese A., Cenini P., Stripe F. Trichokirin, a rigosome-inactivating protein from seeds of Trichosant hes kirilowii Max. Purification, partial characterization and use for preparation of immunotox ins. Eur. J. Biochem. 1988;176: Dong T. X., Nag T. B., Yeung H. W., Wong R. N. Isolation and characterization of a novel ribosome-inactivating protein, beta-kirillowin, from the seeds of Trichosanthes kirilowii Ma x. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994;199: Byers, V. S., A. S. Levin, L. A. Waites, B. A. Starrett, R. A. Mayer, J. a., M. R. Price, R. A. Robins, M. Delaney, and R. W. Baldwin. A phase Ⅰ/ Ⅱ study of tichosantin treatment of HIV disease. AIDS ; 이진만, 이상한, 김환묵. 약용식품으로한약재의이용. 식품산업과영양. 2000;5(1): 김관수, 류수노. 약용식물의품질평가현황과전망. 한국작물학회지. 2002;47: Jo, D. H., Jeong, B. J., & Kim, M. S. Cultivation research of Trichosanthes kirilowii. Naju, Korea:Jeollanamdo Agricultural Research and Extension Services. 2007; Yu K. W., Hahn E. J., Paek K. Y. Production of adventitious ginseng roots using bioreactor. Kor J Plant Tiss Cult. 2000;27: Samuelsson, G. Plant Tissue Culture. In drugs of Natural Origin. Swedish Phamaceutical Pres s. 1992: Lee, H. O. E. C. S. Optimization of submerged ginseng root culture conditions for the product ion of saponin. Journal of Ginseng Research, 2000;24: Sivakumar G., Yu K. W. and Paek K. Y. Production and biomass and ginsenosides from adven titious roots of Panax ginseng in bioreactor cultures. Engineering in Life Sciences. 2005;5: Phamrmacopoeia of the People s Republic of China (China) 22. The Japanese Pharmacopoeia 17th deition, (Japan) 23. Taiwan Herbal Phamacopeia 2nd edition, (Taiwan) 24. The Pharmacopoeia of Democratic People s Republic of Korea 7th edition, (Korea, Dem ocratic People s Republic of) 25. Moon, B. C., W. J. Kim, Y. Ji, Y. M. Lee, Y. M. Kang, and G. Choi. Molecular identification of the traditional herbal medicines, Arisaematis Rhizoma and Pinelliae Tuber, and common adulterants via universal DNA barcode sequences. Genetics and Molecular Research. 2016;15 (1):gmr Zhang, J. Y., Q. S. Guo, and D. S. Zheng. Genetic diversity analysis of Pinellia ternata based on STAP and TRAP markers. Biochem. Syst. Ecol. 2013;50: Murashige, T., and F. Skoog. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 1962;15: De Greef, W., and M. Jacobs. In vitro culture of sugar beet: description of a cell line with high regeneration capacity. Plant Science Letters. 1979;17: ROUT, Gyana Ranjan. Effect of auxins on adventitious root development from single node 143

10 주수지외. 조직배양기술을이용한괄루근기원식물하늘타리부정근배양에대한소고 cuttings of Camellia sinensis (L.) Kuntze and associated biochemical changes. Plant growth regulation, 2006;48.2: 강영민, 최지은, 이가연, 문병철, 윤아라. 한약재반하( 半夏 ) 의기내대량번식법에관한소고( 小考 ). 한약정보연구회지. 2016;4(2): c The Author(s) 2018, khmi.or.kr 144

Lumbar spine

Lumbar spine CT 32 111 DOI : 10.3831/KPI.2010.13.2.111 Lumbar Spine CT 32 Received : 10. 05. 23 Revised : 10. 06. 04 Accepted : 10. 06. 11 Key Words: Disc herniation, CT scan, Clinical analysis The Clinical