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1 대한내분비학회지 : 제 23권제 1 호 2008 원 저 /jkes OLETF 쥐에서날록손의 MTII 에의한식욕억제증가효과 조은병원신경외과, 영남대학교의과대학생리학교실 1, 소아과학교실 2, 신경외과학교실 3, 내과학교실 4 배장호 박용훈 2 김성호 3 박소영 1 김종연 1 손조영 1 허정윤 1 원규장 4 김용운 1 Naloxone Increases the norexic Effect of MTII in OLETF Rats Jang Ho ae, Yong Hoon Park 2, Sung Ho Kim 3, So Young Park 1, Jong Yeon Kim 1, Jo Young Son 1, Jung Yoon Huh 1, Kyu Chang Won 4, Yong Woon Kim 1 Department of Neurosurgery, Joeun Hospital; and Department of Physiology 1, Pediatrics 2, Neurosurgery 3, Internal Medicine 4, College of Medicine, Yeungnam University STRCT ackground: Leptin, an adipocyte-derived hormone, inhibits obesity in lean subjects, but is not widely used because of leptin resistance. Thus, circumventing the arcuate nucleus of the hypothalamus, the site responsible for leptin resistance, has been evaluated for treatment of obesity. However, chronic treatment of melanotan II (MTII), a synthetic agonist of the melanocortin 3/4 receptor, induces tachyphylaxis. Here, we evaluated whether naloxone, a non-specific agouti-related peptide (grp) antagonist, increases the anorexic effect of MTII in Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) rats. Methods: We measured food intake following intracerebroventricular (i.c.v.) infusion of MTII and/or naloxone in OLETF rats. Sprague-Dawley rats were used as a normal control group. Results: The anorexic effect of i.c.v. MTII infusion decreased with time in OLETF rats, indicating the development of tachyphylaxis. In normal control rats, naloxone alone decreased grp expression in the hypothalamus but failed to induce anorexia. Moreover, there was no additional anorexic effect with co-treatment of naloxone and MTII. In OLETF rats, naloxone alone did not show an anorexic effect despite increased POMC expression in the hypothalamus. However, naloxone sensitized the anorexic effect of MTII when treated together. Conclusion: These results suggest that naloxone augmented the anorexic effect of MTII when treated together in OLETF rats, but had no effect alone. These results suggest that a combination therapy of naloxone and a melanocortin receptor activator would be an effective modality for treatment of obesity. (J Kor Endocr Soc 23:18~ ) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: OLETF rats, leptin resistance, MTII, naloxone, tachyphylaxis 서론 1) 비만은현대문명사회에서점차증가하는질환으로대사 접수일자 : 2007년 11월 13일통과일자 : 2007년 11월 30일책임저자 : 김용운, 영남대학교의과대학생리학교실 * 이논문은 2006년도재단법인천마의학연구재단지원에의하여이루어졌음. 증후군과관련된당뇨병, 고혈압, 동맥경화, 고지혈증및고요산증등의유병률을높여서의료비용을증가시키는중요한요인이되고있다. 비만은체지방이증가된상태로에너지의섭취가소비보다높은경우에발생한다. 인체는체내에너지항상성을유지하기위하여여러가지조절기전들을사용하는데그중가장중요한부분이체지방과에너지원섭취에따라분비가조절되는렙틴이다 [1]. 렙틴은지방세포에서분비되어혈관 뇌장벽을통과한후시상하부의궁상핵에서렙틴수용체에작용하여 proopiomelanocortin (POMC)

2 - 배장호외 8 인 : OLETF 쥐에서날록손의 MTII 에의한식욕억제증가효과 - 유전자발현을자극한다 [2]. 그결과만들어진 α-melanocyte stimulating hormone (α-msh) 이뇌실주위핵 (paraventricular nucleus, PVN) 에서 3,4형 melanocortin 수용체 (MC3/4 receptor, MC3/4R) 에작용하여 melanocortin 계를활성화시킴으로서식욕을감소시킬뿐아니라에너지소비도증가시킨다 [3]. 그러나비만환자에서렙틴농도가증가하고렙틴의투여에도식욕억제나에너지소비증가가나타나지않는렙틴저항성이발생하기때문에렙틴의임상적용이극히제한적으로밖에이루어지지않았다 [4,5]. 렙틴저항성은렙틴이혈관뇌장벽을통과하는과정부터시상하부궁상핵에서의수용체결합과정과신호전달과정을거쳐서 melanocortin 계를활성화시키기까지의각단계에서결함이있으면발생하는데궁상핵에서의렙틴신호전달과정의결함이가장중요한원인이된다 [6,7]. 따라서렙틴저항성이발생한궁상핵을우회하여 PVN의 MC3/4R을직접자극하여렙틴유사효과를유도하는연구들이이루어졌다. MC3/4R agonist인 melanotan II (MTII) 가사용되었는데, 정상실험동물에서는 MTII의렙틴유사효과가시간이경과할수록감소하는빠른내성 (tachyphylaxis) 의발생 [8] 이보고되었다. 그러나 Scarpace 등 [9] 은시상하부에렙틴유전자를과발현시켜렙틴 -유도형렙틴저항성이발생한쥐에서뇌실로주입한 MTII의효과가정상쥐에비하여증가한것을관찰하였으며, Kim 등 [10] 은 monosodium glutamate (MSG)-유도비만쥐모델에서 MTII가정상군보다현저한렙틴유사효과를나타냄을보고하였다. 특히 Kim 등 [10] 은 MSG-비만쥐에서 MTII의렙틴유사효과가증가된원인으로 MSG-비만쥐의시상하부에서 MC3/4R의길항제인 agouti-related peptide (grp) 의발현이현저히감소해있는것과관련이있을것으로주장하였다. 그러나아직다른비만모델에서 MTII의효과가증폭되어나타나는지에관해서는알려져있지않다. 따라서 MSG-비만모델이외의비만모델에서 MTII의렙틴유사효과가증가해있는지를확인하고, MTII를장기간투여할때빠른내성이발생 한다면이를억제할수있는방법을찾아내는것이필요할것이다. 본연구에서는 MTII에의한빠른내성의한원인이 melanocortin 계의과도한자극에따른보상적인 grp증가에있기때문에 grp를억제하면 MTII의효과를증가시킬수있을것이라는가설을만들고이를증명하기위하여 Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty (OLETF) 쥐를사용하여 grp의비특이적차단제인날록손 (naloxone)[11] 을 MTII와함께뇌실로투여하면서식욕억제증가효과를관찰하고자하였다. 대상및방법 1. 실험동물비만쥐에서날록손이 MTII의식이억제효과를강화시키는지를관찰하기위하여 7개월된 OLETF 쥐를오츠카제약회사 (Osaka, Japan) 에서제공받아서사용하였다. 정상대조군으로는 4개월의 Sprague-Dawley (SD) 쥐를사용하였다. 실험동물의실험시작시체중은 Table 1에나타내었다. 모든실험동물은영남대학교의과대학청정사육사에서사육되었으며, 도착후 1주일간의적응기간을거친후에실험에사용되었다. 오전 7시부터 12시간은밝게유지하고이후 12시간은소등하였다. 실험동물은영남대학교의과대학동물실험관리지침에따라서관리되었다. 2. MTII, 날록손, 및생리식염수의주입 MTII (1 nm, Pheonix Pharmaceutical Co, Z), naloxone (100 μg, Sigma Chemical Co, MO), MTII + 날록손, 및생리식염수를지난연구 [10] 에사용한방법에따라좌측뇌실로주입하였다. 간단히요약하면, 실험동물을 Tiletamine와 Zolazepam ( 각각 25 mg/kg, Zoletil R, Virbac, Carros, France) 과 xylazine hydrochloride (8 mg/kg) 을복강내주사하여마취시킨후 stereotaxic 장치에고정하고피부를중앙 Table 1. ody weights of the experimental groups Groups ody weights (g) SD rats Saline 327 ± 5.5 MTII 326 ± 11.8 Naloxone 340 ± 8.2 MTII+naloxone 347 ± 9.0 OLETF rats Saline 624 ± 20.2 Naloxone 636 ± 21.9 MTII 626 ± 32.3 MTII+naloxone 624 ± 23.2 Values are mean ± S.E. Number of cases is six per each group. SD, Sprague-Dawley; OLETF, Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty

3 대한내분비학회지 : 제 23 권제 1 호 2008 Table 2. Real-time PCR primer sequences Sequences Tm Extension time POMC NPY grp MC4R β-actin 5'-acc tca cca cgg aaa gca a-3 5'-cgg gga ttt tca gtc aag g-3' 5'-tat ccc tgc tcg tgt gtt tg-3' 5'-gtt ctg ggg gca ttt tct g-3' 5'-agc aga ccg agc aga aga tg-3' 5'-gac tcg tgc agc ctt aca ca-3' 5'-ggt cgg gat cat cat cag ttg ta-3 5'-cat cag gaa cat gtg gac ata ga-3' 5'-tac tgc cct ggc tcc tag ca-3' 5'-tgg aca gtg agg cca gga tag-3' sec 9 sec 5 sec 7 sec 4 sec POMC, proopiomelanocortin; NPY, neuropeptide Y; grp, agouti-related peptide; MC4R, melanocortin receptor 4. 선을따라절개하고대천문 (bregma) 의후방으로 1.3 mm, 측방으로 1.9 mm 지점에구멍을만들고 3 mm 깊이로뇌주입기 (brain infusion kit) 를삽입하였다. 뇌주입기는약물들이담긴 osmotic minipump (lzet) 와연결한다음두개골에고정한두개의작은나사를지지대로사용하여치과용시멘트로고정하였다. Osmotic minipump는등뒤피하조직에만든공간에위치시켰다. 약물주입속도는 1 μl/hr이었으며 1 주일간계속주입하였다. MTII의투여농도는 Kim 등 [10] 의보고를참고하였으며, 날록손의투여농도는 Dube 등 [12] 의보고를따랐다. 3. 시료의채취 1주일간의주입을마친후오전 9시경에앞에서술한 Zoletil로마취를시켰다. 복벽과흉벽을절개하여심장을노출시키고좌심실에주사기를삽입하여혈액을채취한다음차게한생리식염수 50 ml를밀어넣어관류시킨다. 관류직전에대정맥동을절개하여관류액을빠져나오게유도하였다. 복강에서고환주위지방과콩팥주위지방및후복막강지방조직을모두절제하고무게를측정하여복강내지방량으로판정하였다. 마지막으로뇌를분리하여 Kim 등 [13] 의방법을사용하여시상하부를적출한다음액체질소에보관하였다가분석에사용하였다. 4. Real-time PCR 시상하부의유전자발현은 real-time PCR로분석하였다. 먼저 RN를추출하는과정을요약하면, 1 ml TRI-reagent (Sigma Chemical Co, MO) 에시상하부조직을넣고초음파를이용하여균질화시켰다. 여기에 200 μl의 chloroform을넣고 15초간격렬하게흔든뒤실온에서 5분간반응시킨다음 4, 13,200 rpm에서 15분간원심분리하였다. 분리된상청액에같은부피의 isoprophanol을넣고 10분간상온에서반응을거친다음다시 4, 13,200 rpm으로 10분간원심분리하여 RN를침전시켰다. 침전시킨 RN를차가운 75% ethanol 1 ml로세척하고 4, 13,200 rpm에서 5분간원심분리하고침전물을실온에서건조시켰다. 마지막으로남은 RN를 Rnase가제거된물 30 μl에녹여 70 에서보관하였다. RN 농도는 Nano-drop을이용하여 260 및 280 nm 파장에서측정하였다. RN를증폭시키는과정을요약하면, 분리한 RN 1 μg 을 70 에서 5분반응시킨뒤, M-MuLV Reverse Transcriptase와 dntp, oligo (dt) primer를넣어 (First Strand cdn Synthesis Kit, Fermentas) 42 에서 60분, 70 에서 10분반응시켜 cdn 를만들었다. 이후 FastStart Taq DN plymerase (LightCycler FastStart DN Master SYR Green I, Roche) 와 3 mm MgCl 2, 0.4 μm primer를첨가하여 LightCycler 1.5 Instrument에서증폭시켰다. 그과정은 95 에서 10분의전반응을거친다음, 변성 (95, 10 초 ), 어닐링 (54~60, 5초 ), 및연장 (72, 4~9초 ) 의과정을 45회반복하는것이었다. 반응이끝난뒤에증폭의특이도를확인하기위하여온도를 65 까지내린후에점차적으로 0.2 / 초의속도로 95 까지온도를높여형성된 PCR 산물의동일성여부를분석하였다. 내부표준으로는 β-actin을사용하였으며 primer 서열은 Table 2에나타내었다. 5. 통계분석성적은평균 ± 표준오차로표기하였다. 각군간의차이는 t-test를사용하여평가하였으며, 약물주입에따른식이섭취와체중의변화는 NOV로검정하였다. 95% 유의수준을인정하였다. 결과 1. MTII와날록손의효과 MTII는대조군인 Sprague-Dawley 쥐와비만군인 OLETF 쥐모두에서유의하게식욕을억제하였으나시간이경과함나타내었다 (Fig. 2). 비만쥐에서는 MTII 뿐아니라날록손도

MTII (1 nm/day/rat) and/or naloxone (100 μg/day/rat) were infused for 7 days. Values are means ± SE of six rats per group. * P < 0.01, P < 0.05, P < 0.01 vs saline, P < 0.05, P < 0.05 vs naloxone, P < 0.

4 - 배장호외 8 인 : OLETF 쥐에서날록손의 MTII 에의한식욕억제증가효과 - Infusion of MTII and/or naloxone, 1 μl/hr Infusion of MTII and/or naloxone, 1 μl/hr * C D Fig. 1. Effects of MTII and/or naloxone on daily food intake and total food intake in SD (, C, respectively) and OLETF (, D, respectively) rats. MTII (1 nm/day/rat) and/or naloxone (100 μg/day/rat) were infused for 7 days. Values are means ± SE of six rats per group. * P < 0.01, P < 0.05, P < 0.01 vs saline, P < 0.05, P < 0.05 vs naloxone, P < 0.05 vs MTII. Infusion of MTII and/or naloxone, 1 μl/hr Infusion of MTII and/or naloxone, 1 μl/hr * Fig. 2. Effects of MTII and/or naloxone on body weight changes in SD () and OLETF () rats. MTII (1 nm/day/rat) and/or naloxone (100 μg/day/rat) were infused for 7 days. Values are means ± SE of six rats per group. * P < 0.05, P < 에따라식욕억제효과가감소하는빠른내성을나타내었다 (Fig. 1). 그러나날록손은정상대조쥐와비만쥐모두에서생리식염수주사군에비하여유의한식욕억제효과를나타내지못하였다. MTII와날록손을함께처치하였을때대조쥐에서는 MTII 단독투여군에비하여식욕이차이가나타나지 않았으나, 비만쥐에서는 MTII 단독투여군에비하여추가적인식욕억제가유도되었다 (P < 0.01). 체중의변화는정상대조쥐에서날록손이유의한차이를나타내지못하였지만 MTII는체중의감소를유도하였다. 그러나체중의감소는시간이지남에따라줄어드는양상을

대한내분비학회지 : 제 23 권제 1 호 2008 체중을감소시키는효과를나타내었으며 (P < 0.05) MTII와날록손의혼합투여시추가적인체중감소를나타내었다 (P < 0.01). 정상대조군에서수술후식이섭취와체중이빠르게회복되는데반하여비만쥐에서는식이섭취의회복이느리고체중은계속감소하는양상을나타내었다. 이결과는비만쥐에서수술후회복이지연됨에따른현상으로사료되었다.

그러나비만쥐에서는날록손에의해서는내장지방량감소가유도되지않았으나 MTII와함께처치하였을때유의한차이는아니었으나 (P = 0.06) 추가적인감소를나타내는경향을보여주었다 (Fig. 3). 2. MTII 와날록손투여후시상하부식욕조절단백질발현변화 Real-time PCR 로분석한결과에따르면, 정상대조쥐에서 Fig. 3. Effects of MTII and/or naloxone on percent visceral fat mass in SD () and OLETF () rats.

5 대한내분비학회지 : 제 23 권제 1 호 2008 체중을감소시키는효과를나타내었으며 (P < 0.05) MTII와날록손의혼합투여시추가적인체중감소를나타내었다 (P < 0.01). 정상대조군에서수술후식이섭취와체중이빠르게회복되는데반하여비만쥐에서는식이섭취의회복이느리고체중은계속감소하는양상을나타내었다. 이결과는비만쥐에서수술후회복이지연됨에따른현상으로사료되었다. 연령 7개월의 OLETF 비만쥐는복강내지방량이체중의 7.3% 인 45.7 ± 3.76 g으로대조쥐의 5.7 ± 0.21 g ( 체중의 1.7%) 에비하여심한복강내지방축적을나타내었다. 복강내지방량은대조쥐에서 MTII에의하여현저한감소를나 타내었지만날록손에의하여서는체지방감소가나타나지않았으며 MTII와날록손을함께처치하여서도추가적인체지방감소는나타나지않았다. 그러나비만쥐에서는날록손에의해서는내장지방량감소가유도되지않았으나 MTII와함께처치하였을때유의한차이는아니었으나 (P = 0.06) 추가적인감소를나타내는경향을보여주었다 (Fig. 3). 2. MTII 와날록손투여후시상하부식욕조절단백질발현변화 Real-time PCR 로분석한결과에따르면, 정상대조쥐에서 Fig. 3. Effects of MTII and/or naloxone on percent visceral fat mass in SD () and OLETF () rats. MTII (1 nm/day/rat) and/or naloxone (100 ug/day/rat) were infused for 7 days. Values are means±se of six rats per group. * P < 0.01 vs saline, P < 0.05, P < 0.01 vs naloxone, P < 0.05 vs MTII. C P = D Fig. 4. Expressions of POMC (), NPY (), grp (C), and MC4R (D) in the hypothalamus of saline-, naloxone-, MTII-, MTII plus naloxone-treated Sprague-Dawley rats. Values are means ± SE of six rats per group

- 배장호외 8 인 : OLETF 쥐에서날록손의 MTII 에의한식욕억제증가효과 - C D Fig. 5. Expressions of POMC (), NPY (), grp (C), and MC4R (D) in the hypothalamus of saline-, naloxone-, MTII-, MTII plus naloxone-treated OLETF rats.

01) grp도증가하는경향을나타내었다 (Fig. 5). 그러나 NPY와 MC4R의발현에는유의한차이가나타나지않았다. 고찰본연구는렙틴저항성을나타내는비만모델에서렙틴저항성의표적부분인시상하부의궁상핵을우회하여뇌실주위핵의 melanocortin 수용체를직접자극하는방법의효율성을검정하고그효율성을증가시키는방법을확인하고자하였다.

6 - 배장호외 8 인 : OLETF 쥐에서날록손의 MTII 에의한식욕억제증가효과 - C D Fig. 5. Expressions of POMC (), NPY (), grp (C), and MC4R (D) in the hypothalamus of saline-, naloxone-, MTII-, MTII plus naloxone-treated OLETF rats. Values are means ± SE of six rats per group. *P < 0.01 vs saline. 는날록손투여로 NPY와 grp가감소하는경향을나타내었으며, MTII 처치시 grp는증가하는 MC4R은감소하는경향을나타내었다. 그러나통계적으로유의한차이는없었다 (Fig. 4). 비만쥐에서는날록손처치시 POMC가현저히증가하였으며 (P < 0.01) grp도증가하는경향을나타내었다 (Fig. 5). 그러나 NPY와 MC4R의발현에는유의한차이가나타나지않았다. 고찰본연구는렙틴저항성을나타내는비만모델에서렙틴저항성의표적부분인시상하부의궁상핵을우회하여뇌실주위핵의 melanocortin 수용체를직접자극하는방법의효율성을검정하고그효율성을증가시키는방법을확인하고자하였다. OLETF 비만쥐에서 MTII의렙틴유사효과는대조군에비하여증가되지않았으며빠른내성을나타내었다. 그러나 OLETF 비만쥐에 grp 억제제인날록손을 MTII와함께뇌실로투여하여 MTII에의한식욕억제와체중감소및복강내지방감소를증폭시키는결과를얻었다. 본연구에사용한 OLETF 비만쥐는위장으로부터의포만신호를받는 CCK 수용체에결함이있어서포만감을느끼지못하는장애로과잉식욕을나타내게되며 [14], 복강내에지방이심하게축적되어중년이후에발생하는복부비만과유사한특성을나타내며렙틴저항성과현저한혈중렙틴농도증가를특징으로하고있다. 본연구에서도체중의 7.3% 가복강내지방으로축적된심한복부비만을보여주었다. 렙틴저항성이발생하면궁상핵에서 POMC를활성화시키는과정은장애가발생하지만궁상핵으로부터신호를받는 melanocortin 계는정상이다. 최근에는 melanocortin 계가에너지대사조절에중요한역할을한다는사실이밝혀지고, MC4R을결손시킨생쥐에서비만이발생하고사람에서고도비만의 4~5% 가 MC4R의돌연변이때문인것으로보고되어 [15], melanocortin 계가비만치료의중요한목표점으로생각하게되었다. MC4R은작용제인 α-msh의농도에따라증가또는감소하게된다. POMC 발현이감소된노인쥐시상하부에 POMC를과발현시키면 melanocortin 계가활성화되어비만을줄일수있지만 [16], 젊은쥐시상하부에 POMC를과발현시키면고지방식이시비만이오히려더잘유도되는것으로보고되었는데 [17], 그원인으로 α-msh 증가에의한 MC4R의감소와 grp 발현이증가한결과임이제시되었다. grp는 MC4R에대하여 α-msh와작용제인 MTII에경쟁적으로결합하여억제효과를나타내게된다 [18]. grp 과발현마우스는비만이발생하게되며 [19], grp 결손생쥐는나이가들어서체중이빠지는특성을나타낸다 [20]. 또한뇌실로투여된 grp는식욕을증가시키는데 [21,22], 특히식욕증가효과가 10 pmol 주사시 24시간, 100 pmol 주사시 1주간지속되는강력한작용으로 [23] grp가비만과관련된중요한표적물질로생각하게되었다. 이러한 grp의식욕증가효과는아편양수용체의비특

7 대한내분비학회지 : 제 23 권제 1 호 2008 이적인길항제인날록손에의하여차단될수있음이보고되었다 [23,24]. rugman 등 [11] 은아편양수용체를차단하면 grp에의한식욕촉진효과를차단할수있다고하였으며, 날록손은 galanin에의한식욕증가도감소시킨다고보고되었다 [12]. 또한 μ-아편양수용체결손생쥐는고지방식이에도비만이잘발생하지않는양상이보고되어 [25], 아편양물질이식이조절에관여한다는것을알수있었다. 본연구에서는 OLETF 비만쥐에서 MTII를뇌실로주입하였을때식욕억제효과가대조쥐에비하여증가하지않았으며, 빠른내성도발생하였다. 이결과는 MSG-비만쥐에서 MTII에증폭된반응으로나타났다는보고 [10] 와차이가있었다. 그차이는 Kim 등 [10] 이사용한 MSG-비만쥐는대조군에비하여시상하부 grp가현저히감소한데반하여본연구에사용한 OLETF 비만쥐의 grp 발현이정상대조쥐에비하여감소하지않은점에기인하는것으로생각된다. 위의결과들과 Li 등 [17] 의정상쥐시상하부에서 POMC 과발현시 grp가증가하여고지방식이에의하여비만이오히려더잘유도되었다는보고 [17] 를종합해보면 MTII를장기간처치할때발생하는빠른내성의기전은 melanocortin 계의자극에따른음성되먹이기기전으로인한 grp의보상적증가에기인하는것으로생각된다. 본연구에서확인된결과도정상대조쥐와 OLETF 비만쥐에서 MTII 처치시통계학적으로유의한차이는아니었지만 grp의발현이증가하는경향을나타내었으며 MC4R이감소하는경향을나타내어위가정을뒷받침하였다. 따라서본연구에서는 grp 를억제하는것으로 MTII에의한빠른내성의발생을억제할수있는지를규명하기위하여비특이적으로 grp를차단하는날록손을 MTII 함께처치하여렙틴유사효과를관찰하였다. 날록손은정상쥐에서는식욕에영향을미치지못하였으나 OLETF 비만쥐에서는 MTII의식욕억제효과를증가시켰다. 날록손은정상쥐와 OLETF 비만쥐모두에서단독투여시에는식이섭취에영향을미치지못하였다. 이는날록손이단독으로식이섭취를억제한다는보고 [12] 와는차이가있었지만날록손단독투여시식이섭취에영향을미치지않다가다른약물과병용투여에는추가적인식이섭취억제를나타낸다는 Schusdziarra등 [26] 의보고와일치하였다. Schusdziarra 등 [26] 은뇌실로주사한날록손 (25 μg) 이식이섭취는감소시키지못하였지만 glucagon-like peptide 1 (GLP-1) 와함께주사될때는 GLP-1의식욕억제효과를증폭시키는것으로나타났으며, 특히식욕억제효과를나타내지못하는 5 μg의 GLP-1에병행하여서도식이섭취억제효과를나타내었다고보고하였다. 또한위결과는 MaLaughlin 과 aile[27] 의날록손에대하여비만모델에서더욱예민하게반응한다고보고와유사한점이있다. 이와같이날록손에대한효과가단독또는병합투여및종간에다른이유는아편양수용체가널리퍼져있고시상하부에수많은핵들이 존재하여서로복잡하게연결되어있는시상하부의내적환경과관련이있는것으로생각된다. 생체에서식욕은, 기전은매우복잡하지만, 식욕을증가시키는신호와억제시키는신호사이의균형에의하여조절되며, 체중은식욕조절에에너지소비과정이추가되어조절되게된다. 본연구의결과중비만쥐에서날록손투여가식욕은억제시키지못하였으나체중의유의한감소를초래한부분이날록손의작용이뇌에서광범위하게나타나고식욕과에너지대사의조절방향이일치하지않은점과관련이있을것으로생각한다. 따라서아직 grp에특이적인길항제가시판되지않아서날록손을사용한점은본연구의제한점으로추후특이적인길항제를사용하는연구가이루어지면좀더일관성있는결과를도출할수있을것으로생각한다. 그리고본연구에서분석한식욕관련펩타이드는주로궁상핵에서이루어지는변화이기때문에 PVN에존재하는 melanocortin 계의자극효과는식욕의감소로밖에평가할수없었다는것이또다른제한점이었다. 식욕조절의중추인시상하부의식욕조절물질을분석한결과와식이섭취를비교하면, 정상대조군에서는날록손을투여하였을때시상하부 NPY와 grp 발현이감소하는경향을보였지만 POMC 역시감소하는경향을나타내어식욕에뚜렷한변화를초래하지못한것으로생각되었다. OLETF 비만쥐에서도시상하부에서 POMC 발현이증가되었음에도불구하고식이섭취가억제되지않은원인으로 NPY와 grp의동반상승경향을생각할수있겠다. OLETF 비만쥐는포만감에장애가있어서렙틴신호에따른 POMC 의변화에의하여식욕이좌우되는정상적인상태와는달리 NPY와 grp의역할이강조된다는점 [28] 을감안하면부분적으로설명이되지만추가적인연구가필요한부분이다. 요약하면, OLETF 비만쥐에서뇌실로 1주일간주입한 MTII의렙틴유사효과는정상대조쥐에비하여증가하지못하였으며빠른내성이발생하였다. 날록손은대조쥐와 OLETF 비만쥐에서단독으로는식욕억제효과가나타나지않았으나 OLETF 비만쥐에서 MTII와함께투여하였을때 MTII의식욕억제, 체중감소및복강내지방감소효과가증가되었다. 이결과는 melanocortin 계를목표로하는비만약물을사용할때날록손을함께사용하는것이효과적임을시사하는것이다. 요약연구배경 : 지방세포에서분비되어시상하부에작용하여식욕감소와에너지소비증가를유도하는렙틴은강력한체지방감소효과에도불구하고비만한사람이나실험동물에서발생하는렙틴저항성때문에임상에서제한적으로만사용되고있다. 따라서렙틴저항성의원인이되는시상하부의

8 - 배장호외 8 인 : OLETF 쥐에서날록손의 MTII 에의한식욕억제증가효과 - 궁상핵우회한 melanocortin 계를자극하여렙틴효과를만들어내는연구들이진행되어왔다. 그러나제 3/4형 melanocortin 수용체에작용하는 MTII를뇌실로장기간주입하면렙틴유사효과가시간이지나면서감소하는빠른내성이나타나게된다. 본연구에서는 MC3/4R에억제적으로작용하는 grp를날록손으로차단하여 MTII의렙틴유사효과를증가시킬수있는지를규명하고자하였다. 방법 : 비만실험동물로는 OLETF 비만쥐를, 정상대조군으로는 Sprague- Dawley 쥐를사용하였다. MTII와날록손을뇌실로삽입된뇌주입기와연결된 osmotic minipump를사용하여 1주일간투여하면서매일식이섭취량을측정하여식욕억제효과를판정하였다. 결과 : OLETF 비만쥐에 MTII를주입한결과초기에는식욕억제가나타났으나시간이지남에따라그효과가감소하는빠른내성이나타났다. 그러나 OLETF 비만쥐에서 MTII와날록손을함께투여한경우에는 MTII의식욕억제, 체중감소및복강내지방감소효과가증가되었다. 정상대조쥐에서는날록손의식욕억제효과가나타나지않았을뿐아니라 MTII의효과도증가시키지못하였다. OLETF 쥐에서 real-time PCR로분석한시상하부 proopiomelanocortin (POMC) 발현은날록손처치군에서유의하게증가하였다. grp의발현은 MTII, 날록손, 및혼합투여군에서증가하는경향을나타내었다. Neuropeptide Y (NPY) 의발현은 grp와유사한경향을나타내었다. 제4형 melanocortin 수용체발현은정상대조쥐에서 MTII처치에의하여감소하는경향이었으나 OLETF 비만쥐에서는차이가없었다. 결론 : OLETF 비만쥐에서날록손은단독투여로는식욕억제효과를나타내지못하였으나 MTII와함께투여되었을때는 MTII의식욕억제, 체중감소및복강내지방감소효과를증가시켰다. 이결과는 melanocortin 계를목표로하는비만약물을사용할때날록손을함께사용하는것이효과적임을시사하는것이다. 참고문헌 1. Zhang Y, Proenca R, Maffei M, arone M, Leopold L, Friedman JM: Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372: , Scarpace PJ, Tümer N: Peripheral and hypothalamic leptin resistance with age-related obesity. Physiol ehav 74: , Shek EW, Scarpace PJ: Resistance to the anorexic and thermogenic effects of centrally administrated leptin in obese aged rats. Regul Pept 92(1-3):65-71; Van Heek M, Compton DS, France CF, Tedesco RP, Fawzi, Graziano MP, Sybertz EJ, Strader CD, Davis HR Jr: Diet-induced obese mice develop peripheral, but not central, resistance to leptin. J Clin Invest 99: , Widdowson PS, Upton R, uckingham R, rch J, Williams G: Inhibition of food response to intracerebroventricular injection of leptin is attenuated in rats with diet-induced obesity. Diabetes 46: , Caro JF, Kolaczynski JW, Nyce MR, Ohannesian JP, Opentanova I, Goldman WH, Lynn R, Zhang PL, Sinha MK, Considine RV: Decraesed cerebrospinalfluid/serum leptin ratio in obesity, a possible mechanism for leptin resistance. Lancet 348: , Halaas JL, oozer C, lair-west J, Fidahusein N, Denton D, Friedman JM: Physiological response to long term peripheral and central leptin infusion in lean and obese mice. Proc Natl cad Sci US 94: , Jonsson L, Skarphedinsson JO, Skuladottir GV, tlason PT, Eiriksdottir VH, Franzson L, Schiöth H: Melanocortin receptor agonist transiently increases oxygen consumption in rats. Neuroreport 12: , Scarpace PJ, Matheny M, Zolotukhin S, Tümer N, Zhang Y: Leptin-induced leptin resistant rats exhibit enhanced responses to the melanocortin agonist MT II. Neuropharmacology 45: , Kim YW, Choi DW, Park YH, Huh JY, Won KC, Choi KH, Park SY, Kim JY, Lee SK: Leptin-like effect of MTII are augmented in MSG-obese rats. Regul Pept 127:63-70, rugman S, Clegg DJ, Woods SC, Seeley RJ: Combined blockade of both micro- and kappa-opioid receptors prevents the acute orexigenic action of gouti-related protein. Endocrinology 143: , Dube MG, Horvath TL, Leranth C, Kalra PS, Kalra SP: Naloxone reduces the feeding evoked by intracerebroventricular galanin injection. Physiol ehav 56: , Kim YW, Kim JY, Park YH, Park YH, Park SY, Won KC, Choi KH, Huh JY, Moon KH: Metformin Restores Leptin Sensitivity in High Fat Fed Obese Rats with Leptin Resistance. Diabetes 55: ,

9 대한내분비학회지 : 제 23 권제 1 호 Covasa M, Ritter RC: ttenuated satiation response to intestinal nutrients in rats that do not express CCK- receptors. Peptides 22: , Spiegelman M, Flier JS: Obesity and the regulation of energy balance. Cell 104: , Li G, Zhang Y, Wilsey JT, Scarpace PJ: Hypothalamic pro-opiomelanocortin gene delivery ameliorates obesity and glucose intolerance in aged rats. Diabetologia 48: , Li G, Zhang Y, Cheng KY, Scarpace PJ: Lean rats with hypothalamic pro-opiomelanocortin overexpression exhibit greater diet-induced obesity and impaired central melanocortin responsiveness. Diabetologia 50: , Fong T, Mao C, MacNeil T, Kalyani R, Smith T, Weinberg D, Tota MR, Van der Ploeg LH: RT (protein product of agouti-related transcript) as an antagonist of MC-3 and MC-4 receptors. iochem iophy Res Commun 237: , Ollmann MM, Wilson D, Yang YK, Kerns J, Chen Y, Gantz I, arsh GS: ntagonism of central melanocortin receptors in vitro and in vivo by agouti-related protein. Science 278: , Wortley KE, nderson KD, Yasenchak J, Murphy, Valenzuela D, Diano S, Yancopoulos GD, Wiegand SJ, Sleeman MW: gouti-related protein-deficient mice display an age-related lean phenotype. Cell Metab 2: , Rossi M, Kim MS, Morgan DG, Small CJ, Edwards CM, Sunter D, busnana S, Goldstone P, Russell SH, Stanley S, Smith DM, Yagaloff K, Ghatei M, loom SR: C-terminal fragment of agouti-related protein increases feeding and antagonizes the effect of α-melanocyte stimulating hormone in vivo. Endocrinology 139: , Hagan MM, Rushing P, Pritchard LM, Schwartz MW, Strack M, Van der Ploeg LH, Woods SC, Seeley RJ: Long-term orexigenic effects of grp- (83-132) involve mechanisms other than melanocortin receptor blockade. m J Physiol 279:R47-R52, Hagan MM, Rushing P, Pritchard LM, Schwartz MW, Strack M, Van der Ploeg HT, Woods SC, Seeley RJ: Long-term orexigenic effects of grp- (83-132) involve mechanisms other than melanocortin receptor blockade. m J Physiol 279:R47-R52, Kotz CM, Grace MK, riggs J, Levine S, illington CJ: Effects of opioid antagonists naloxone and naltrexone on neuropeptide Y-induced feeding and brown fat thermogenesis in the rat. Neural site of action. J Clin Invest 96: , Tabarin, Diz-Chaves Y, Carmona Mdel C, Catargi, Zorrilla EP, Roberts J, Coscina DV, Rousset S, Redonnet, Parker GC, Inoue K, Ricquier D, Pénicaud L, Kieffer L, Koob GF: Resistance to diet-induced obesity in mu-opioid receptor-deficient mice: evidence for a "thrifty gene". Diabetes 54(12): , Schusdziarra V, Zimmermann JP, Schick RR: Importance of orexigenic counter-regulation for multiple targeted feeding inhibition. Obes Res 12: , MaLaughlin CL, aile C: Feeding behavior responses of Zucker rats to naloxone. Physiol ehav 32: , Jarosz P, Metzger L: The effect of opioid antagonism on food intake behavior and body weight in a biobehavioral model of obese binge eating. iol Res Nurs 3: ,

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Æ¯ÇãÃ» '' - 1 - - 2 - - 3 - - 4 - - 5 - ' - 6 - - 7 - - 8 - - 9 - - 10 - - 11 - Super-Bio Co., Ltd. KWON, Suk-Tae Thermostable DNA Polymerase-encoding Gene from Thermus sp. X-1 an d Amino Acid Sequence