JNH 강명희(K16-62).fm

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1 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 401 ~ pissn / eissn Research Article 제 2 형당뇨모델 db/db 마우스에서 4 개월의자화수섭취후혈당, 항산화상태및세포 DNA 손상개선효과 이혜진 강명희 한남대학교대덕밸리캠퍼스생명나노과학대학식품영양학과 Four months of magnetized water supplementation improves glycemic control, antioxidant status, and cellualr DNA damage in db/db mice Lee, Hye-Jin Kang, Myung-Hee Department of Food & Nutrition, Daedeok Valley Campus, Hannam University, 1646 Yuseongdaero, Yuseong-ku, Daejeon 34124, Korea ABSTRACT Purpose: Water is magnetically charged upon contact with a magnet. Although magnetic water products have been promoted since the 1930's, they have not received wide acceptance since their effectiveness is still in question; however, some have reported their therapeutic effects on the body, especially the digestive, nervous, and urinary systems. Methods: In this study, the effect of magnetized water on glycemic control of 14 diabetic mice (CB57BK/KsJ-db/db) in comparison with 10 control mice (CB57BK/KsJ-db/+(db/+)) was investigated. Seven diabetic control (DMC) mice and seven diabetic mice + magnetized water (DM+MW) were kept for 16 weeks, followed by intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT). Weekly blood glucose was measured from tail veins. Blood obtained from heart puncture was used for HbA1c analysis. Results: Blood glucose level showed a significant difference starting from the 10 th week of study (496.1 ± 10.2 mg/dl in DMC vs ± 76.9 mg/dl in DM+MW). Blood glucose followed by IPGTT showed no significant difference between groups at 0, 30, 60, 90, and 120 min, although glucose level at 180 min was significantly reduced in DM+MW mice. Plasma insulin level in DM+MW groups was only 39.5% of that of DMC groups (5.97 ± 1.69 ng/ml in DMC vs ± 0.94 ng/ml in DM+MW). Levels of HbA1c were 12.4% and 9.7% in DMC and DM+MW groups, respectively. Conclusion: These results show the promising therapeutic effect of magnetized water in regulating blood glucose homeostasis; however, long-term supplementation or mechanistic study is necessary. KEY WORDS: diabetic mice, magnetized water, glycemic control, HbA1c, insulin 서 당뇨병은대표적인만성질환으로최근에많이발생하고있는추세이다. 1 대한당뇨병학회에따르면우리나라의 30 세이상당뇨병환자는현재 480만명이며, 우리나라성인의 25% 가당뇨전단계를가지고있다. 1 또한 10명중 3명은본인이환자임에도불구하고인지하지못하고있으며, 당뇨환자의 10.8% 는여전히치료를받지못하고있다. 1 당뇨병은여러가지유형이있으며이중제 2형당뇨병은생활습관으로인해발병하는것으로서구화된식습관과운동부족등이원인이될수있다. 론 당뇨병에걸리면체내산화스트레스증가로인해 reactive oxygen species 형성이증가하며이로인해세포 DNA에손상을일으켜거의모든조직에영향을주어다양한합병증을유발시킨다. 2 Streptozotocin으로유발시킨당뇨쥐의경우정상쥐에비해 DNA 손상정도가유의적으로높은것이확인되었으며, 3,4 Mozaffari 등 5 은뇨의 8-OHdG로본 DNA 손상도가정상쥐에비해제2형당뇨쥐에서유의적으로높음을보고하였다. 이처럼당뇨병은산화스트레스로인한세포손상을일으키기때문에항산화방어체계를완화시키게되면동맥경화나심혈관질환등합병증으로진전될위험을줄일수있다. 이에따라당뇨병에걸린 Received: November 17, 2016 / Revised: December 11, 2016 / Accepted: December 15, 2016 To whom correspondence should be addressed. tel: , mhkang@hnu.kr 2016 The Korean Nutrition Society This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

2 402 / 제 2 형당뇨쥐에서자화수의혈당및 DNA 손상개선효과 환자나동물모델을대상으로항산화물질들을투여하는영양중재연구가활발하게진행되고있으며항산화제투여로인해체내항산화상태가호전되는효과가있음이보고되고있다. 6-8 Shirpoor 등 6 은 streptozotocin 유발당뇨쥐에게비타민 E를보충시켰을때보충시키지않은당뇨군 (DMC) 에비해항산화효소인 SOD와 catalase농도가유의적으로증가함을보고하였으며, Mitri 등 7 은당뇨환자에게비타민 D를보충하였을때 disposition index로본췌장 β세포의기능이향상됨을보고하였다. 제 2형당뇨환자에게아연을보충시켰을때, placebo군에비해당뇨환자의혈장 TBARS 농도가유의적으로감소하여산화스트레스가개선되었음도보고되었다. 8 당뇨를예방하거나치료하기위해항산화비타민혹은무기질뿐만아니라천연식품에서생리활성물질을추출하거나천연가공식품등을투여하는연구도활발하게이루어지고있다 Lee 등 9 은 β-glucan 함량이높은유색보리와귀리를이용하여당뇨환자용즉석죽을제조하여 streptozotocin 유발당뇨쥐에게섭취시킨결과대조군에비해인슐린분비기능이향상되었음을보고하였고, 생약재와와송추출물의복합조성물을 streptozotocin 유발당뇨쥐에게보충시킨결과혈당저하및지질개선효과가관찰되었다. 10 제 1형당뇨모델쥐와제 2형당뇨모델쥐에게녹차추출물을보충시킨결과, 당뇨의형태에상관없이혈당증가억제효과가나타났다. 11 또한녹차추출물의섭취가제2형당뇨또는대사증후군에있어산화스트레스감소뿐만아니라인슐린민감성도개선시키는효과를보였다. 12 이밖에도수많은영양중재연구들이당뇨환자나당뇨쥐를대상으로수행되고있으나당뇨환자나당뇨쥐를대상으로음용수또는음료를이용한영양중재연구는매우제한되어있다. 자화수는물을특수제작된영구자석에통과시킨것으로, 자석을통과하는동안물의흐름이자장선 (magnetic field lines) 과수직이되어물분자구조가우리몸의생체수와같은육각형구조로새로이변화된것을말한다. 13 이렇게되면무기질이온이활성화되고생체내흡수가향상되며조직세포의생체활성이촉진되어각종만성질환에치료효과가있는것으로알려져있다. 13 특히, 자화수섭취가당뇨병에효과가있음이음용경험및사례보고로알려져있으나과학적인실험결과는매우제한되어있다. 3 현재알려진자화수의효능에대한연구로는자화수의섭취가치석을감소시키며, 14 glutamate decarboxylase 활성을증가시킨다는연구 15 가있으며, 그외중국에서보고된자화수의요석증치료효과 16 및결석용해효과 17 등이있다. 최근 Hafizi 등 18 은마우스에 2주일동안자화수를먹였을 때나팔관상피세포의길이가증가하는것으로보아동물의생식능력과관련된지표들을개선시키는효과가있음을보고하였다. 또동물실험에서전자기장 (electromagnetic fields) 은생식기관에서의세포발달및성장에잠재적인효과가있는것도관찰되었다. 19 저자들의선행연구로실험동물의발암물질로자주사용되고있는 diethyl nitrosamine (DEN) 을사용하여 ICR mouse에게암을유발시킨후 6주이상자화수를투여한결과동물의임파구 DNA 손상이유의적으로감소한것을관찰하였다. 20 또 streptozotocin 으로유발한제1형당뇨쥐모델에자화수를 8주동안투여한결과, 혈당강하효과및세포 DNA 손상감소효과가나타나는것을관찰하였다. 3 그러나아직까지제2형당뇨모델에서자화수의혈당강하효과를본연구는보고된바없다. 따라서본연구는제1형당뇨쥐에서자화수의혈당강하효과를본전보 3 에이어제2형당뇨쥐에서도자화수가혈당강하효과및 DNA 손상감소효과를보이는지확인해보기위해제2형당뇨발현마우스 (CB57BL/KsJ-db/db) 에게자화수를 4달동안섭취시킨후, 혈당, DNA 손상및항산화영양상태가어떻게달라지는지관찰하고자수행되었다. 연구방법 실험동물의사육및실험설계자화수의혈당강하및 DNA 손상감소효과를보기위한실험동물로는유전적소인에의해제2형당뇨병이발현되는모델인 db/db 마우스 (CB57BL/KsJ-db/db) 6주령 14마리를당뇨군과자화수군으로각 7마리씩나누었고, 대조군으로이형접합체 (heterozygote) 마우스 (CB57BL/KsJdb/+(db/+)) 10마리를사용하여 3군으로나누어 16주동안사육하였다. 실험동물은중앙실험동물 (Central Lab. Animal Inc. Korea) 에서구입하여온도와습도가자동조절되는동물실험실에서사육하였다. 실험동물은한마리씩케이지에넣어사육하였으며물과사료를마음껏먹게하여 1주일간적응시킨후실험에사용하였다. 실험에사용한자화수는 9,000~13,000 가우스의자장을통과한물로서 ( 주 ) 코리아크린시스템으로부터공급받아물대신에투여하였다. 실험동물의기본실험식이는 AIN-93 식이를제조하여사용하였으며 AIN-93 실험식이의내용은 Table 1과같다. 세군모두동일한사료를주되, 대조군과당뇨군은일반식수를먹게하고자화수투여군은일반식수대신에자화수를먹게하였다. 본동물실험은한남대동물실험윤리위원회의심의를통과하였다 ( 승인

3 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 401 ~ 410 / 403 Table 1. Composition of experimental diet 1) Ingredients Grams/kilogram diet Casein Cornstarch Dextrose Sucrose Cellulose Soybean oil t-butylhydroquinone Salt mix 2) Vitamin mix 2) L-cystine Choline bitartrate ) Reeves PG, Nielsen FH, Fahey GC Jr. AIN-93 purified diets for laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc writing committee on the reformulation of the AIN- 76A rodent diet. J Nutr. 123(11): ) AIN-93 diet, Dyets Inc., USA 번호 : HNU ). 채혈및간조직채취대조군, 당뇨군및자화수투여군으로나누어실험식이를급여한 16주째에 12시간절식시킨후세군의동물을모두희생시켜심장으로부터혈액을채취하였다. 전혈은 Comet 분석을위해 70 μl, 당화혈색소분석을위해 50 μl 를각각분주하고나머지혈액은 lithium-heparin 처리한 polystyrene tube에담아 3,000 rpm에서 15분간원심분리하여혈장인슐린및혈장 TRAP 분석을위해혈장을분리하였다. 적혈구는 iso-osmotic phosphate buffered saline (ph 7.4) 을첨가하여 3,000 rpm에서 10분간원심분리를세반복한뒤 buffer와 1:1로희석하여 erythrocyte suspension으로만들었으며혈장과적혈구는분석전까지 -70 o C 냉동고에보관하였다. 간조직은희생시킨후간을절제하여차가운식염수로세척한다음여과지로물기를제거하고액체질소로급속냉동시켜분석할때까지 -70 o C 에보관하였다. 혈당측정및복강내당부하검사 (intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT) 혈당은실험식이급여 16주째동물을 12시간절식시킨후꼬리정맥에서혈액을채혈하여혈당계 (Accutrend GC, Roche, Germany) 를이용하여측정하였다. 복강내당부하검사를위해공복혈당수준을 initial data로한후 incubation tube를사용하여 50% glucose 용액 (2 g glucose/1 kg bw) 을복강투여하고 30분, 60분, 90분, 120분및 180분에꼬리정맥으로부터채혈하여정맥혈의혈당농도변화를혈당 계 (Accutrend GC, Roche, Germany) 로측정하였다. 당화혈색소 (glycated hemoglobin) 측정당화혈색소는 Hemoglobin A1c kit (BioSystem. Ltd) 를이용하여측정하였다. 전혈 50 μl을 potassium phtalate 용액 200 μl와섞어상온에 15분동안반응시켰다. Column 을통해 hemolysate를 phosphate buffer로내려준후 UV/ VIS spectrophotometer로 415 nm의파장에서 absorbance 를측정하였다. 혈장인슐린측정실험동물의혈장인슐린수준은전보 3 에서와같이 enzymelinked immunosorbent assay에따라 insulin ELISA kit (Linco. Ltd) 를사용하여측정하였다. 96 plate well에 10 μl assay buffer, 10 μl matrix solution, 혈장 10 μl을순서대로넣어준 80 μl detection antibody와혼합하여 2시간동안상온에서 shaking하였다. Wash buffer로 3번씻어준후 100 μl enzyme solution을넣고다시상온에서 30분간 shaking 한후 wash buffer로씻어주었다. 여기에 100 μl substrate solution을넣은후 15분간 shaking 하여 590 nm의파장에서 ELISA reader (SUNRISE) 를이용하여 absorbance를측정하였다. 혈장 TRAP 수준분석혈장중 TRAP 수준은 ABTS (2,2'-azinobis 3-ethylbenzothiazo-line 6-sulfonate), (150 µm) 와 metmyoglobin (2.5 µm) 을 H 2 O 2 (75 µm) 로활성화시킴으로써생성된 ferryl myoglobin radical species와의상호작용에의해형성된 ABTS radical cation의 absorbance를측정하는데기초를두고있으며그 absorbance의억제정도는 sample (0.84% plasma) 에들어있는 antioxidant capacity에비례하게된다. Sample을 6분동안 30 o C에서배양한후 UV/VIS spectrophotometer로 740 nm의파장에서 absorbance를측정하였다. 혈장의 TRAP 수준은 trolox의 calibration curve 를이용하여계산하였으며 TEAC (trolox equivalent antioxidant capacity, mm) 로표현하였다. 적혈구항산화효소활성측정적혈구 SOD (superoxide dismutase) 활성도를측정하기위해적혈구현탁액을증류수로용혈시킨후 ethanol과 chloroform을가하고이를 3,000U/min에서 2분간원심분리하였다. 그상층액을여러농도로나누어 37 o C에서 10분간배양후 20 μl의 pyrogallol (1.2.3-Trihydroxybenzol) 를첨가하여그농도를 UV/VIS spectrophotometer 로 320

4 404 / 제 2 형당뇨쥐에서자화수의혈당및 DNA 손상개선효과 nm 에서 180 초간측정하였다. 적혈구내 SOD 의활성은 pyrogallol의자동산화를 50% 억제하는항산화능으로정의하였다. Glutathione peroxidase (GSH-Px) 측정을위해용혈시킨적혈구에 glutathione, glutathione reductase, NADPH 를첨가한후 37 o C에서 10분간배양한후에 T-butylhydroperoxide를넣어반응시켰으며이때감소된 NADPH의농도를 UV/VIS spectrophotometer로 340nm에서 90초동안측정함으로써 GSH-Px의항산화정도를측정하였다. Comet assay에의한임파구 DNA 손상측정임파구 DNA 손상측정을위한 Comet assay는선행연구 3 에서와같이 Singh의방법 21 을수정보완하여실시하였다. 신선한전혈 70 μl을채취하여 low melting agarose gel (LMA) 과 normal melting agarose (NMA) 를이용하여슬라이드를만들었다. Gel이굳으면 LMA 용액 75 μl로한겹더덮은후 cell lysis를위해미리준비해둔차가운 alkali lysis buffer (2.5 M NaCl, 100 mm Na 2 EDTA, 10 mm Tris) 에슬라이드를담가저온, 암실에서 1시간동안침지시키어 DNA의이중나선구조를풀어주었다. Lysis 가끝난슬라이드를전기영동 tank에배열하고 4 o C의차가운전기영동 buffer (300 mm NaOH, 10 mm Na 2 EDTA, ph > 13) 를채워 unwinding 시킨후 25 V/300 ± 3 ma의전압을걸어 20분간전기영동을실시하였다. 전기영동이끝난후 Tris 완충용액 (ph 7.4) 으로충분히세척하고건조시킨후 ethidium bromide로핵을염색하여형광현미경 (Leica, Germany) 상에서관찰하고 CCD 카메라 (Nikon, Japan) 를통해보내진각각의세포핵 image는 comet image analyzing system (Kinetic Imaging, UK) 이설치된컴퓨터상에서분석하였다. 임파구의 DNA 손상및자화수섭취에의한손상억제정도는핵으로부터이동한 DNA 파편의거리인 tail length (TL), % DNA in tail (% DNA), 그리고 TL 과 % DNA 를곱해준값인 tail moment (TM) 등 3가지분석지표로살펴보았으며, 각대상자당 2개의슬라이드를만들어각각 50개씩총 100개의임파구에서 DNA 손상정도를측정하였다. Comet assay 에의한간 DNA 손상측정실험동물의간조직을일정량취하여 10 배에해당하는 HBSS buffer (1 mg/g collagenase) 를섞고 shaking incubator (120 rpm, 37 o C) 에넣어세포를분리한후 low melting agarose gel과섞어슬라이드에분산시키며이후혈액 comet 방법과동일한과정으로분석하였다. 자료의처리모든자료는 SPSS-PC+ 통계 package (version 18.0) 를사용하여처리하였다. 각항목에따라백분율과평균치 ± 표준오차 (SE) 를구하였고각군별로유의성검증을위해서일원분산분석 (ANOVA) 를실시한후사후검증방법으로는 Duncan s Multiple Range Test를통해각군간의평균차이에대한유의성을검증하였다. 모든통계적유의성은 α = 0.05 수준에서평가하였다. 결 실험동물의체중변화, 식이섭취량및수분섭취량을관찰한결과는 Table 2와같다. 대조군 (CON) 에비해당뇨군 (DMC) 과자화수투여군 (DM+MW) 의체중변화와식이섭취량에는차이가없었으나, 수분섭취의경우혈당이떨어지는시점에맞추어대조군에비해당뇨군이높았으나, 자화수투여군에서는당뇨군에비해유의적으로낮아짐을보였다. 실험이진행되는 16주동안세군의혈당변화를살펴본결과는 Fig. 1과같다. 대조군은실험기간인 16주동안혈당의변화가거의없었으며, 당뇨군의경우에는높은혈당을유지하였다. 자화수를투여하였을경우, 투여 10주부터당뇨군 (496.1 ± 10.2 mg/dl) 에비해자화수투여군 (437.9 ± 76.9 mg/dl) 의혈당이유의적으로감소하였으며, 이러한감소효과는실험이끝나는주인 16주까지지속되었으며감소효과는시간이경과할수록더크게나타났다 (Fig. 1). 자화수가당뇨쥐의내당능에미치는영향을알아보기위해포도당을동물에게복강투여한후시간별로혈액을채취하여당부하검사를수행한결과혈당곡선하면적 (area under the curve, AUC) 은 Fig. 2에나타냈다. 대조군에서포도당투여 30분후에혈당이증가하였고 60분후에는감소하기시작하여 90분, 120분, 180분에도감소한수준을유지하는패턴을보인데비해당뇨군에서는포도당투여 30분후에증가한혈당이포도당투여 180분후까지감 Table 2. Body weight gain, food intake and water intake of mice Groups 과 Initial BW (g) Final BW (g) Food intake (g/day) Water intake (ml/day) CON ± 0.24 a ± 3.20 a ± ± 0.24 a DMC ± 1.34 b ± 6.95 b ± ± c DM+MW ± 1.28 b ± 7.50 b ± ± 3.10 b Mean ± SD Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, diabetes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7) Significantly different from control group (p < 0.05) by Duncan's test.

5 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 401 ~ 410 / 405 Fig. 1. Effect of magnetized water on blood glucose in db/db mice. Mean ± SD. Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, dia betes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7). Values within a group with different alphabet are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. Fig. 3. Effect of magnetized water on plasma insulin in db/db mice. Mean ± SD. Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, diabetes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7). Bar with different letters are significantly different at p < 0.05 after Duncan s multiple range test. Fig. 2. Effect of magnetized water on area under the blood glucose curve after oral glucose tolerance test in db/db mice. Mean ± SD. Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, diabetes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7); AUC, area under the curve. Values with different alphabet are significantly different at p < 0.05 by Duncan's multiple range test. Fig. 4. Effect of magnetized water on blood HbA1c in db/db mice Mean ± SD. Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, diabetes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7). Bar with different letters are significantly different at p < 0.05 after Duncan s multiple range test. 소하지않고지속되었다. 이에비해자화수투여군은포도당투여 30분후에증가한혈당이 60분에최고를보인후, 120분부터조금씩감소하는경향을보이다가 180분후에유의적으로감소하였다. 그러나혈당곡선하면적 (area under the curve, AUC) 은당뇨군과자화수투여군에서약간의차이는보였으나유의적으로나타나지않았다. 본연구에서당뇨군과자화수투여군의혈장인슐린수준을비교해본결과는 Fig. 3과같다. 대조군 (3.94 ± 2.67 ng/ml) 에비해당뇨군 (5.97 ± 1.69 ng/ml) 의혈장인슐린수준이높은경향을보였으며, 당뇨군에비해자화수투여군 (2.36 ± 0.93 ng/ml) 에서유의적인감소하는것으로나타났다. 장기간의혈당수준을나타내는지표인혈액당화헤모글로빈함량을비교해본결과, 5.8% 를보인대조군에비 해당뇨군의경우 12.8% 로약 2.2배증가하였으나자화수투여군에서는 10.4% 로당뇨군에비해유의적으로감소하여자화수투여가당뇨군의당화헤모글로빈생성을감소시키는것을확인할수있었다 (Fig. 4). 당뇨쥐의혈액임파구 DNA 손상정도를 comet assay로본결과는 Fig. 5에제시하였다. DNA 손상의세가지지표인 DNA in tail, tail length, tail moment로보았을때대조군에비해당뇨군의 DNA 손상이유의적으로높았으며자화수투여군에서는 DNA in tail에서 46.7%, tail length 로보았을때 24.0%, 그리고 tail moment로보았을때 60.1% 가감소함을보였다. 이로써 16주간의자화수섭취시 db/db mouse에서높아진혈액임파구 DNA 손상이자화수투여로인해효과적으로낮아짐을알수있었다 (Fig. 5).

6 406 / 제 2 형당뇨쥐에서자화수의혈당및 DNA 손상개선효과 Fig. 5. Protective effect of magnetized water on blood DNA damages in db/db mice. Mean ± SD. Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, diabetes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7). Bar with different letters are significantly different at p < 0.05 after Duncan s multiple range test. 동물의간에서 DNA 손상정도를본결과도혈액 DNA 손상정도와같은경향을보였다. DNA 손상정도를 DNA in tail, tail length, tail moment의 3가지지표로보았을때, 제2형당뇨쥐인 db/db mouse에서높아진 DNA 손상정도가자화수투여로인해 48%, 26%, 61% 유의적으로감소되는것으로나타났다 (Fig. 6). 당뇨쥐에있어서자화수의항산화효과를관찰하기위해적혈구항산화효소인 GSH-Px와 SOD의활성을살펴보았다. 모든군간에적혈구내항산화효소활성도에는차이를보이지않았다 (Table 3). 또당뇨쥐혈장내총항산화능 Fig. 6. Protective effect of magnetized water on liver DNA damages in db/db mice. Mean ± SD. Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, diabetes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7). Bar with different letters are significantly different at p < 0.05 after Duncan s multiple range test. Table 3. Effect of magnetized water on plasma TRAP and erythrocyte antioxidant enzymes in db/db mice Variable TRAP (um) GSH-Px (U/gHb) SOD (U/gHb) CON 1.41 ± ± ± 425 DMC 1.24 ± ± ± 248 DM+MW 1.35 ± ± ± 398 Mean ± SD Abbreviations: CON, control (n = 10); DMC, diabetes mellitus control (n = 7); DM+MW, DM+Magnetic water (n = 7) (TRAP) 을살펴본결과, 당뇨군과자화수투여군과의유의적인차이는보이지않았다 (Table 3).

7 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 401 ~ 410 / 407 고찰 제 2형당뇨병은인슐린저항성으로인해인슐린요구량이상대적으로증가하다가결국인슐린분비기능에결함이생겨인슐린이더이상분비되지않아발병한다. 제 2형당뇨병의예방과치료에식품을사용하는연구들이많이보고되고있으며, 특히동물에서혈당강하및산화스트레스감소등에대한연구들 11,12 과함께인체연구로도여러방면에서연구들이발표되고있다. 22,23 그러나식품이아닌음료수를이용하여혈당강하효과를본인체대상연구는극히제한되어있다. 본연구에서제2형당뇨모델동물에게 16주동안자화수를투여한결과, 당뇨대조군에비해자화수투여군의혈당강하효과가뚜렷하게나타났으며혈장인슐린및당화혈색소지표에서도자화수투여의효과가뚜렷하게나타났다. 또한자화수군의수분섭취량도혈당이강하되는 9주 ~10주사이부터당뇨군에비해감소하였는데이러한효과는아마도혈당이개선되면서당뇨로인해증가하였던수분섭취가감소하였기때문인것으로보인다. 본연구실의선행연구에서자화수의투여가 streptozotocin으로유발한제1형당뇨쥐에서혈당강하효과가있는것이확인된것에이어, 3 이번에제2형당뇨모델을사용한본연구에서도역시자화수를 16주투여하였을때, 혈당강하등 glycemic control이개선되는효과가나타났다. 당뇨환자에있어혈당조절은가장기본적이며매우중요한의미를갖는다. 또한제2형당뇨의경우인슐린저항성은인슐린분비를조직에서알아차리지못하여제대로작용하지못하게되고이는다양한합병증을유발하기도한다. 자화수의투여가혈장인슐린농도를당뇨군에비해유의적으로감소시키고혈당강하가일어난것으로보아인슐린저항성이개선된것으로생각된다. 당화혈색소는공복혈당지표보다더안정적인당뇨관련지표로장기간의혈당을반영한다. 당화헤모글로빈이증가하게되면적혈수의산소분해능력이저하되고조직으로의산소이동도저하된다. 이로인해합병증이유발되며이는당뇨병에있어매우중요한의미를갖는지표로사용된다. 본연구에서일정기간동안의자화수투여가제2 형당뇨모델동물의당화헤모글로빈을유의적으로감소시킨것으로보아장기간의자화수음용은당화혈색소농도를감소시켜혈당조절에효과적인역할을하는것으로보인다. 자화수는일반물에비해 ph와전기전도율이높고, 24 삼투압도높아세포막을통한침투성이강하며, 25 세포내에직접적인영향을주어세포내효소들을활성화시키기도 한다. 26 Kim 등 27 은 db/db mouse에게일정기간동안이온수 (electrolyzed reduced water) 를보충투여한결과혈당개선효과를보였는데이는이온수의섭취가동물췌장의 β-세포손상을보호함으로써나타난결과라고하였다. 이온수는 ph가높고 ROS 소거능이뛰어난것으로알려져있는데, 27 자화수의경우에도일반물에비해높은 ph를가지고있고, 실험동물에서 DNA 손상을감소시키는효과도있으므로 3,20 이온수의투여와비슷한결과들이나타난것으로보인다. 당뇨로인해임파구 DNA 손상이일어날수있음은많이알려져있다. 28,29 Lazalde-Ramos 등 28 은제 2형당뇨환자들을대상으로한연구에서뇨의 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine (8-OHdG) 본 DNA 손상정도가대조군에비해높음을보고하였으며, Lodovici 등 29 도마찬가지로제 2형당뇨환자가대조군에비해임파구 DNA 손상도가높음을 comet assay를통해확인하였다. 또한비인슐린의존성환자를대상으로한연구들에서산화스트레스가증가함에따라항산화체계가저하되는것이보고되었다. 22,23 본연구에서당뇨로인해손상된 db/db mouse의세포 DNA 손상이자화수투여로회복되는지를 comet assay로알아본결과, 혈액과간모두 DNA 손상의세가지지표로본 DNA 손상이자화수투여후에유의적으로감소되는효과가나타났다. 본연구실에서수행한선행연구에서발암물질의일종인 diethyl nitrosamine (DEN) 을투여한 ICR mouse에게일정기간동안자화수를투여하였을때 DNA 손상정도가유의적으로감소하였고, 20 streptozotocin으로유발한제1형당뇨쥐모델에자화수를 8주동안투여하였을때임파구의 DNA 손상감소효과가나타났다. 3 제2형당뇨모델인 db/db mouse를사용한본연구에서도역시 16주동안의자화수투여후에세포의 DNA 손상감소효과가확연히나타났다. 이로써장기간의자화수투여는제 1형뿐아니라제2형당뇨에있어서도 glycemic control 뿐아니라당뇨로인해혹은다른원인으로인해손상된혈액과간세포의 DNA를회복시키는효과도있는것으로보인다. 인체와동물에있어서동맥경화증예방과치료에대한자화수의효과가최근연구되었으며, 그의기전에대해여러가지일치하지않는가정들이제안되고있다. 15,30,31 암컷마우스의생식기관에미치는자화수의영향에대한연구결과가보고되었으며, 18 자화수투여는나팔관 (fallopian) 의길이와 corpus lutea의수를증가시키는효과가있었다. 이런효과의기전은불분명하나가능한가설로는자화수의이런효과가산화스트레스와상피세포에서의세포성장과관련이있을수있음이제시되었다. 18

8 408 / 제 2 형당뇨쥐에서자화수의혈당및 DNA 손상개선효과 그동안자화수와일반물과의여러가지차이에대한연구들도수행되었는데, 32 자화수는산소농도와무기질용해도를증가시키고, 표면장력뿐만아니라전기전도도를감소시킴으로써세포벽의투과성 ( 침투성 ) 이향상되어물과영양소를신체의모든조직으로잘전달되도록촉진시킴으로써세포가효율적으로성장하도록도울수있다. 33,34 Nakagawa 등 34 은자기장 (magnetic field) 이있을때물에대한산소의용해도가가속되는것을관찰하였다. 또자화수는세포내에서여러효소들을활성화시킴으로써생화학적반응들을증가시키는것으로보인다. 18 Ma 등 15 은 potentiometric enzyme electrode법으로효소활성도를측정한결과자화수로인해 glutamate decarboxylase 활성이약 30% 증가한것을관찰하여자화수의생리활성에대한기전을 glutamate decarboxylase 효소의활성증가로인한것이라제안하였다. 이런효소활성도의증가는자화수가약한자장을형성하면자화수분자들간의상호작용은감소하는반면자화수와효소가상호작용을일으켜효소의활성도를변화시키기때문이다. 자화수가작은분자들, 특히 Ca 2+ 와같은작은분자의세포막투과성을증가시키거나간에서 superoxide dismutase (SOD) activity를증가시킬수있음도보고되었다. 18 몇몇동물실험에서자화수투여는심장, 신장, 그리고간에서 superoxide dismutase 활성을증가시키고, oxidant-antioxidant 균형에효율적으로영향을주어 malondialdehyde (MDA) 양을감소시키며, 산화스트레스를감소시키는 nitric oxide의양을감소시킴이관찰되었다. 36 또자화수투여로암컷쥐의생식작용이향상되었는데, 이는자화수가 free radicals와산화스트레스를감소시키는것과관련이있음도제시되었다. 37 따라서본연구에서자화수섭취로인한 DNA 손상감소효과는동물의산화스트레스감소에따른것으로여겨진다. 자화수투여로 DNA 손상이감소되는효과가항산화효소활성과관련이있을것으로생각되었으나본연구에서항산화효소인적혈구 SOD와 glutathione peroxidase (GSH- Px) 활성이자화수섭취후유의적으로개선되지않았으므로 DNA 손상감소효과와효소활성도와의관련성에대한부분은앞으로더깊이있게연구가되어야할것이다. 실제로체내존재하는수많은효소들은대사에있어서로영향을미치기때문에어느효소의작용에의한것인지그기전을명확하게알아보는것은쉽지않으며본연구에서항산화효소외에다른효소들의활성을분석하지않아 DNA 손상감소효과의정확한기전은규명하기어려웠다. 본연구에서자화수섭취시킨당뇨쥐를대상으로 DNA 손상도를측정하였고몇가지항산화효소활성도를측정하기는하였으나당뇨에있어서혈당저하의작용기전을 뒷받침할실험적인관찰이나 nitric oxide 등더다양한산화스트레스지표를측정하지못한점은본연구의제한점이라고할수있다. 앞으로당뇨의혈당강하기전과관련된좀더다양한산화스트레스관련지표들을광범위하게측정하는연구가지속적으로진행되어야할것이다. 이상으로자화수투여가 db/db mouse를사용한제2형당뇨의혈당강하를포함한 glycemic control에유리한개선효과를보일뿐아니라혈액과간의 DNA 손상감소효과까지보임을확인하였다. 그동안의이러한여러연구에도불구하고, 자화수의의료분야에의응용은아직도결론을내기어려운상황이다. 38,39 그러나그기전에대해서는확실하게규명하지못하였으므로앞으로자화수음용효과를뒷받침할더욱깊고다양한기전연구가수행되어야할것이다. 요약 자화수는가격이비싸지않고쉽게만들수있으며환경친화적인음용수임에도불구하고자화수섭취의건강상의유익에관해서는과학적인문헌이매우제한적이다. 본연구는유전적소인에의해제2형당뇨병이발현되는모델인 db/db 마우스 6주령 14마리를당뇨군과자화수군으로나누어각 7마리씩배치하고, 이형접합체마우스 10마리를대조군으로하여총 3군으로나누어 16주동안자화수를투여하였다. 혈당강하효과를보기위해공복혈당, 인슐린농도, 내당능검사, 당화헤모글로빈을측정하였고, DNA 손상감소효과, 항산화상태를알아보았다. 당뇨군과자화수군의혈당치는대조군에비해유의적으로높았으며, 당뇨군의혈당은자화수섭취 16주까지높게지속되었으나자화수군의혈당은섭취 10주후부터유의적으로감소하였다. 혈중당화헤모글로빈함량도마찬가지로대조군보다당뇨군에서증가하였고자화수군에서는유의적으로감소하였으나경구당부하검사결과, 혈당곡선하면적 (area under the curve, AUC) 은당뇨군과자화수투여군사이에유의적인차이를보이지않았다. 당뇨쥐의 DNA 손상정도는세가지지표 (DNA in tail, tail length, tail moment) 모두자화수군이당뇨군에비해유의적으로감소하였으며이러한효과는혈액과간에서모두나타났다. 적혈구항산화효소인 SOD, GSH-Px glutathione peroxidase 활성도는대조군, 당뇨군, 자화수군간에차이를보이지않았고, 혈장총항산화능인 TRAP 수준도자화수섭취로인한차이를볼수없었다. 결론적으로자화수투여가 db/db mouse를사용한제2형당뇨의혈당강하를포함한 glycemic control 에유리한개선효과를보일뿐아니라혈액과간의 DNA

9 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 401 ~ 410 / 409 손상감소효과까지보임을확인하였다. 그러나그기전에대해서는확실하게규명하지못하였으므로앞으로자화수음용효과를뒷받침할더욱깊고다양한기전연구가수행되어야할것이다. References 1. Korean Diabetes Association; Korean Diabetes Research Foundation. Diabetes fact sheet in Korea Seoul: Korean Diabetes Association; Dandona P, Thusu K, Cook S, Snyder B, Makowski J, Armstrong D, Nicotera T. Oxidative damage to DNA in diabetes mellitus. Lancet 1996; 347(8999): Lee HJ, Kang MH. Effect of the magnetized water supplementation on blood glucose, lymphocyte DNA damage, antioxidant status, and lipid profiles in STZ-induced rats. Nutr Res Pract 2013; 7(1): Park JH, Sung KS, Kim SS, Shim GS, Han CK. Effects of puffed and fermented red ginseng on blood glucose-related biomarkers in streptozotocin-induced diabetic rats. J Korean Soc Food Sci Nutr 2012; 41(5): Mozaffari MS, Baban B, Abdelsayed R, Liu JY, Wimborne H, Rodriguez N, Abebe W. 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10 410 / 제 2 형당뇨쥐에서자화수의혈당및 DNA 손상개선효과 31. Naher ZU, Ali M, Biswas SK, Mollah FH, Fatima P, Hossain MM, Arslan MI. Effect of oxidative stress in male infertility. Mymensingh Med J 2013; 22(1): Sueda M, Katsuki A, Nonomura M, Kobayashi R, Tanimoto Y. Effects of high magnetic field on water surface phenomena. J Phys Chem C Nanomater Interfaces 2007; 111(39): Cho YI, Lee SH. Reduction in the surface tension of water due to physical water treatment for fouling control in heat exchangers. Int Commun Heat Mass Transf 2005; 32(1-2): Nakagawa J, Hirota N, Kitazawa K, Shoda M. Magnetic field enhancement of water vaporization. J Appl Phys 1999; 86(5): Wang D, Cheng X, Yan X. Effect of magnetized liquor on free radical metabolism in the heart of mice. Chin J Med Phys 2002; 19(4): Raymond-Whish S, Mayer LP, O'Neal T, Martinez A, Sellers MA, Christian PJ, Marion SL, Begay C, Propper CR, Hoyer PB, Dyer CA. Drinking water with uranium below the U.S. EPA water standard causes estrogen receptor-dependent responses in female mice. Environ Health Perspect 2007; 115(12): Shah D, Nagarajan N. Luteal insufficiency in first trimester. Indian J Endocrinol Metab 2013; 17(1): Lu J, Mao Y, Yang Y, Wang Y, Shi Y, Zhou O. Influence of magnetized water on the experimental hyperlipemia and atherosclerosis in rabbits. Shanghai Lab Anim Sci 2000; 20: Hafizi L, Sazgarnia A, Mousavifar N, Karimi M, Ghorbani S, Kazemi MR, Emami Meibodi N, Hosseini G, Mostafavi Toroghi H. The effect of extremely low frequency pulsed electromagnetic field on in vitro fertilization success rate in NMRI mice. Cell J 2014; 15(4):