PDF

Size: px

Start display at page:

Download "PDF"

천희 설
6 years ago
Views:

1 Genetic species identification with the gut contents from Maurolicus japonicus by PCR analysis 서현석, 김충곤, 김성, 강형구, 오지나, 이윤호한국해양연구원 D etermining the diets of marine vertebrates by gut content analysis is problematic. The consumed organisms become mostly unrecognizable once partly digested, while those with hard remains (e.g. skeletons) may bias the analysis. Here, we adopt a DNAbased method similar to those used for microbial diversity surv eys as a novel approach to study the diets of Maurolicus japonicus, a Sternoptichid light fish. Polymerase chain reaction (PCR) amplified a 430bp region of 28S rdna gene and the amplified DNA was sequenced. Then, species identification was performed by comparison of the sequences with those in GenB ank. M orphological ex amination of the gut contents was also carried out. In total, eight different 28S rdna sequences were obtained from two gut content specimens. O ne of them matched with the sequence of Me t rid ia pacif ica which appeared in the environmental zooplankton samples. But, it was not identified from the same gut content specimen by morphological analysis. This result suggests that not only morphological examination but also genetic identification are necessary to identify species composition of the fish gut contents. 1. 서론먹이생물에대한연구는먹이사슬내에서에너지흐름과생태계구성인자들사이의상호작용을이해하는기초가된다. 어류의경우초기생활사동안의섭식생태연구가미래성어의자원량변동을이해하는데중요한정보를제공한다 (May, 1974; Lasker, 1975). 국내에서자치어의먹이습성에대한연구가멸치, 전어등 ( 박과차, 1995; 박등, 1996) 에대해실시된바있다. 이들연구는환경에서채집된생물과위내용물의먹이생물에대한종비교를해부현미경을이용한형태분류방법으로실시하였다. 그런데, 위내용물에서발견되는먹이생물은섭이과정의물리적인손상과섭이후진행되는소화작용에의해종동정에필요한형태형질이불분명해진다. 이러한문제점을극복할수있는새로운연구방법으로최근 DNA 분석에기반한연구들이도입되었다. 본연구에서는해양생태계먹이사슬에서하위영양단계의동물플랑크톤과상위영양단계의육식성어류나두족류사이의중요한연결고리로서역할을하는앨퉁이 (Ohshimo, 1998) 의먹이생물을규명하고자그위내용물의 DNA를분석하였다. 또한, DNA분석에의한종판별과형태형질에의한종판별을비교하여 DNA 분석의장단점을제시하였다. 2. 재료및방법가. 환경생물과앨퉁이시료채집앨퉁이섭식생태를조사하기위해동물플랑크톤과앨퉁이성체시료를포항동남부해역 (35 o 46'N, 129 o 52'E) 에서연구선이어도호로 2003년 12월 2일에채집하였다. 앨퉁이의먹이생물인동물플랑크톤을표준네트 ( 망구직경 60cm, 망목 333μm ; 수직예망 ) 로채집하였으며, 앨퉁이성체시료는 IKMT(IssacsKidd midwater Trawl, 입구면적 8.67m 2, 망목 417μm ; 경사예망 ) 를이용하여채집하였다. 채집된시료는현장에서 95% 에탄올로고정하였으며 Aizawa(2002)

2 를참고하여앨퉁이종을판별하였다. Ohshimo(1998) 에의하면앨퉁이위속의먹이생물은주간에는소화되어형태를구분하기어렵지만야간에는동물플랑크톤이나자치어등의형태가비교적원형에가깝게유지된다고한다. 이러한앨퉁이위내용물의소화정도를고려하여표본을 20:00 ~ 21:00에채집하였다. 나. 환경생물동정채집된시료의일부를 Bogorov 판에올려놓고해부현미경하에서출현한동물플랑크톤을동정하였다. 가능하면종수준까지분석하였으나, 동정이어려운경우는분류가가능한상위단계까지만동정하였다. 다. 앨퉁이위내용물형태적분류앨퉁이위부분을분리한후, 해부현미경하에서위의측면을절개하였다. 절개된위를 Bogorov 판에올려놓고위속에들어있는내용물을핀셋을이용하여분리하였다. 분리된위내용물 ( 시료번호 GC01번수컷, 시료번호 GC02번수컷 ) 을해부현미경하에서동정하였으며, 종수준까지동정이어려운경우는분류가가능한상위단계까지만동정하였다. 라. 앨퉁이위내용물 (Gut Contents) 의유전적분류 MN (MachereyNagel) NucleoSpin R Tissue Kit 를이용하여앨퉁이위내용물 ( 시료번호 GC01번수컷, 시료번호 GC02번수컷 ) 의 genome DNA를추출하였다. 28rDNA gene 의약 430bp 를증폭하기위해 Primer 인 MT3(5 AAA GGA TCC GAT AGY SRA CAA GTA CCG3 (Y = C or T; R = A or G; S = C or G) 와 MT4(5`CCC AAG CTT GGT CCG TGT TTC AAG AC3`)(Williams et al, 1993) 를사용하였다. PCR 조건은다음과같가 : 1X PCR Reaction Buffer, 2.5mM dntp, Primers 0.2μM, 5 U Super T aq polymerase 로총 5 0 μl반응액을만들고 TaKaRa PCR Thermal Cycler TP600를이용하여 94 에서 5분간반응시킨후, 94 에서 1분, 45 에서 1분, 72 에서 2분씩 32회반복반응시키고 72 에서 7분간더반응시켰다. PCR 산물은 PCR Purification kit(dynebioinc) 를이용하여정제하고, 정제된 PCR 산물을 TOPO TA Cloning R Kits로 pcr R ⅡTOPO R vetor 에클론닝하였다. PCR 산물이포함된플라즈미드가들어있는박테리아콜로니를배양하고, DNAspin TM Plasmid DN A kit 를이용하여 plasmid 를추출하였다. 시퀀싱반응은 Applied Biosystems 사의 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kits 을이용하여실시하였고, ABI PRISM 3730XL Analyzer 로 28SrDNA 유전자의염기서열을결정하였다. 결정된 Gut Contents Partial 28S rdna 유전자의염기서열을대표적인몇개의 group 으로나누고, NCBI(http;// nlm.nih.gov / BLA ST /) 에서 GenBank 의 blast search 를통해동일성 (identity) 을기준으로종을판별하였다. 3. 결과및고찰가. 대한해협주변의환경생물분석환경에서채집되동물플랑크톤은 Table 1과같이형태적분류에의해모두 47개소분류군으로동정되었다. 이들중요각류 (copepoda) 가차지하는종또는소분류군의수가가장많았으며, 대부분이난류성외양종이었다. 요각류외에는개형류 (Ostracoda), 모악류 (Chaetognatha), 미충류 (Appendiculata), 연체동물 (Mollusca) 유생등이발견되었다. 그런데, NCBI의 GenBank 데이터베이스에 28SrDNA 유전자에의해분류된동물플랑크톤이많지않았다 (Table 1, 세번

3 째칸 ). 이러한데이터베이스의부족으로인하여 DNA분석방법으로먹이생물의종을분류하는데는현재로서한계가있다. 앞으로환경생물의유전자데이터베이스가확충되면위내용물에대한 DNA분석결과로보다많은종의분류가가능할것이다. 나. 앨퉁이 GC01, GC02 위내용물 (Gut Contents) 분석위내용물을형태형질에근거하여분석한결과 (Table 1), 종까지분류가가능한경우는거의없었다. 소형요각류 ( 예, Oncaea속, Corycaeus 속 ) 와개형류 (Euconchoecia sp.) 에속하는동물플랑크톤은비교적형태가온전하여속수준까지분류가가능하였고, 모악류는몸체의일부형질로써속까지분류되었다 (Sagitta sp.). 대형요각류와복족류유생은온전한형체를찾을수없었기때문에대략적인분류군으로추정되었다. 환경에서채집된생물의 DNA 분석은 Metrid a pacifica, Sagetta enflata, Oikopleura sp. 를대상으로이루어졌다. M. pacif ica 의 28SrDNA 염기서열은 GenBank 에수록된염기서열과완전히일치하는것으로나타났으며, S. enflata와 O ik ople ura sp. 의경우는 98% 일치하는것으로나타나환경생물의 DNA분석이대체로제대로이루어졌음을보여주었다. 두개의위내용물시료에서 28SrDNA 염기서열을분석한결과, 모두여덟종류의서로다른염기서열을얻었다. 이중한개의염기서열은환경생물 DNA분석에서밝혀진 Met rid ia pacif ica 의염기서열과완전히일치하여, 앨퉁이가 Me t rid ia pacif ica 를먹이생물로이용하고있음을시사하였다. 그런데, 위내용물의형태형질분석은이종을판별해내지못하였다 (Table 1). 따라서, 이종은앨퉁이에의해섭식된후소화가빠르게진행될것이라예상되며, DNA분석으로비로서앨퉁이Met rid ia pacif ica 의먹이사슬관계가밝혀진것이라고볼수있다. 그외다섯종류의서로다른 28SrDNA 유전자가요각류의염기서열과유사하게나타났다 : E ucalanus bung ii 염기서열과 93% identity 를보이는 DNA와 Pse ud ocalanus m inut us 염기서열과 93%, 91%, 89%, 87% identity 를보이는 DNA. 이염기서열들이정확히어떤종에서유래된것인가는아직 28SrDNA 의데이터베이스가충분히확보되지않아판별할수없다. 앞으로보다많은환경생물의유전자가분석되어데이터베이스가확충되면 DNA분석에의한먹이사슬관계가쉽게판명될것이다. 본연구에서또다른특징은환경생물의형태적분석에서간과하였던식물플랑크톤 Thalassiosira rot ula의 28SrDNA 유전자와유사한염기서열 (identity, 95%) 과 C enchrit is m uricat us 의유전자와유사한염기서열 (identity, 92%) 이확인된것이다. 이로써앨퉁이가동물플랑크톤과함께식물플랑크톤도섭식할가능성이있음을보여준다. 한편, 형태분류에의해위내용물에들어있는것으로나타난개형류 (Euconchoecia sp.) 와모악류 (Sagitta sp.) 는 DNA 분석에서드러나지않았다. 이처럼 DNA 분석에의해위내용물의모든종이드러나지않는이유는위내용물이적어 DNA 추출이어렵다는점과사용된 28SrDNA 프라이머 MT3와 MT4가모든먹이생물에균등하게적용되지않을수있다는점에서찾을수있다. DNA 분석방법이갖는이러한한계성에도불구하고, 염기서열이얻어지기만하면형태분석으로는도저히불가능한위내용물의종수준까지의판별이가능해진다는면에서 DNA 분석방법이먹이사슬연구의새로운방법으로받아들여지고있다. 먹이사슬관계를보다명확하게규명하기위해서는형태분류와유전적분석방법이함께이용되어야할것이다. 또한, 유전적분석방법에의한먹이생물종분류의정확성을높이기위해서는각생물군에적합한유전자마커의개발과다양한해양생물에대한유전자데이터베이스가확보되어야한다.

4 Table 1. Genetic and morphological species identification with the gut contents of Maurolicus japonicus and environmental zooplankton composition in the Korea Strait 환경생물 환경생물 GenB ank GC01형태학적 GC01유전적 GC02형태학적 GC02유전적환경생물유전적분류형태학적분류 data 분류분류분류분류 Protoz oa Noct iluca scintillans + Foraminifera + + Cnidaria M edusa others + Siphonopora + Ctenopora Unidentified sp. + Ectoprocta Cyphonautes larvae + Mollusca Gastropoda larv ae Crustacea Ostracoda Conchoecia concentrica + Euconchoecia pacifica Copepoda Calanoida + ( unidentified) + ( unidentified) Acartia pacifica + Aetideopsis sp. + Calanus sinicus + Candacia bipinnata + Centropages furcatus + Clausocalanus sp. + (E ucalanus bungii) + +( 9 3 % ) Eucalanus mucronatus + Lucicutia flavicornis + Metridia pacifica ( % ) + ( % ) Paracalanus spp. + + Paraeuchaeta longicornis + Paraeuchaeta planna + Paraeuchaeta sp. + + Pleuromama robusta + Pontellina morii + Pseudocalanus minutus + + +( 9 3 %, 9 1 % ) +( 8 9 %, 8 7 % ) Rhincalanus nasutus + Scolecithrix danae + Temora discaudata + Undinula vulgaris + Cyclopoida Oithona plumifera + Poecilostomatoida Corycaeus affinis Corycaeus pacificus + ( C ory cae us sp. ) ( C ory cae us sp. ) Oncaea mediterranea Oncaea venusta + ( O ncae a sp. ) ( O ncae a sp. ) Mysidacea Unidentified sp. + Amphipoda Hyperia sp. + E uphausiacea Euphausia pacifica + Larvae + Decapoda Larvae + Luciferidae + Chaetognatha Sagitta enflata ( 9 8 % to S. enflata) Sagitta sp Annelida Polychaete larvae + Echinodermata larvae + Chordata Appendiculata Oikopleura longicornis + Oikopleura sp ( 9 8 % to O. sp) Thaliacea Unidentified sp. + 기타 (Cenchritis muricatus) + +( 9 2 % ) (T h alassiosira rotula) + +( 9 5 % ) +, present ;, absent ; ( identity)

5 4. 참고문헌 1. Aizawa, M Sternoptychidae marine hatchetfishes pp. In: Fishes of Japan with pictorial keys to species, English edition. ed, by T. Nakabo, T okai U niversity Press, T ok yo. 2. L ask er, R F ield criteria for surv iv al of anchov y larv ae: the relation between inshore chlorophyll maximum layers and successful first feeding. F ish. B ull. U.S. 73: May, R.C Larval mortality in marine fishes and the critical period concept. pp In B laxter, J, H.S. ed., The early life history of fish. SpringerVerlag, Berlin, Heidelberg, New Y ork pp. 4. Ohshimo, S Distribution and stomach content of Maurolicus mue lle ri in the Sea of Japan (East Sea). J. Korean Soc. Fish. Res. 1(1) : 168~ Williams NA, Dixon DR, Southward EC, Holland PWH(1993) Molecular evolution and diviersification of the vestimentiferan tube worms. J Mar Bio Assoc UK 73 : 박광재, 차성식, 허성회 광양만 전어 (K onosirus punct at us) 의 후기자어의 먹이 생물. 한수지, 29(4) : 박광재, 차성식 광양만 멸치 (Engraulis japonica) 의 후기자어의먹이생물. 한수지, 28(3): ]

<34385FB0ADC1A4C8C62DB5B6B5B520C0CEB1D9C7D8BFAA20B5BFB9B0C7C3B6FBC5A9C5E62E687770>

<34385FB0ADC1A4C8C62DB5B6B5B520C0CEB1D9C7D8BFAA20B5BFB9B0C7C3B6FBC5A9C5E62E687770> Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 17, No. 9 pp. 422-430, 2016 http://dx.doi.org/10.5762/kais.2016.17.9.422 ISSN 1975-4701 / eissn 2288-4688 강정훈 1*, 김웅서 2, 권오윤 1, 조규희 3 1