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용환 대
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1 동의생리병리학회지제 22 권 5 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(5): , 2008 壯元丸加減方煎湯液이 APP 로유도된형질전환초파리에서의항치매효과 한원주 김상태 1 이충식 박보라 정은영 김대현 윤종현 김진우 강형원 류영수 김태헌 * 원광대학교한의과대학신경정신과학교실, 1 : 이화여자대학교생명ㆍ약학부뇌신경연구실 Antidementia Effect of Jangwonhwangagambang Water Extract in APP-induced Drosophila Model Won Ju Han, Sang Tae Kim 1, Chung Sik Lee, Bo Ra Park, Eun Young Jung, Dae Hyun Kim, Jong Hyun Yun, Jin Woo Kim, Hyung Won Kang, Yeoung Su Lyu, Tae Heon Kim* Deptment Neuropsychiatry, College of Oriental Medicine, Wonkwang University, 1:Divsion of BioScience-Pharmacy, Ewha Womans University Recent studies indicate that the deposition of β-amyloid (Aβ) is associated with the pathogenesis of Alzheimer's disease (AD), but the underlying mechanism is not clear yet. To investigate the effects of Jangwonhwangagambang (JWHG) extract on AD pathogenicity, we have generated transgenic Drosophila model in which GMR-APP-GAL4/UAS-GRIM system was designed to overexpress amyloid precursor protein(app). We examined fly's survival ratio, flight behavior, and morphological patterns of chest and eye. We found that JWHG treatment improved fly's survival ratio by inhibiting apoptosis and flight behavior. APP-GRIM transgenic flies treated with JWHG showed had significantly lower levels of APP deposition in the chest and eye compared to control animals. JWHG treatment further inhibited chest and eye degeneration. These results suggest that JWHG prevents APP-induced neurotoxicity, and thus may be applicable for the development of preventive or therapeutic agents for AD treatment. Key words : drosophila, Alzheimer's disease, dementia, APP, β-amyloid, Jangwonhwangagambang(JWHG) 서론 치매란의식혹은지각능력의변화없이기억및기타지적기능의상실이일어나는임상증후군으로서원인별로는알쯔하이머형치매와혈관성치매가대표적이며 1,2), 이중알쯔하이머형치매 (Alzheimer's disease, 이하 AD) 에서는점진적인뇌위축과신경섬유다발 (neurofibrillary tangles, NFT), 노인성신경반 (senile plaque) 및과립공포화성퇴행화 (granulovacuolar degeneration) 가나타난다 1-4). AD를유발시키는원인으로는여러가설이다양하게제시되고있는데, 그중에서도 amyloid peptide precursor( 이하 APP) 로부터잘려나온 amyloid β protein( 이하 Aβ) 에의해신경세포의 * 교신저자 : 김태헌, 광주시남구주월동 원광대학교광주한방병원 jayou88@wonkwang.ac.kr, Tel : 접수 : 2008/08/11 수정 : 2008/09/28 채택 : 2008/10/06 파괴가일어난다는가설이대표적이다 5-7). 韓醫學에서는치매를呆病 8-10), 癲狂 11), 健忘 12,13) 14), 虛勞등의범주에서다루고있으며, 문헌연구 15-17) 와임상관련연구 18,19) 뿐만아니라 AD에대한많은실험적연구 20-22) 가활발히진행되고있으나치매의원인이 APP, Tau, ApoE4, PS1/2같은유전자의단독내지복합작용에의해발병하기때문에세포에서나형질전환 mice에서이런실험을연구하는데있어서시간과비용, 정확한치매기전을이해하는데단점으로지적되고있다. 그래서인간유전자와 85 % 이상유사하며생활사가짧아서연구하기에유리한장점을가지고있는초파리를 APP로분자생물학적으로조작한형질전환초파리를이용한실험이점차증가하고있는실정이다 23-25). 壯元丸加減方은 東醫寶鑑ㆍ神門 26) 에서 建忘宜服壯元丸 이라하여여러醫家들에의해健忘에활용되던壯元丸處方에서현재사용이금지된朱砂를제거하고, 養心安身補益養血의효과가있어健忘, 失眠, 多夢, 體倦神疲, 痴呆에多用하는靈芝 27) 를첨가한것

2 한원주 김상태 이충식 박보라 정은영 김대현 윤종현 김진우 강형원 류영수 김태헌 으로서임상에서다용하고있는處方이다. 壯元丸에대한실험적연구로는, 김 22) 이 CT-105를처리한 PC-12 세포주에서 APP의발현을관찰하고, Aβ를생쥐뇌의 Hippocampus에주입한 AD 병태모델에서기억력과뇌세포, 뇌조직을실험관찰하여壯元丸이 AD의예방과치료에사용될수있을것이라주장하였다. 그러나본著者는치매연구에자주사용되는세포주나형질전환동물의한계를극복하기위해연구가쉽고단시간에결과를도출하면서저비용으로최대의항치매효과를검증할수있을것으로예상되는 APP형질전환초파리를작제하였으며, 健忘뿐만아니라痴呆에도일정한효과가있을것으로사료되는壯元丸加減方 ( 이하 JWHG) 를본실험에사용하였다. 또한 APP로형질전환된초파리를이용하여생존율, 상승능력, 신체부위의변성정도를상호비교한결과 JWHG에의하여치매유전자로인한신경세포의세포사가억제되는결과를관찰하였기에이에보고하는바이다. 1. 재료 1) 시약및기기 재료및방법 실험에사용된시약은 Ethanol (Merck, Germany), anti-rabbit IgG conjugated FITC, anti-alexa Fluor 568 mouse IgG 및 ECL kit는 Amershrm phamacia에서, 2차항체인 FITC, Alexa Fluor 568은 Molecular Probe사에서구입하였고, anti-akt, anti-β-tubulin antibodies은 Cell Signaling에서구입하였고, 그외시약은모두특급및일반시약을사용하였다. 본실험에사용된기기는 BOD incubator (VS-9108 MS, vision scientific Co.), light microscope (Olympus), confocal immunofluorescence microscope (Olympus), Scanning Electron Microscope (FESEM/EDS, JEOL JSM-6300 F/ LINKeXL) 등을사용하였다. 2) 약재 본실험에사용한 JWHG는 東醫寶鑑ㆍ神門 26) 에수록된壯元丸에朱砂를제거하고靈芝를첨가한처방이며, 약재는원광대학교부속광주한방병원에서구입한후엄선하여사용하였다. 처방의내용과 1 貼분량은다음과같다 (Table 1). Table 1. Prescription of JWHG 韓藥名生藥名用量 (g) 遠志薑製 Polygalae Radix 12 龍眼肉 Arillus Longan 12 生地黃酒洗 Rehmanniae Rhizoma Radix 12 玄蔘 Radix Scrophulariae 12 石菖蒲 Rhizoma Acori Graminei 12 人蔘 Ginseng Radix 8 白茯神 Poria 8 當歸酒洗 Radix Angelicae Gigantis 8 酸棗仁炒 Semen Zizyphi Spinosae 8 麥門冬 Radix Ophiopogonis 8 栢子仁去油 Semen Biotae 8 靈芝 Ganoderma Lucidum Karsten 8 Total Amount 116 3) 시료의조제 JWHG 1 Kg을엄선하여세말한다음 10,000 ml의 3차증류수를첨가하여 85 에서 12시간열탕을가한다음식혀서동결건조한 JWHG 150 g을획득하였고사용전 -80 에보관한후실험에사용하였다. JWHG에함유된단방들은각각 200 g을 JWHG 추출법처럼수행하여동결건조물 50 g을회수하였다. 2. 방법 1) 초파리형질전환초파리의유전자는인간의유전자와 85 % 이상동질성이알려져있는바생체내에서많은유전자의관여로치매가유발되는것이보고되어있지만 23-25,28) 한개의유전자에의해발병되거나여러유전자의동원에의해발생되더라도결국은 APP에의해생성되는 Aβ의생성으로인해치매가유도되는것은동일하므로결국은 APP로부터작제된초파리가모태가되는것이기본이므로형질전환초파리의치매모델작제는야생형으로서눈의시신경세포에잘발현되도록 glass multiple reporter (GMR) promoter element인 GMR-GAL4 29) 와초파리에서세포사멸에관여하는유전자로 reaper (rpr), head involution defective (hid), grim이있는데 (Fig. 1) 28), 물론이유전자가발현되기위해서는특정부위에서작동하게하는 GAL4 드라이버가존재해야만한다. 특히본연구에는 grim이삽입된 UAS-grim 초파리를 Bloomington Drosophila Stock Center에서분양받아교배시켰는데 30) 특정 GAL4 driver가작동되지않으면 UAS-grim은전사수준에서발현되지않으므로초파리는죽지않기때문에미리 Fig. 1에서처럼 GMR-APP-GAL4를작제한다음 UAS-grim으로교배시킨초파리 31) 는유전적으로잘발현되도록작제하여최종적으로 PCR(polymerase chain reaction) 로 APP가존재하는지 genetyping으로확인하였다. 일반적으로 GAL4-UAS 시스템이라는것은 GMR-GAL4 DRIVER에의해눈의곁막에존재하는시신경세포에서발현되도록하는것이다. 따라서본연구자가작제시킨 GMR-APP-GAL4와 UAS-GRIM에의해결막과시신경, 뇌영역에발현되도록교차교배시키면눈의시신경과주변의뇌신경에 GMR-APP-GAL4가전사되어 UAS-GRIM에결합하면초파리의시신경계장애, 세포사멸의유도와수명단축이유도되는데초파리의상태를형광현미경하에서확인하기위해살아있는초파리의경우 UAS-mito-GFP를발현하므로이초파리를앞서언급한 GMR-APP-GAL4 fly와교차교배시켜작제하면서서히세포사멸로유도하므로 UAS-mito-GFP의발현이억제되어형광현미경하에서녹색형광의강도가감소하는정도를측정할수있고결국치매단백질인 APP의독성에의해초파리의운명이결정되는치매병태모델용초파리로생체모방형치매초파리를작제하여약물탐색을검증할수있다고볼수있다. 따라서 GMR-APP-GAL4/UAS-GRIM/mito-GFP 형질전환초파리에서본 JWHG 처리군과그의구성약재를대상으로항치매약물을검정하였다

M G M R A P P - G M R A P P G M R : G M R - G A L 4 B a m H 1

3 壯元丸加減方煎湯液이 APP로유도된형질전환초파리에서의항치매효과 1 ) G A L 4 - U A S s y s t e m 원리 ( d r o s o p h ila 내 ) (m a le ) (fe m a le ) 2 ) G M R - A P P 작제 a ) b ) G A L 4 G M R - G a l4 U A S - G R I M 특정부위작동 d r iv e r G M R - A P P - G A L 4 G M R - A P P - G A L 4 U A S - G r im 3, ( M a r c h ) G R I M G R I M JW H G G M R - A P P - G A L 4 G R I M c ) G M R - A P P - G A L 4 U A S - G r im M G M R A P P - G M R A P P G M R : G M R - G A L 4 B a m H 1 - A P P - H in d I I I ( p G A D - g a l4 e n c o d e d ) Fig. 1. Principle of UAS-GAL4 system, vector and APP of reverse transcriptase-pcr using APP RNA-specific primers are shown after electrophoresis on a 1%, w/v, agarose gel and stained with ethidium bromide. Lane 1, 1Kb ladder size marker, with base pairs as indicated at the left. Lanes 2, GMR-GAL4, Lanes 3, GMR-APP-GAL4, Lanes 4, APP. 2) 약재투여바이알밑바닥에여과지를적당량잘라서넣고여기에초파리 20마리를넣고각각 5 % sucrose에 JWHG와 Table 1에서처럼그의구성약재를 3차증류수로최종농도가 50 μg /ml 농도로희석하여넣고초파리생존율의경우 20일간, 비행능력은 30일간배양하면서초파리가한번씩바닥에내려와서 sucrose를빨아먹으면서약물을같이먹도록하였다. 3) 초파리의행동학적분석초파리의비행능력은 3-day-old females을대상으로 18-cm-long vials에서수행하였다. APP 형질전환군과 JWHG 전탕액을 50 μg /ml 농도로처리한군, 정상군을체공능력의증감을조사하기위해실온에서 1시간동안환경에적응시킨다음초파리가완전히바닥에앉아있는시점을기준으로실시하였고 climbing index(n) 는시작부위에서 15-cm 말단부위까지 5번이상도달하는것을기준으로 5번의반복실험을수행하였다. Flight assay는 3-day-old females을대상으로 Pesah방법을적용하여수행하였다 32) (n > 25). 4) 초파리눈과흉부의형태학적분석 3-day-old females 초파리에서 APP로형질전환시킨다음정상군, APP 형질전환군, 그리고 APP 형질전환군에 JWHG의전탕액을 50 μg /ml농도로처리한군으로구별하여사육한초파 리눈과흉부의형태학적변화를관찰하였는데초파리를탈수하기전에우선 70 % 에탄올에하루정도담가서고정한다음순차적으로에탄올을높여서탈수과정을거친후 SEM 커팅 Unit E5100 (Polaron Equipmen) 으로 40 nm 두께로금코팅하여주사전자현미경하 (Scanning Electron Microscope) 에서관찰하였다. 5) Whole body 염색초파리의 Whole-body염색은중요하며 Whitworth방법 33) 을적용하였는데, 이는초파리의 head를 4 % paraformaldehyde 와 0.2 % Triton X-100이있는고정액으로하룻밤고정한다음 PBT(PBS containing 0.2 % Triton X-100) 로세번세척하고 blocking buffer(pbs, 5 % heat-inactivated normal goat serum, 0.2 % Triton X-100) 로실온에서 1시간동안 block 시킨다. Neuron은 confocal images로영상화하고 InStat 3 (GraphPad, San Diego, CA) 로분석하였다. 6) 공초첨형광현미경측정약물무처리군, APP 형질전환군, 그리고 APP에 JWHG와구성약재각각의전탕액을각각 50 μg /ml 농도로처리한군으로구별하여사육한후초파리의 head를취하기위해 CO 2 로마취한다음 4 % paraformaldehyde 와 0.2 % Triton X-100이있는고정액으로하룻밤고정한다음 PBT (PBS containing 0.2 % Triton X-100) 로세번세척한다. 이를 paraffin으로고정한다음

한원주 김상태 이충식 박보라 정은영 김대현 윤종현 김진우 강형원 류영수 김태헌 microtome (Leica, Japon) 으로 25 μm정도의두께로절단한다음이를시료로해서탈파라핀화시키기위해 xylen이들어있는비이커에담근다음탈수과정을통해 blocking buffer (PBS, 5 % heat-inactivated normal goat serum, 0.

1시간동안 block 시킨다음 eye disc는 poly(l-lysine)-coated coverslips에올려놓고현미경관찰을수행하였다. 모든시료는 confocal microscopy와 fluorescence streo-microscopy에서수행하였다. 7) 통계처리초파리의상승능력과비행횟수를측정한값은평균 ± 표준편차 (mean ± S.D.

4 한원주 김상태 이충식 박보라 정은영 김대현 윤종현 김진우 강형원 류영수 김태헌 microtome (Leica, Japon) 으로 25 μm정도의두께로절단한다음이를시료로해서탈파라핀화시키기위해 xylen이들어있는비이커에담근다음탈수과정을통해 blocking buffer (PBS, 5 % heat-inactivated normal goat serum, 0.2 % Triton X-100) 로실온에서 1시간동안 block 시킨다. eye disc 염색은 eye disc가있는 whole fly brains을 microscope 하에서수행하고 4 % paraformaldehyde에서 30분간고정하였다. 1시간동안 block 시킨다음 eye disc는 poly(l-lysine)-coated coverslips에올려놓고현미경관찰을수행하였다. 모든시료는 confocal microscopy와 fluorescence streo-microscopy에서수행하였다. 7) 통계처리초파리의상승능력과비행횟수를측정한값은평균 ± 표준편차 (mean ± S.D.) 로표시하였고, 통계학적분석은 Window용 SPSS12.0(USA) 를이용하였다. 각군간의유의성검정은 Students t-test를사용하였으며, 유의수준은신뢰구간 p<0.05와 p<0.005에서유의한것으로의미를부여하였다. 형초파리를 APP-grim 형질전환유도시 APP에의해 ROS( 활성산소종 ) 가발생되어신경사멸과미토콘드리아의장애로인해운동장애가나타나비행능력이소실및상실된다. 일정높이에서정상군은체공시간이길고 APP 형질전환초파리군은짧은데 APP 형질전환초파리군에서 JWHG의효과에대한체공시간을조사하기위해초파리의상승능력을 3-day-old females를대상으로 18-cm-long vials에서수행하였다. 실온에서 1시간동안환경에적응시킨다음초파리가완전히바닥에앉아있는시점을기준으로실시하였고 climbing time은시작부위에서 15-cm 말단부위까지 5번이상도달하는것을기준으로하고 5번의반복실험을수행하였다. 그결과비행정도가최초 3일에서정상군을 100 % 로환산하였을때, 대조군의경우약 11±1 % 인데반해 JWHG 처리군은 91±1 % 로유의성있게증가하였고 (p<0.05), 30 일이경과한후에는대조군의경우약 4±0.5 % 인데반해 JWHG 처리군은 90±5 % 로 3일경과시와큰변화를보이지않았다 (p<0.005)(fig. 3). 성 적 1. 초파리의생존율에미치는영향 APP-grim으로형질전환된초파리의경우세포사멸에의해신경계가퇴행되고개체의생존에치명적인손상을입게된다. 야생주초파리정상군과, APP 형질전환초파리대조군, 그리고 JWHG 처리군과그의구성약재의전탕액을 50 μg /ml 로처리하여생존율을 20일간관찰한결과정상군은 19.33±0.57 마리로나타났고, 대조군은 1.33±0.57 마리였으며玄蔘과酸棗仁은 4.6±0.57, 3.33±0.57 마리로생존율이미약하였고, JWHG, 石菖蒲, 靈芝, 人蔘의경우에는약 17.66±0.57, 10.66±0.57, 12±1, 12.33±1.52 마리였다. 특히 JWHG가 p<0.05 범위내에서유의성있게 APP 형질전환초파리에대한억제효과로인해개체생존율을증가시켰다 (Fig. 2). Ratio of fly survival (numbers) Normal * APP JWHG ** * * * APP ** 현삼석창포영지인삼산조인 Fig. 2. Increased median life span of APP inhibitor-treated flies. *, p<0.05 when compared with APP controls. **, p<0.005 when compared with relative JWHG group. 2. 초파리의상승능력에미치는영향 초파리는일반적으로상승하는주지성을가지고있어야생 Fig. 3. The percentage of climbers is reduced by APP induction. *, p<0.05 when compared with APP-grim controls for 3 days. **, p<0.005 when compared with APP-grim controls for 30 days. 3. 흉부조직에미치는영향 신경세포의사멸이진행됨에따라흉부에존재하는신경세포의 Notch 신호에도영향을미치며이에따라흉부의털의구조변화가표현형으로나타난다. 따라서털의구조변화를현미경으로관찰한결과야생형은흉부의털발생이일정한패턴을나타낸반면 (Fig. 4A, 4D), APP-grim으로형질전환유도된경우흉부에존재하는털이소실되었다 (Fig. 4B, 4E). 이에비해 JWHG로처리한경우야생형에가까운표현형을나타내었다 (Fig. 4C, 4F). Fig. 4. Functional interactions between APP and JWHG. (A-C) magnification x25 and (D-F) magnification x4000. (Scale bar, 25 μm ) 4. 초파리눈의형태학적관찰

壯元丸加減方煎湯液이 APP로유도된형질전환초파리에서의항치매효과 APP가신경세포의 Notch 신호에미치는영향으로인해눈의발생이나형태에도변화를초래하는데이를확인하기위해초파리의신경세포와시신경이있는눈에서형태학적관찰을하였다. 초파리의경우눈에존재하는신경은표현형으로나타나므로현미경으로관찰한결과야생형은눈의발생이일정한패턴을나타낸반면 (Fig.

도하는 GMR-APP-GAL4 driver를작동시켜 UAS-GRIM 형질전환초파리의시신경의생존에관련한 AKT(PKB) 의발현양상을관찰한결과, 야생형은낱눈구조 (ommatidia) 가규칙적으로존재하여 AKT발현이일정한데반해 (Fig. 7A) APP-grim 형질전환군은시신경세포의사멸로인해 AKT의발현이감소하는것은결국낱눈구조가붕괴된상태라사료되고 (Fig.

7E), JWHG 처리군은 tubulin의발현정도가증가하는형태적변화를보여주었다 (Fig. 7F). Fig. 5. Inhibition of eye degeneration by the JWHG. Magnification, x80. Scale bar, 100 μm 5.

6B, 6E), JWHG 처리군의경우에는세포사멸정도가감소하는형태학적변화와함께 GFP형광이감소하는경향을나타내었다 (Fig. 6C, 6F). 또한초파리전체몸통에서의발현양상은야생형은거의전무한반면 (Fig. 6D), APP-grim의경우머리와흉부에서발현이주로유도되었고 (Fig. 6B, 6E) JWHG 처리군의경우두부위모두소실된경향을보였다 (Fig. 6C, 6F). Fig.

5 壯元丸加減方煎湯液이 APP로유도된형질전환초파리에서의항치매효과 APP가신경세포의 Notch 신호에미치는영향으로인해눈의발생이나형태에도변화를초래하는데이를확인하기위해초파리의신경세포와시신경이있는눈에서형태학적관찰을하였다. 초파리의경우눈에존재하는신경은표현형으로나타나므로현미경으로관찰한결과야생형은눈의발생이일정한패턴을나타낸반면 (Fig. 5A), APP-grim으로유도된경우눈의구조가붕괴되어조직의형태가유실된상태로존재하는것이관찰되었다 (Fig. 5B). 이에비해 JWHG로처리한경우야생형에가까운표현형을나타내었다 (Fig. 5C). 도하는 GMR-APP-GAL4 driver를작동시켜 UAS-GRIM 형질전환초파리의시신경의생존에관련한 AKT(PKB) 의발현양상을관찰한결과, 야생형은낱눈구조 (ommatidia) 가규칙적으로존재하여 AKT발현이일정한데반해 (Fig. 7A) APP-grim 형질전환군은시신경세포의사멸로인해 AKT의발현이감소하는것은결국낱눈구조가붕괴된상태라사료되고 (Fig. 7B), JWHG 처리군은구조가정상군과유사한경향을보이는것이 (Fig. 7C) confocal 현미경으로관찰되었다. 또한시신경에존재하는 Neuron의표지자인 tubuline( 녹색형광 ) 발현양상을확인한결과는야생형이강하게발현되는데비해 (Fig. 7D) APP-grim 형질전환군은신경세포의사멸로인해 tubulin의발현이감소하는경향을보여주었고 (Fig. 7E), JWHG 처리군은 tubulin의발현정도가증가하는형태적변화를보여주었다 (Fig. 7F). Fig. 5. Inhibition of eye degeneration by the JWHG. Magnification, x80. Scale bar, 100 μm 5. 눈과몸통에서 APP-grim/GFP 단백질발현에미치는영향 APP가신경세포의 Notch 신호에미치는영향으로인해발현부위에대한양상을확인한결과시신경이있는눈에서의형태학적변화로는야생형인경우아무런변화를보이지않는반면 (Fig. 6A, 6D), APP발현초파리의경우눈에존재하는시신경의세포사멸을나타내는곳에주로 GFP가발현되었고 (Fig. 6B, 6E), JWHG 처리군의경우에는세포사멸정도가감소하는형태학적변화와함께 GFP형광이감소하는경향을나타내었다 (Fig. 6C, 6F). 또한초파리전체몸통에서의발현양상은야생형은거의전무한반면 (Fig. 6D), APP-grim의경우머리와흉부에서발현이주로유도되었고 (Fig. 6B, 6E) JWHG 처리군의경우두부위모두소실된경향을보였다 (Fig. 6C, 6F). Fig. 7. Inhibition of dapp induces regeneration of ommatidia and retinal neurons in Drosophila. Magnification x25 and x40. Microscopic images of AKT staining (A-C) as well as phalloidin staining (nuclei : red) and Alexa Fluor 488 (tubulin : green) of 44 h retina dissected from flies expressing GMR-GAL4 driver alone (A, D), APP-GRIM/GMR-GAL4 (B, E), and APP-GRIM/GMR-GAL4 with JWHG (C, F). Note that APP induces cellular disorganization (E, F) and loss of neurons (E; white arrows). (Scale bar, 10 μm ) 7. APP-grim/GMR에의해광수용체에미치는영향 APP를신경세포의 Notch 신호에관련해서신경세포에특이적으로유도했을때 GMR-GAL4 driver로작동시킨광수용체에있는시신경의붕괴유무양상도다를것으로예상되어전자현미경하에서관찰한결과야생형은정상적으로광수용체의형태가잘유지된반면 (Fig. 8A, 8D), APP-grim 형질전환군은광수용체신경세포의사멸로인해구조가붕괴된양상을보이고있고 (Fig. 8B, 8E), JWHG 처리군의경우광수용체가정상과유사하게형태가유지되었음을알수있었다 (Fig. 8C, 8F). Fig. 6. Functional interactions between APP and JWHG in head and body. Arrow indicates the expression of UAS-mito GFP in head and body. Fluorescence micrographs of the adult female head were shown at the same magnification (x25). (A) WT. (B) UAS-APP/grim-GAL4/ GMR-GAL4, (C) UAS-APP/grim-GAL4/GMR-GAL4 with JWHG. (D-F) Fluorescence micrographs of the adult female body were shown at the same magnification (x5). (D) WT. (E) UAS-APP/grim-GAL4. (F) UAS-APP/grim-GAL4 with JWHG. (Scale bar, 20 μm ) 6. APP-grim/GMR에의해시신경세포의생존에미치는영향 APP가신경세포의 Notch 신호에관련해서시신경세포의생존에관여하는 AKT 발현양상을알아보기위해특이적으로유 Fig. 8. Reduction in drosophila APP expression by JWHG treatment regulates drosophila AKT and the external eye pattern. Magnifications: A-C, x1000; D-F, x4,000. (Scale bar, 50 μm )

6 한원주 김상태 이충식 박보라 정은영 김대현 윤종현 김진우 강형원 류영수 김태헌 고 찰 치매는뇌의노화나퇴행성질환과관련되어있는데뇌의퇴행성질환으로는대뇌피질에침범하여정신활동장애를수반하는노인성치매 (Alzheimer's disease, AD), 피크병등과기저부신경절을침범하여운동신경계에장애를발생시키는헌팅턴병, 파킨슨병등이있다 34,35). 이중 AD는여러가지원인질환에의해야기되는지능저하를특징으로하는증후군으로, 대개만성적으로진행하여기억력, 사고력, 지남력, 이해력, 계산능력, 학습능력, 언어및판단력등을포함하는고도의대뇌기능의장애를나타내며, 일상생활의영위에서도심각한장애를초래한다 1,2). 韓醫學에서痴呆에대한최초의기록은明代張 36) 의 景岳全書雜病模, 癲狂痴獃篇 에痴獃란病名으로처음언급되었으며, 以後, 呆病 8-10), 癲狂 11), 健忘 12,13), 虛勞 14) 등의範疇에서다루어졌는데, 錢 8) 9) 은呆病의病因病機와症狀에관하여, 淸代의陳 은呆의症狀과함께治痰의중요성을, 黃 37) 등은呆病의증상과함께일상생활에서의위험성을설명하였다. 痴呆의主된原因으로錢 8) 은肝氣鬱結과胃氣衰退로胸中의痰이鬱滯되어痴呆가發한다고하였으며, 陳 9) 은痰으로보았고, 黃 37) 등은肝腎不足을老年痴呆의主要한病因으로보았다. 최근한의학계에서는치매에대한실험연구가활발히진행되고있는데박 20) 은聰明湯과木槿皮聰明湯의 AD에대한유용성을, 염 21) 은健腦湯이 AD에유용하게쓰일수있다는가능성을예시하였다. 한편壯元丸에대한실험적연구로는, 김 22) 이 CT-105와 ril-1β를처리한 PC-12 세포주에서壯元丸이 APP, AChE(acetylcholinesterase), GFAP(flial fibrillary acidic protein) 유전자발현을억제함을밝혔으며, AD를유도한생쥐모델에서허혈로인한뇌조직손상을억제함을관찰한바壯元丸이 AD의예방과치료에사용될수있을것이라주장하였다. AD를유발시키는원인으로는신경반구조의주된구성성분이며 APP로부터잘려나온 Aβ의축적에의해신경세포의파괴가일어난다는가설이대표적이며, 그외에도 presenilin(ps), estrogen, apolipoprotein E, oxidants(free radicals), 염증, 사고에의한손상, 신경전달물질, 신경영위인자등의많은유발인자가관여한다 5-7). 최근에는 APP의일부인 C말단단백질 (carboxyl-terminal fragment protein) 이 Aβ보다더독성이있다고알려져 Aβ와 C말단단백질의독성기전에대한연구가활발히진행되고있다 38). 壯元丸은龔延賢이著術한 萬病回春 12) 에서 專補心生血寗神定志淸火化痰臺閣勤政勞心幷健忘怔忡不寐及不善記而多忘者服之能日誦千言 이라처음으로언급한처방으로, 東醫寶鑑 26) 에서는 建忘宜服壯元丸, 補心生血寧神定志且臺閣勤政勞心燈窓讀書辛苦幷健忘怔忡不寐及不善記而多忘者服之能日誦千言胸藏萬卷 이라하여이후醫家들에의해활용되어왔으며養血安神理脾하는方으로心血不足氣鬱生痰, 脾氣不舒에활용하는處方이다. 處方의구성은石菖蒲遠志酸棗仁는開竅安神하는작용을하며, 麥門冬은補心淸熱하고, 白茯神栢子仁은寧心安神하고, 生地黃玄蔘은養陰生津止渴, 龍眼肉當歸는補血和血하며, 人蔘은補脾益氣生津寧神益智한다. 壯元丸에는이러한효능이있으므로신경세포에서의효능을알아보기위해壯元丸處方에서황화수은이다량함유되어수은중독의우려가있어사용이금지된朱砂를제거하고, 養心安身작용과補益으로强壯시키는효과가있어心脾兩虛氣血不足으로인한心悸, 健忘, 失眠, 多夢, 體倦神疲등의병증에응용하며肝腎不足, 痰濕, 虛寒등의병증에도비교적양호한효과가있어痴呆에多用하는靈芝 27) 를첨가한壯元丸加減方을본실험에사용하였다. 실험방법으로는유전적으로 APP로형질전환된초파리모델을이용하여 JWHG와구성약재들로처리한후초파리의생존율을확인하였으며, 상승능력을측정한결과를 Students' t-test 를사용하여신뢰구간 p<0.05와 p<0.005 에서유의한것으로하였다. 그리고 APP로형질전환된초파리에서정상군, APP 형질전환군그리고 APP 형질전환군에 JWHG의전탕액을 50 μg /ml 농도로처리한군으로구별하여흉부와눈을형태학적으로관찰하였고, 눈과몸통에서신경세포의사멸에의한 GFP 단백질발현부위를관찰하였다. 또한시신경에존재하는신경세포에서낱눈의구조와 Neuron의표지자인 tubuline의발현양상을관찰하였으며, GMR-APP 형질전환초파리에서 APP-grim 형질전환군과 JWHG 처리군의광수용체의형태에미치는영향을관찰하였다. 초파리를 APP로형질전환하기위해서는 Hid, Grim, Reaper, Sickle, Jafrac 이라는 IAP(Immunosuppressive Acidic Protein) 로세포사를유도해야하는데그중에서 Grim이관여된 APP-grim으로야생초파리를형질전환시키게되면신경세포의사멸이유도되어신경계가퇴행됨으로써개체의생존에치명적인손상을입게되는데, 정상군과, APP 형질전환군, 그리고 JWHG 처리군과그의구성약재의전탕액을 50 μg /ml 로처리하여 20일간초파리의생존율을관찰한결과 JWHG를처리한군은 p<0.05 범위내에서처리하지않은군에비해서유의한생존율을나타내어 APP 형질전환으로인한신경사멸을억제하는효과를확인할수있었다 (Fig. 2). 야생형초파리를 APP-grim으로형질전환하게되면신경세포의사멸과미토콘드리아의장애로운동장애가나타나게됨으로써비행능력이상실되는데초파리의비행상승능력을측정함으로써 JWHG의효과를측정하였다. 그결과 JWHG 처리군은운동장애를유의하게억제함을알수있었다 (Fig. 3). 초파리의신경세포가사멸되면흉부에존재하는신경세포의 Notch 신호에도영향을미치어이로인해흉부의털의구조변화가표현형으로나타난다. Notch는구조및전달과정이거의모든생물에서유사하며분화를억제하고그세포의운명을결정하는데중요한역할을하게된다. APP로형질전환된초파리군에서는현미경으로관찰한결과흉부에존재했던털이소실되어세포사멸이이루어졌음을확인할수있었고, 반면 JWHG로처리한초파리군의경우는정상야생초파리와거의같이일정한형태를나타내어 JWHG가신경세포사멸을억제함을확인할수있었다 (Fig. 4)

7 壯元丸加減方煎湯液이 APP로유도된형질전환초파리에서의항치매효과 이와비슷한결과도초파리의눈에서확인할수있었는데초파리의경우눈에존재하는신경은표현형으로나타나므로현미경으로관찰한결과야생형은눈의발생이일정한패턴을나타낸반면, APP-grim으로유도된경우눈의구조가붕괴되어조직의형태가유실또는파괴된상태로존재하는것이관찰되었다. 이것은 APP가 Notch의세포사멸을유도한결과로나타남을알수있다. 이에비해 JWHG로처리한경우야생형에가까운표현형을나타내어 JWHG가 APP의신경세포의사멸을억제함을알수있었다 (Fig. 5). APP로형질전환된초파리에서자외선을받으면녹색의형광을띄는성질이있는 GFP(Green Fluorescent Protein) 라는녹색형광단백질을이용하여 GFP의발현정도를 JWHG 처리군과비교하기위한실험도시행하였는데 JWHG가 APP-GFP발현을억제하는경향을보이는것은신경사멸을억제하는결과로사료된다 (Fig. 6). 낱눈구조 (ommatidia) 에있어서야생형은규칙적으로존재하는데반해 APP-grim 형질전환군은구조가붕괴된상태였고, JWHG 처리군은구조가정상군과유사한경향을보이는것이관찰되었다. 그리고시신경에존재하는 Neuron의표지자인 tubuline의발현양상을관찰한결과는야생형이강하게발현되는데비해 APP-grim 형질전환군은신경세포의사멸로 tubulin의발현이감소하는경향을보여주었고, JWHG 처리군은 tubulin발현정도가증가하는변화를보여주었다 (Fig. 7). 또한광수용체의형태학적변화도이러한변화들과유사하여 APP-grim 형질전환군은광수용체신경세포의사멸로인해구조가붕괴된양상을보이고, JWHG 처리군의경우광수용체가정상과유사한결과를나타내는경향을보이므로 JWHG가 APP 의신경세포사멸을억제하여광수용체의구조를정상적으로복귀시키는경향을유도하였다고사료된다 (Fig. 8). 이상으로 APP로형질전환된초파리를이용하여만든신경손상모델에서 JWHG를이용하여형질전환된초파리의생존율, 상승능력, 흉부조직에미치는영향, 눈의형태학적인변화, 눈ㆍ시신경ㆍ몸통에서 GFP 형광의발현양상, 시신경ㆍ광수용체에서의형태적변화를살펴본결과 JWHG가신경세포사멸을억제하는효능이있음을관찰할수있었고, 임상에서의응용뿐만아니라향후다른약재및처방과의비교실험을통해치매에효과적인약물의개발이뒤따라야할것이다. 결론 APP로형질전환된초파리에서壯元丸加減方전탕액을이용하여신경세포의세포사유도에대한억제와신경세포보호효과를관찰한결과다음과같은결론을얻었다. 壯元丸加減方은 APP로형질전환된초파리에서유의성있게생존율을높였다. 壯元丸加減方은 APP로형질전환된초파리에서신경계손상에의한상승능력을유의성있게억제하였다. 壯元丸加減方은 APP발현에의한흉부와눈의변성정도를억제하였다. 壯元丸加減方은눈과몸통, 뇌신경에서신경세포손상에 의한형광발현을억제하였다. 이상의연구결과를종합하여보면壯元丸加減方은 APP로유도된초파리에서신경세포의세포사를억제하고신경세포를보호하므로, 뇌세포의사멸에의한알쯔하이머치매를포함한다양한퇴행성뇌질환에대해서도임상적응용이가능할것으로사료되므로향후이에대한지속적인연구가이루어져야할것이다. 감사의글 이논문은 2007 년도원광대학교의교비지원에의해서수행됨 참고문헌 1. 대한한방신경정신과학회. 한방신경정신의학. 서울, 집문당, pp , 아담스신경과학편찬위원회. 신경과학. 서울, 정담, pp , 대한신경정신의학회. 신경정신의학 2판. 서울, 중앙문화사, pp , Hurtig, H.I., Trojanowski, J.Q., Galvin, J., Ewbank, D., Schmidt, M.L., Lee, V.M., Clark, C.M., Glosser, G., Stern, M.B., Gollomp, S.M., Arnold, S.E. α-synuclein cortical Lewy bodies correlate with dementia in Parkinson's disease. Neurology. 54: , Nilsberth, C., Westlind-Danielsson, A., Eckman, C.B., Condron, M.M., Axelman, K., Forsell, C., Stenh, C., Luthman, J., Teplow, D.B., Younkin, S.G., Naslund, J., Lannfelt, L. The 'Arctic' APP mutation (E693G) causes Alzheimer's disease by enhanced Abeta protofibril formation. Nat Neurosci. 4(9): , Wiltfang, J., Esselmann, H., Cupers, P., Neumann, M., Kretzschmar, H., Beyermann, M., Schleuder, D., Jahn, H., Ruther, E., Kornhuber, J., Annaert, W., De Strooper, B., Saftig, P. Elevation of Abeta peptide 2-42 in sporadic and familial Alzheimer's disease and its generation in PS1 knockout cells. J Biol Chem. 16: 276m(46): Mann, D.M., Takeuchi, A., Sato, S., Cairns, N.J., Lantos, P.L., Rossor, M.N., Haltia, M., Kalimo, H., Iwatsubo, T. Cases of Alzheimer's disease due to deletion of exon 9 of the presenilin-1 gene show an unusual but characteristic beta-amyloid pathology known as 'cotton wool' plaques. Neuropathol Appl Neurobiol. 27(3): , 錢鏡湖. 辨證奇聞全書. 서울, 甘地出版社, pp , 陣士鐸. 國譯石室秘錄. 서울, 書苑堂, p 102, 陳士鐸. 辨證錄. 서울, 醫聖堂, pp , 李梴. 編註醫學入門卷二. 서울, 大星文化社, pp , 龔廷賢. 增補萬病回春. 서울, 一中社, pp , 李中梓. 醫宗必讀. 서울, 一中社, pp ,

8 한원주 김상태 이충식 박보라 정은영 김대현 윤종현 김진우 강형원 류영수 김태헌 14. 孫思邈. 備急千急要方. 卷四十. 서울, 杏林出版社, pp 12-13, 서부일, 이정훈, 우주영. 노인성치매의중의임상진단 치료에대한고찰. 제한동의학술원논문집, 4(1): , 김이화, 남상수외. 치매치료의최근연구동향의관한고찰. 대한침구학회지 14(2): , 최용덕, 이광규, 강순원, 유영수. 치매의병리에대한동 서의학적고찰. 대한동의병리학회지 13(1):36-46, 이창현, 김태헌, 이상룡, 육태한. 치매와관련된뇌영역에투사되는경혈의탐색에관한신경해부학적연구. 대한침구학회지 20(6): , 박우순, 이태영외. 申脈照海의전침자극이치매환자의뇌파에미치는영향. 대한침구화회지 18(2):67-78, 박지운, 정인철, 이상룡. 聰明湯과木槿皮聰明湯이 CT105와 βa로유도된 AD병태모델에미치는영향. 동의신경정신과학회지 17(1):37-57, 염창섭, 김종우, 강철훈, 황의완. 健腦湯과單味들이 Hypoxia-Reoxygenation에의해손상받은 Mouse Neuroblastoma 2A cells에미치는영향. 동의신경정신과학회지 16(2):73-88, 김건진, 정대규. 장원단이 CT105와 βa로유도된 AD병태모델에미치는영향. 동의신경정신과학회지 17(2):91-122, Loewer, A., Soba, P., Beyreuther, K., Paro, R., Merdes, G. Cell-type-specific processing of the amyloid precursor protein by Presenilin during Drosophila development. EMBO Rep. 5(4): , Greeve, I., Kretzschmar, D., Tschäpe, J.A., Beyn, A., Brellinger, C., Schweizer, M., Nitsch, R.M., Reifegerste, R. Age-dependent neurodegeneration and Alzheimer-amyloid plaque formation in transgenic Drosophila. J Neurosci. 24(16): , Guo, M., Hong, E.J., Fernandes, J., Zipursky, S.L., Hay, B.A. A reporter for amyloid precursor protein gamma-secretase activity in Drosophila. Hum Mol Genet. 15: , 許俊. 東醫寶鑑. 서울, 法仁文化社, pp , 신민택. 임상본초학. 서울, 영림사, pp , L. Zhou, A. Schnitzler, J. Agapite, L.M. Schwartz, H. Steller, J.R. Nambu. Cooperative functions of the reaper and head involution defective genes in the programmed cell death of Drosophila central nervous system midlinecells. Proc Natl Acad Sci U S A. 94(10): , Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell 87: , Chen, P., Nordstrom, W., Gish, B., Abrams, J.M. grim a novel cell death gene in Drosophila. Genes Dev. 15: , Garrett, G., Gross, 1.3., R.M. Renny Feldman, Atish Ganguly, Jinhui Wang, Hong Yu and Ming Guo. Role of X11 and ubiquilin as In Vivo Regulators of the Amyloid Precursor Protein in Drosophila. PLoS ONE. 3: e2495, Pesah, Y., Pham, T., Burgess, H., Middlebrooks, B., Verstreken, P., Zhou, Y., Harding, M., Bellen, H., Mardon, G. Drosophila parkin mutants have decreased mass and cell size and increased sensitivity to oxygen radical stress. Development. 131: , Whitworth, A.J., Russell, S. Temporally dynamic response to Wingless directs the sequential elaboration of the proximodistal axis of the Drosophila wing. Dev Biol. 254(2): , Kertesz, A. Frontotemporal dementia, Pick disease and corticobasal degeneration. Arch Neurol. pp , Kertesz, A., Munoz, D. Pick's disease, Frontotempral demetia and Pick complex. Arch Neurol. pp 張介賓. 國譯景岳全書第三冊. 서울, 大星文化社, pp , 黃大東外. 實用中醫內科學. 上海, 上海科學技術出版社, pp , Chang, K.A., Kim, H.S., Ha, Y.T., Ha, J.W., Shin, K.Y., Suh, Y.H. et al. Phosphorylation of APP at Thr668 regulates the nuclear translocation of AICD and induces neurodegeneration. Molecular and celluar biology. 26: ,

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를