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재룡 연
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1 J Korean Soc Food Sci Nutr 한국식품영양과학회지 46(4), 435~441(2017) 갈색거저리유충단백가수분해물의제조및항산화활성 유미희 * 이효선 * 조혜린 이승욱 계명대학교식품가공학과 Enzymatic Preparation and Antioxidant Activities of Protein Hydrolysates from Tenebrio molitor Larvae (Mealworm) Mi-Hee Yu *, Hyo-Seon Lee *, Hye-Rin Cho, and Syng-Ook Lee Department of Food Science and Technology, Keimyung University ABSTRACT The present study was carried out to evaluate the applicability of Tenebrio molitor larvae (mealworm) as a health functional food material in order to contribute to the development of the domestic insect industry and health functional food industry. Protein hydrolysates were prepared from mealworm powder by enzymatic hydrolysis using five different proteases (alcalase, bromelain, flavourzyme, neutrase, and papain), and the hydrolysates were then tested for their antioxidant activities. Based on available amino group contents and sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis analyses, mealworms treated with alcalase (4, μg/ml), flavourzyme (5, μg/ml), or neutrase (3, μg/ml) for 24 h showed high degree of hydrolysis (HD) value, whereas HD values of bromelain (1,800 μg/ml) and papain-treated (1, μg/ml) mealworms were much lower. Protein hydrolysates showing high HD values were further separated into > 3 kda and 3 kda fractions by a centrifugal filter system and then lyophilized, and the production yields of the low molecular weight protein hydrolysates ( 3 kda) by alcalase, flavourzyme, and neutrase were 42.05%, 26.27%, and 30.01%, respectively. According to the RC 50 values of the protein hydrolysates ( 3 kda) obtained from three different antioxidant analyses, all three hydrolysates showed similar antioxidant activities. Thus, alcalase hydrolysates showing the highest production yield of low molecular weight protein hydrolysates were further tested for their inhibitory effects on peroxidation of linoleic acid by measuring thiobarbituric acid values, and the results show that peroxidation of untreated linoleic acid increased dramatically during 6 days of incubation. However, pretreatment with the hydrolysates ( μg/ml) significantly inhibited linoleic acid peroxidation in a dose-dependent manner over 6 days. Key words: mealworm, protein hydrolysates, enzymatic hydrolysates, antioxidant activities 서 최근식량부족문제를해결하기위한정책으로국제식량농업기구 (FAO) 에서는미래식량자원으로식용곤충의활성화방안을발표하여전세계적으로이에대한관심이증대되고있으며 (1), 이와발맞추어국내에서는농림수산식품부가 곤충산업육성 5개년종합계획 을발표하여곤충산업에대한지원이이루어지고있다. 곤충은약 100만종이상보고되어있고 100만종이상이아직보고되지않은상태로남아있다고예측될정도로지구상에서가장크고다양성이풍부한종으로알려져있다 (2). 갈색거저리 (Tenebrio molitor, mealworm) 는딱정벌레 Received 14 November 2016; Accepted 7 March 2017 Corresponding author: Syng-Ook Lee, Department of Food Science and Technology, Keimyung University, Daegu 42601, Korea synglee@kmu.ac.kr, Phone: * These authors contributed equally to this work. 론 목거저리과의곤충으로 갈색쌀거저리 라고도불리며현재한국을비롯한전세계에분포되어있으며, 강한적응력과변태기간이짧고쉬운사육기술로연중사육이가능하여산업화에용이하다 (3). 갈색거저리의영양성분은수분이 2 ~4%, 조단백질이 50~53%, 조지방 27~34%, 조회분 3~ 5%, 조섬유 4~5% 이며, 단백질함량이매우높은고단백질소재로 2016년식용곤충원료로식품공전에등록됨으로써이의활용에대한관심이높아지고있다 (4). 갈색거저리유충의경우대두보다필수아미노산을많이함유하고있고, 육류보다불포화지방산함량이높으며, 비타민 A와철, 식이섬유등이비교적풍부한편으로영양적인장점이많다 (1, 5). 또한, 가축사육과는달리곤충사육에필요한땅을개선할필요가없고, 적은사료만으로도간편하게많은양의곤충을사육하여보급할수있으므로경제적부담이적은장점이있다. 예로부터곤충은약용으로사용해왔으며, 그중누에, 메뚜기, 굼벵이, 지네등은당뇨 (6-8), 염증성질환 (9), 간질환

2 436 유미희 이효선 조혜린 이승욱 (10) 및동맥경화 (11) 등의만성질환치료에효과적이라는연구결과가보고되고있다. 한편국내에서이루어진갈색거저리에관한연구로는갈색거저리유충추출물의간암세포에대한세포독성효능 (12), 한국산갈색거저리로부터분리된항진균단백질의항균효과 (13) 등갈색거저리추출물을이용한연구들이보고되어있지만갈색거저리유충의생리활성펩타이드에대한연구는부족한실정이다. 생리활성펩타이드는일반적으로생리적활성을가지는분자량이작은펩타이드로정의되는데 (14), 보통 3~20개의아미노산으로구성되어있고아미노산의조성이나서열에따라펩타이드의활성이다양하다 (15). 또한, 크기가작아생체내로쉽게흡수될수있으며, 다양한기능적특성을갖는장점이있다 (16). 지금까지연구된생리활성펩타이드의효과로는우유단백질가수분해물의체내항산화기능향상과가공식품에서의산화반응방지 (17), 달걀흰자가수분해물의새로운항균펩타이드 (18) 등이알려져있으며, 그외에도항고혈압 (19), 항혈전 (20), 면역조절 (21) 등생리활성펩타이드의기능성연구가활발하게진행되고있어단백질이풍부한갈색거저리유충단백질의효소적가수분해를통한생리활성을갖는펩타이드의생산이주목받고있다. 따라서본연구에서는다양한효소원을이용하여갈색거저리유충으로부터생리활성펩타이드를함유하는단백가수분해물을제조하였으며, 그중가수분해도가우수한것을선택하여 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼, 2,2 -azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)(abts) 라디칼및 hydrogen peroxide(h 2O 2) 소거활성과지질과산화억제활성을측정하여분리된단백가수분해물의항산화활성을알아보고자하였다. 재료및방법실험재료본실험에서사용한주시료는 2016년 3월 18일에농업법인회사 ( 주 )MG내츄럴( 전남담양군무정면 ) 에서생산, 판매된것으로동결건조된갈색거저리유충을구입하여 -20 C 동결고에저장하여두고실험에사용하였다., flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 단백질분해효소는 Novo사제품을대종상사 (Seoul, Korea) 로부터구입하였다. 가수분해도측정을위해사용된 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid picrylsulfonic acid(tnbs) 는 G-Biosciences Co.(St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였으며, 특별한언급이없는그밖의분석용시약및유기용매는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 로부터구입하여사용하였다. 갈색거저리유충단백질가수분해물제조동결건조된갈색거저리유충분말을 10 mm sodium phosphate buffer(ph 7.0) 에용해하여 4%(w/v) 의기질용 액으로제조한후, 90 C에서 20분동안항온수조내에서자가효소를불활성화하였다. 기질대비단백질가수분해효소 (alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain, papain) 를각각 1%(w/w) 가되도록첨가하여 55 C, 100 rpm 에서 0~24시간동안가수분해하였고, 90 C에서 20분간가열하여효소를불활성화하였다. 방랭한후가수분해물을 13,000 g에서 20분동안원심분리하여상등액을얻었으며, 상등액은저분자펩타이드의분리를위해서 membrane filter(amicon Ultra-15, EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) 를이용하여 2시간동안원심분리 (5,000 g) 함으로써최종적으로분자량 3 kda 이하의단백가수분해물을얻었다. 단백가수분해물은동결건조한후 -20 C에보관하면서실험에사용하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(sds-page) 각효소별갈색거저리유충의단백질가수분해특성을확인하기위하여 SDS-PAGE를이용하여가수분해물의단백질패턴을측정하였다. SDS-PAGE는 15% gel을사용하였으며, 각가수분해물은 3,000 g, 4 C, 10분원심분리후얻은상등액 20 μl를 gel에 loading 하여 80 V에서약 2시간전기영동한다음, coomassie brilliant blue를사용하여염색하고 10% acetic acid가함유된 30% 메탄올을이용하여탈색시켰다. 단백질패턴의분석은 Gel Logic 2200 PRO Imaging System(Carestream Health Inc., Rochester, NY, USA) 을이용하여 polyacrylamide gel을스캐닝한후이미지로영상화시켰다. 이때 molecular weight marker는 Bio-Rad Laboratories(Carlsbad, CA, USA) 의제품을이용하였다. 단백질의가수분해도측정 TNBS 방법 (G-Biosciences Co.) 을이용하여효소제처리시간에따른갈색거저리유충단백가수분해물의가수분해도를측정하였다 (22). 10 mm sodium bicarbonate(ph 8.5) 990 μl와 1% TNBS 10 μl를혼합 (v/v) 하여 0.01% TNBS를제조하고, TNBS 50 μl와시간별로취한반응혼합액 100 μl를섞어 37 C에서 2시간반응시킨후반응을정지시키기위해 10% SDS와 1 N hydrogen chloride(1 N HCl) 를첨가시켰다. 그후 microplate spectrophotometer(bio Tek Instruments Inc., Winooski, VT, USA) 를이용하여 335 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거활성측정 DPPH free 라디칼소거활성은 Ham 등 (23) 의방법에따라 DPPH에대한환원력을측정한것으로 99% 메탄올을이용하여시료를 0, 100, 250, 500, 1,000 μg/ml로희석하고희석된시료를 96 well plate에 160 μl씩분주하였다. 다음메탄올에녹인 0.2 mm DPPH 용액 40 μl를시료가

갈색거저리유충단백가수분해물의제조및항산화활성 437 분주된 well에분주하여실온에 30분간방치한후 microplate spectrophotometer를이용하여 517 nm에서흡광도로측정하였다. 각각의효소별갈색거저리유충단백가수분해물의흡광도를 1/2로환원시키는데필요한시료의농도인 RC 50 값으로나타내었다. 이때활성비교를위한양성대조군으로 Trolox를사용하였다.

3 갈색거저리유충단백가수분해물의제조및항산화활성 437 분주된 well에분주하여실온에 30분간방치한후 microplate spectrophotometer를이용하여 517 nm에서흡광도로측정하였다. 각각의효소별갈색거저리유충단백가수분해물의흡광도를 1/2로환원시키는데필요한시료의농도인 RC 50 값으로나타내었다. 이때활성비교를위한양성대조군으로 Trolox를사용하였다. ABTS 라디칼소거활성측정 ABTS 라디칼소거활성실험은 Re 등 (24) 의방법을변형하여측정하였다. 최종농도가 7 mm인 ABTS와 2.45 mm potassium persulfate를각각혼합한후실온인암소에서 24시간동안방치하여라디칼을형성시킨다음, ABTS 용액의농도는사용하기직전에 734 nm에서흡광도값이 0.70± 0.02가되도록 phosphate buffered saline(pbs, ph 7.4) 으로희석하였다. 희석된 ABTS 용액 180 μl에시료 20 μl를가하여 1분동안 30 C에방치한후 734 nm에서흡광도를측정하였다. 각각의효소별갈색거저리유충단백가수분해물의흡광도를 1/2로환원시키는데필요한시료의농도인 RC 50 값으로나타내었다. 이때활성비교를위한양성대조군으로 Trolox를사용하였다. Hydrogen peroxide 소거활성측정 Hydrogen peroxide 소거활성측정은 Müller(25) 의방법에따라증류수에농도별로희석한시료 20 μl, PBS 100 μl, 1 mm H 2O 2 20 μl를 96-well plate에가한후 37 C incubator에서 5분간반응시켰다. 이후 1.25 mm ABTS 30 μl와 1 U/mL peroxidase 30 μl를가하고 37 C에서 10분간반응시킨후 microplate spectrophotometer를이용하여 405 nm에서흡광도를측정하였다. 이때활성비교를위한양성대조군으로 Trolox를사용하였다. (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을사용되었다. 또한, 그룹간의유의성차이검증에는일원배치분산분석 (one-way ANOVA) 을사용하였으며, Duncan s multiple range test 방법을통한사후검증을시행하였다. 유의확률 (P-value) 이 0.05 미만인경우통계적으로유의한것으로판단하였다. 결과및고찰효소별갈색거저리유충의단백질가수분해물제조특성, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소별로갈색거저리유충단백가수분해물을제조하여그특성을조사하였다. 24시간반응시킨각효소별갈색거저리유충단백가수분해물의특성을확인하고자 SDS-PAGE를실시하여 alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain 및 papain 효소에대한단백가수분해물의 SDS-PAGE 패턴을 Fig. 1에나타내었다. 효소별단백가수분해물을비효소군과비교한결과, 비효소군보다 alcalase 단백가수분해물이 10 kda 이하로모두분해되어 10 kda 이상의단백질은거의나타나지않았으며, 저분자펩타이드가많고가수분해도가우수함을확인하였다. 와 flavourzyme 단백가수분해물은 alcalase 단백가수분해물보다 10 kda 이상의큰분자량의단백가수분해물이다수관찰되었다. 반면, bromelain, papain 단백가수분해물에서는 10~25 kda 사이의단백질띠가선명하여이분자량크기의펩타이드를많이함유한것을확인하였다. TNBS assay를이용해각단백가수분해물의가수분해도를그지표로사용되는 available amino group의농도로측정하였다. 단백질이가수분해되면가수분해도에비례하여 available amino group이증가하므로이는펩타이드의함량을나타내는지표가될수있다. 각효소를이용하여 Linoleic acid에대한산화방지효과 Linoleic acid에대한산화억제효과를확인하기위해 50 mm sodium phosphate buffer(ph 7.0) 2 ml와 2.52% linoleic acid 1 ml, absolute alcohol 1 ml, 시료 1 ml를혼합한후 40 C에서 100 rpm으로진탕하며하루간격으로각시료의 linoleic acid에대한산화억제효과를측정하였다. 20% trichloroacetic acid(tca, w/v) 100 μl, 0.8% thiobarbituric acid(tba, w/v) 100 μl와 linoleic acid 반응기질용액 50 μl를잘혼합하여 95 C 이상에서 20분반응시킨후, 실온에서 10분간냉각시키고 3,000 rpm에서 15분간원심분리하여 180 μl의상등액을흡광도 532 nm에서측정하였다. 이때활성비교를위한양성대조군으로 Trolox 를사용하였다. 통계분석모든데이터는최소 3번반복하여평균과표준오차 (mean ±SE) 로나타내었으며, 통계분석에는 SPSS Statistics 23 Fig. 1. Effect of five different proteases on SDS-PAGE profile of Tenebrio molitor larvae protein hydrolysates. SDS-PAGE patterns on 15% gel of Tenebrio molitor larvae hydrolysate. Lane [1], alcalase; Lane [2], bromelain; Lane [3], flavourzyme; Lane [4], neutrase; Lane [5], papain; Lane [6], no enzyme.

4 438 유미희 이효선 조혜린 이승욱 Table 1. Yields of protein hydrolysates ( 3 kda) prepared from vacuum dried Tenebrio molitor larvae using different proteases Enzymes Yields 1) of protein hydrolysates (%) 42.05±2.66 a2) 26.27±3.10 b 30.01±4.32 b 1) Yields (%)=[total solid content of protein hydrolysate-total solid content of blank (without substrate)]/total substrate content ) Each value is mean±se (n 3) and different superscripts (a,b) 분해물이 alcalase 가수분해물보다저분자펩타이드생산효율이상대적으로떨어지는것을알수있다. Fig. 2. Degree of hydrolysis of Tenebrio molitor larvae by five different proteases at 55 C. Each value is mean±se (n 3). 시간에따른단백가수분해도를알아보기위해효소별단백가수분해물의펩타이드함량을 0, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24시간별로측정하였다 (Fig. 2). 효소별단백가수분해물을이용하여시간에따른분해능을 tyrosine의함량으로환산한결과, 24시간반응후 available amino group 농도는 alcalase, flavourzyme, neutrase가각각 4, μg/ml, 5, μg/ml, 3, μg/ml로측정되었다., flavourzyme, neutrase 단백가수분해물의경우가수분해시간이경과함에따라 available amino group 농도가 0~6 시간동안급격히증가하며 6시간이후부터는그증가폭이현저히감소하였다. 하지만 bromelain, papain 단백가수분해물은 SDS-PAGE 결과와유사하게 24시간처리에도불구하고유의한 available amino group 함량의증가를보이지않았다. 이를종합해볼때 alcalase, flavourzyme 및 neutrase에대한갈색거저리유충의단백질가수분해는 6~8시간이경과하면서가수분해가충분히이루어지며, 펩타이드 chain의 N-terminal을분해하는 exo-peptidase인 flavourzyme을처리했을때가장많은 available amino group 이생성되는것을확인할수있었다. 단백질가수분해물의경우저분자량펩타이드가쉽게체내로흡수되고체내이용률도높다는보고 (22) 에따라가수분해가활발히일어났던 alcalase, flavourzyme, neutrase 가수분해물을분자량 3 kda 이하로한외여과한후동결건조하여실험에이용하였다. 각단백가수분해물의저분자펩타이드생산효율을비교하기위해전체기질의고형분함량에대하여 3 kda 이하로분리한후의펩타이드의무게를측정하였으며그수율을비교하였다 (Table 1). 를첨가한단백가수분해물의수율이 42.05% 로가장높았으며, neutrase 30.01%, flavourzyme 26.27% 순으로나타났다. 이상의결과는 alcalase를처리한단백가수분해물이 3 kda 이하의저분자펩타이드를가장많이함유하고있다는것을의미하며, neutrase와 flavourzyme을처리한가수 갈색거저리유충단백가수분해물의활성산소종소거활성 DPPH 라디칼은항산화물질이수소원자나전자를공여할수있는능력을평가할때사용되는물질로서수소혹은전자를받음으로써안정한형태의화합물로전환되어라디칼특유의보라색이옅은노란색으로변한다 (23). 이를이용하여각효소별단백가수분해물의 DPPH 라디칼에대한소거능을측정해 Table 2에나타내었다. DPPH 라디칼소거활성에대한갈색거저리유충단백가수분해물의영향을 50% 라디칼저해율을나타내는 RC 50 값으로나타낸결과 alcalase 단백가수분해물의 RC 50 값은 μg/ml, flavourzyme μg/ml, neutrase μg/ml로나타나 alcalase 단백가수분해물의 DPPH 라디칼소거활성이가장높았다 (Table 2). ABTS 라디칼소거활성법은표준물질인 Trolox의값과비교하여나타낼수있으며, in vivo에서의항산화능측정뿐만아니라 in vitro에서도항산화능을측정하기위한방법으로널리이용되고있다 (24). ABTS와 potassium persulfate를암소에방치하면생성되는 ABTS 라디칼은시료속항산화물질로인해라디칼이소거되면짙은청록색의 ABTS 라디칼이탈색되는데이를흡광도로측정하는방법이다. ABTS 라디칼소거활성에대한갈색거저리유충단백가수분해물의영향을 RC 50 값으로나타내었다 (Table 3). Table 2. DPPH free radical scavenging activities of the hydrolysates from Tenebrio molitor larvae with different proteases Enzymes RC 50 (μg/ml) 1) TEAC (mg TE/g) 2) ±11.27 b3) ±12.88 a ±6.88 a 7.81±0.09 a 6.94±0.20 b 6.58±0.06 b Trolox 2.65±0.34-1) Concentration required for 50% reduction of DPPH at 30 min after starting the reaction. 2) Trolox equivalent antioxidant capacity. 3) Each value is mean±se (n 3) and different superscripts (a,b)

5 갈색거저리유충단백가수분해물의제조및항산화활성 439 Table 3. ABTS + free radical scavenging activities of the hydrolysates from Tenebrio molitor larvae with different proteases Enzymes RC 50 (μg/ml) 1) TEAC (mg TE/g) 2) 36.90±0.83 b3) 56.03±0.78 a 29.84±0.33 c ±1.21 b 85.28±0.98 a ±2.34 c Trolox 5.03±0.06-1) Concentration required for 50% reduction of ABTS + at 3 min after starting the reaction. 2) Trolox equivalent antioxidant capacity. 3) Each value is mean±se (n 3) and different superscripts (a-c) 처리를통해얻은단백가수분해물의 RC 50 값은 μg/ml였고, alcalase, flavourzyme 단백가수분해물의 ABTS 라디칼에대한 RC 50 값은각각 μg/ml, μg/ml로나타나 neutrase 단백가수분해물의 ABTS 라디칼소거활성이가장높음을확인할수있었다. 산소의환원대사물질인 hydrogen peroxide는다양한외부요소나정상세포의 mitochondria와 peroxisome에서형성되는데 DNA 및단백질손상을유발하거나불포화지방산과같은생체막의구성성분을공격하여과산화지질을생성함으로써생체기능의저하나노화및성인병을유발하는것으로알려져있다 (26,27). 본연구에서는 peroxidase의기질인 ABTS를이용하여갈색거저리유충단백가수분해물의 H 2O 2 소거활성을측정하였다. 갈색거저리유충단백가수분해물의 H 2O 2 소거활성을 RC 50 값으로나타낸결과를 Table 4에나타내었다. 효소별갈색거저리유충단백가수분해물에따른 H 2O 2 소거능을측정한결과, alcalase 단백가수분해물의 RC 50 값은 μg/ml였으며, flavourzyme μg/ml 및 neutrase μg/ml로나타났다. 이상의결과에서 alcalase 가수분해물은 DPPH 라디칼소거능에서 RC 50 값이 μg/ml로가장효과가좋았으며 (P< 0.05), neutrase 가수분해물은 ABTS 라디칼저해활성에서 RC 50 값이 μg/ml로가장효과가좋았다 (P<0.05). 이는효소별갈색거저리유충단백가수분해물의 DPPH 라디칼소거능과 ABTS 라디칼저해활성은저분자펩타이드 Table 4. Hydrogen peroxide radical scavenging activities of the hydrolysates from Tenebrio molitor larvae with different proteases Enzymes RC 50 (μg/ml) 1) TEAC (mg TE/g) 2) 65.97±1.51 b3) ±3.30 a 70.38±1.74 b 78.43±1.90 c 46.87±1.62 a 68.26±1.08 b Trolox 17.32±0.07-1) Concentration required for 50% reduction of ABTS + at 5 min after starting the reaction. 2) Trolox equivalent antioxidant capacity. 3) Each value is mean±se (n 3) and different superscripts (a-c) 의농도와상관관계가없다는것을의미하며, Yu 등 (28) 의보고처럼단백질의가수분해펩타이드의항산화활성은항산화활성측정법에따라차이가있고, 가수분해효소의기질특이성에따라생성되는아미노산배열및아미노산조성의영향을받는것으로판단된다. Kim 등 (29) 의보고에따르면굴가수분해물의 1~3 kda 의분획물이 DPPH 라디칼소거능에서 IC 50 값이 6.4 mg/ ml, ABTS 라디칼저해활성에서 IC 50 값이 4.2 mg/ml로나타나, 이와비교할때갈색거저리유충단백가수분해물이우수한것을알수있다. Yoon 등 (30) 의연구에따르면청동풍뎅이유충의에탄올추출물의 RC 50 값이 μg/ml로나타나갈색거저리유충단백가수분해물의 DPPH 라디칼소거활성이상대적으로우수한것을알수있었다. Yu 등 (28) 이누에번데기에 neutrase, alcalase, trypsin 및 pepsin을처리하여제조한단백가수분해물의 DPPH 라디칼소거활성을확인한결과, alcalase 단백가수분해물의 RC 50 값이 μg/ml였고, neutrase 단백가수분해물이 μg/ml, trypsin μg/ml, pepsin μg/ml로나타났다. 및 neutrase 처리누에번데기단백가수분해물의 DPPH 라디칼소거활성은갈색거저리유충단백가수분해물과유사한경향을보였으나, trypsin, pepsin의경우소거활성이다소낮은경향을보였다. 폴리페놀성분이함유되어있는식물성시료에서 ABTS 라디칼및 H 2O 2 소거능을측정한 Lee 등 (31) 의연구결과에따르면 80% 메탄올아보카도의과육추출물은 200 μg/ml 에서 38.4% 로나타났고, 본연구에서사용한갈색거저리유충 alcalase 단백가수분해물은 50 μg/ml에서 69.80%, flavourzyme은 49.38% 및 neutrase는 71.41% 로 ABTS 라디칼소거활성능이우수한것으로나타났다 (data not shown). Hwang과 Nhuan(32) 은아로니아추출물의 H 2O 2 소거능을 RC 50 값으로나타낸결과 μg/ml로확인되어천연물인아로니아추출물보다갈색거저리유충단백가수분해물의 H 2O 2 소거능이우수한것으로나타났다. Linoleic acid의산화억제활성지질산화초기에발생되는과산화물은 ferrous chloride 와반응하여빨간색에가까운 ferric chloride 색소를생성하게되며, 지질산화가계속진행되면 malonaldehyde와같은저분자의화합물이생성되는데이것은 TBA와결합하여빨간색의화합물을형성한다 (33). 따라서본실험에서는불포화지방산인 linoleic acid를기질로하여갈색거저리유충단백가수분해물의산화방지효과를평가하였다. 상기 3가지항산화실험과 3 kda 이하의저분자펩타이드의생산수율결과를종합해보았을때 3종의갈색거저리유충단백가수분해물중항산화활성이상대적으로높았으며, 3 kda 이하저분자펩타이드의생산이 42.05% 로가장높았던 alcalase 단백가수분해물을이용하여 100~800 μg/ ml의농도로지질과산화물의산화억제활성을시간별로

6 440 유미희 이효선 조혜린 이승욱 요 약 Fig. 3. Inhibitory effects of the alcalase hydrolysates from Tenebrio molitor larvae on linoleic acid peroxidation. Each value is mean ±SE (n 3) and different superscripts (a-c) at the same day are significantly different at P<0.05 by 측정하여 Fig. 3에표시하였다. 시간이지날수록음성대조구의지질과산화물이증가하였으며, 음성대조구의 3일째흡광도값을 100% 로봤을때 alcalase 단백가수분해물은 100, 200, 400, 800 μg/ml의농도에서농도가높아짐에따라지질과산화물이각각 27, 33, 40, 68% 로유의적으로산화가억제됨을확인하였다. Kim 등 (34) 의연구에의하면대구의고니단백질을각효소별로처리하여얻은가수분해물의 linoleic acid에대한항산화활성을살펴보면 alcalase 처리가수분해물에서지질과산화억제활성이가장높게나타났으며, 이는시판천연항산화제인 α-tocopherol보다약 5% 정도활성이높게나타난것이라보고하였다. 그러나 pronase E와 papain 처리가수분해물에서는천연항산화제보다아주낮은활성을보였으며, 이러한결과는 N말단및 C말단에위치하는아미노산의종류가달라지므로항산화활성이다르게나타나는것으로보고하였다. 이상의결과들을토대로 alcalase, flavourzyme 및 neutrase 효소를처리한갈색거저리유충단백가수분해물의항산화활성은 DPPH 라디칼소거능에서는 alcalase 단백가수분해물이가장높았으며 ABTS 라디칼소거능은 neutrase 단백가수분해물이가장높게나타나상대적으로우수한항산화활성을가지는것을알수있다. 본연구에서는저분자펩타이드생산을목적으로 3 kda 이하의저분자펩타이드의수율이 42.05% 로가장높았던 alcalase 가수분해물을이용하였으나항산화활성평가결과에따라 flavourzyme 및 neutrase 단백가수분해물도새로운기능성식품및소재개발등에활용될수있을것으로생각된다. 특히성공적인기능성소재개발을위해서는갈색거저리유충단백가수분해물로부터항산화펩타이드의구조규명과더불어구성아미노산의종류및길이와항산화활성과의상관성에대한규명이추가되어야할것이다. 갈색거저리유충분말을 4%(w/v) 의기질용액으로제조한후, 기질대비단백질가수분해효소 (alcalase, flavourzyme, neutrase, bromelain, papain) 를각 1%(w/w) 첨가하여갈색거저리유충단백가수분해물을제조하였다. 24시간반응시킨각효소별가수분해물의특성을 SDS-PAGE로확인한결과 alcalase 단백가수분해물의가수분해가우수함을확인하였으며, available amino group의농도는 flavourzyme, alcalase, neutrase 단백가수분해물각각 5, μg/ml, 4, μg/ml, 3, μg/ml의값을나타내상대적으로높은가수분해도를보였고, bromelain(1,800 μg/ml) 과 papain(1, μg/ml) 의경우상당히낮은값을보였다. 가수분해도가높게나타난 3종의단백가수분해물을한외여과막을통해분자량이 3 kda 이하로분리한후동결건조하였으며, 이동결건조물을이용하여항산화실험을수행하였다. 갈색거저리유충가수분해물의 DPPH 라디칼소거활성은 alcalase 단백가수분해물의 RC 50 값이 μg/ml로나타났고, flavourzyme 가수분해물 μg/ml, neutrase 가수분해물 μg/ml로나타났으며, ABTS 라디칼소거활성은 neutrase 단백가수분해물의 RC 50 값이 μg/ml였고, alcalase μg/ml 및 flavourzyme μg/ml 순으로나타났다. Hydrogen peroxide 소거활성은 alcalase 단백가수분해물의 RC 50 값이 μg/ml 였고, flavourzyme μg/ml 및 neutrase μg/ ml의값을보였다. 상기 3가지항산화실험에서우수한항산화활성을보이며, 저분자펩타이드생산효율이가장높았던 (42.05%) alcalase 단백가수분해물을이용해 linoleic acid에대한지질과산화억제활성을측정한결과, 6일동안 100~800 μg/ml의농도에서처리농도에의존적으로유의적인항산화능을보였다. 감사의글 본연구는농촌진흥청연구사업 ( 세부과제번호 : PJ ) 의지원에의해이루어진것임. REFERENCES 1. van Huis A, Van Itterbeeck J, Klunder H, Mertens E, Halloran A, Muir G, Vantomme P Edible insects: future prospects for food and feed security. Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, Italy. 2. Berenbaum MR, Eisner T Ecology. Bugs bugs. Science 322: Chung MY, Kwon EY, Hwang JS, Goo TW, Yun EY Pre-treatment conditions on the powder of Tenebrio molitor for using as a novel food ingredient. J Seric Entomol Sci 51: Yoo J, Hwang JS, Goo TW, Yun EY Comparative analysis of nutritional and harmful components in Korean

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Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,