등록특허 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) B01D 15/30 ( ) A61K 36/282 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2009 년

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재황 공
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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) B01D 15/30 ( ) A61K 36/282 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2009 년 02 월 26 일 심사청구일자 2009 년 02 월 26 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2010 년 09 월 03 일 (56) 선행기술조사문헌 KR A* Preparative Isolation of Alisol B and Alisol B, Chromatographia 2009, 69, ( online publication)* KR B1 JP A * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2011년11월09일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2011년11월01일 (73) 특허권자 서울대학교산학협력단 서울관악구신림동산 56-1 (72) 발명자 김진웅 서울특별시관악구봉천 7 동산 4-2 교수아파트 122B 동 201 호 윤기동 서울특별시관악구봉천동 1717 관악푸르지오아파트 120 동 1602 호 (74) 대리인 신동인 전체청구항수 : 총 4 항심사관 : 박수진 (54) 쑥속 (Artemisia species) 식물의추출물로부터원심향류분배크로마토그래피를이용한고농도유파티린 (Eupatilin) 및자세오시딘 (Jaceosidine) 을대량으로분리및생산하는방법 (57) 요약 쑥속 (Artemisia species) 식물의추출물로부터원심향류분배크로마토그래피를이용한고농도유파티린 (Eupatilin) 및자세오시딘 (Jaceosidine) 을대량으로분리및생산하는방법에관한것으로서, 상세하게는본발명의쑥속식물의추출물로부터혼화되지않는두상의용매계의분배계수의차이를극대화시킨원심향류분배크로마토그래피 (Centrifugal Partition Chromatography, CPC) 를이용하여안정성, 수득률및경제성이뛰어난고농도유파티린및자세오시딘을대량으로분리및생산하는방법으로유용하게이용할수있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 특허청구의범위청구항 1 쑥, 사자발쑥, 타래쑥 (Artemisia princeps Pampan.), 또는개똥쑥 (Artemisia annua L.) 을추출하여조추출물, 추출분획물또는추출정제물의수득하는제 1단계 ; 상기조추출물, 추출분획물또는추출정제물의용매시스템은헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) 의혼합용매이고, CPC의회전속도가 600 ~ 1000rpm이고, 이동상의용리속도는 1.0 ~ 2.0 ml/min인원심향류분배크로마토그래피 (CPC) 를이용하여단일의유파티린및자세오시딘만을고함유한화합물을대량으로분리하는제 2단계공정을포함하는쑥, 사자발쑥, 타래쑥 (Artemisia princeps Pampan.), 또는개똥쑥 (Artemisia annua L.) 추출물로부터유파티린및자세오시딘을대량으로분리하는분리및생산방법. 청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 제 1항에있어서, 상기조추출물은정제수를포함한물, 탄소수 1 내지 4의저급알코올또는이들의혼합용매에가용한추출물인방법. 청구항 5 제 1항에있어서, 상기추출분획물은제 1항에기재된조추출물을물에현탁하여얻은조추출물현탁액에, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 메틸렌클로라이드또는에틸아세테이트의비극성용매로순차적으로분획하여수득되는비극성용매가용분획물 ; 및상기비극성용매가용부로제거하고남은잔사에탄소수 1 내지 4의극성용매로분획하여수득되는극성용매가용추출분획물을포함하는방법. 청구항 6 제 1항에있어서, 상기추출정제물은상기조추출물, 추출분획물을대상으로보다활성이강한생리활성성분을분리하기위하여수행되는실리카겔컬럼크로마토그래피법, 세파덱스컬럼크로마토그래피법또는이온교환수지컬럼크로마토그래피법의분리정제용컬럼크로마토그래피를통하여수득되는, 제 1항의조추출물, 추출분획물보다정제된형태의추출정제물인방법. 청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 삭제 명세서 발명의상세한설명 - 2 -

3 [0001] 기술분야본발명의쑥속식물의추출물로부터혼화되지않는두상의용매계의분배계수의차이를극대화시킨원심향류분배크로마토그래피 (CPC) 를이용하여안정성, 수득률및경제성이뛰어난고농도유파티린및자세오시딘을대량으로분리및생산하는방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] 배경기술 [ 문헌 1] Kwon et al., Korean J. Medicinal Crop. Sci., 15, pp , 2007 [ 문헌 2] Ryu et al., Korean J. Crop. Sci., 49, pp , 2004 [ 문헌 3] Bae K., The Medicinal Plants of Korea, Kyo-Hak, pp , 2000 [ 문헌 4] Kang et al., Diabetes Res. Clin. Pract., 82, pp.25-32, 2008 [ 문헌 5] Kim et al., Biochem. Pharmacol., 68, pp , 2004 [ 문헌 6] Lee et al., J. Ethnopharmacol., 98, pp , 2005 [ 문헌 7] Lee et al., Int. Immunopharacol., 7, pp , 2007 [ 문헌 8] Kim et al., Arch. Pharm. Res., 31, pp , 2008 발명의내용 [0010] [0011] [0012] [0013] 해결하고자하는과제현재, 질병을치료하는약물이나질병의치료를기대하는물질이동물, 식물, 미생물등으로부터다양하게분리되어있지만, 이러한물질들은구조적으로화학적합성에의해확보하기가어려워물질의기원으로부터분리를통해얻어지고있다. 예를들어항암제로쓰이고있는탁솔의경우전합성의곤란성으로인해탁솔의기원인주목나무로부터직접분리하거나영국산주목나무잎에서탁산유도체 (10-deacetyltaxol, 10-deacetrylbaccation, cephalomannine) 를분리하여반합성을이용하는방법으로생산하고있다. 따라서천연물로부터이러한약리활성을나타내는화합물들을효율적으로분리하기위하여많은연구자들이이들의추출, 분리, 정제과정에관한여러방법들을개발, 보고하고있는실정이다. 일반적으로천연물성분분리는여러종류의고체정지상과액체이동상을이용한칼럼크로마토그래피법을이용하고있다. 최근에많이사용되고있는분취용 HPLC 분리법은여러단계를거쳐야하는오픈칼럼크로마토그래피또는중기압칼럼크로마토그래피 (medium pressure column chromatography) 에비해고분리능과분리시간의단축을장점으로하는분리방법으로보고되고있다. 하지만이방법은한번에분리할수있는양에제한이있고, 장비의가격과고체정지상의주기적인교체의이유로분리양에비해비용이많이들어대량분리 / 생산방식의공업화에어려움이있다. 또한고체정지상을사용할경우고체정지상에대한시료의흡착문제로시료의손실이발생한다. 원심향류분배크로마토그래피 (Centrifugal Partition Chromatography, 이하, CPC 이라함 ) 는액체-액체크로마토그래피 (liquid-liquid chromatography) 의일종으로써, 서로상이나누어지는두액체를고정상과이동상으로하여두상사이에목적성분의분배계수의차이에의하여성분분리가이루어지는원리를가지며, 고정상으로실리카겔과같은고체를사용하지않고순수액체만을사용하므로, 고정상고체를사용시발생하는목적성분의비가역적흡착, 화학적반응이전혀일어나지않기때문에액체-고체크로마토그래피에비하여목적성분의안정성및수득률이뛰어날뿐만아니라, 비싼고체고정상을사용하지않고오직용매만을사용하기때문에경제성이탁월하다는장점이있어천연물의분리및유기합성물의정제법에일부응용되고있으나우리나라에서천연의약품의조성물의제조법에활용한예는없다. 쑥속 (Artemisia spp.) 식물은우리나라전국의산야에분포하는여러해살이풀로국화과 (Compositae) 에속하는다년생초본이고북반구에약 200여종이알려져있으며우리나라에 38종이분포한다고보고되고있으나종의구분은명확하게이루어지지않고있다 (Kwon et al., Korean J. Medicinal Crop. Sci., 15, pp , 2007; Ryu et al., Korean J. Crop. Sci., 49, pp , 2004). 민간에서쑥속식물은약쑥, 애엽, 애자등으로 - 3 -

4 불리우고예로부터식용으로사용되고있으며약용으로는쏙속식물의하나인더위지기 (Artemisia iwayomogi Kitamura) 의전초를인진호 ( 茵蔯蒿 ) 라부르고, 황달, 해열, 진통, 지혈에사용하였으며, 개똥쑥 (Artemisia annua Linne) 은항말라리아효과를가지는아르테미시닌 (artemisinin) 의원료생약으로알려져있다 (Bae K., The Medicinal Plants of Korea, Kyo-Hak, pp , 2000). 또한, 현재동아제약의 스티렌 (STILLEN) 은위점막보호작용을가지는위염치료제로써애엽 95% 에탄올추출물로이루어져있고 1 정중에유파티린이 mg 을함유한다고알려져있으며, 추가로, 최근의보고에따르면쑥속식물의플라보노이드계열화합물인유파티린 (eupatilin) 과자세오시딘 (jaceosidine) 의항위염활성이보고되고있어이두화합물에대한관심이폭발적으로증가되는추세이고, 그밖의유파티린은당뇨를유발한흰쥐의간과혈장글루코스의대사의촉진및인슐린분비증강작용 (Kang et al., Diabetes Res. Clin. Pract., 82, pp.25-32, 2008), 종양증식억제작용 (Kim et al., Biochem. Pharmacol., 68, pp , 2004), 등이알려져있으며, 자세오시딘은항암작용 (Lee et al., J. Ethnopharmacol., 98, pp , 2005), 과민반응억제작용 (Lee et al., Int. Immunopharacol., 7, pp , 2007), 항염증작용 (Kim et al., Arch. Pharm. Res., 31, pp , 2008) 이알려져있으나, 상기문헌의어디에도쑥속식물의추출물로부터원심향류분배크로마토그래피를이용한고농도유파티린및자세오시딘을대량으로분리및생산하는효율적인방법이교시되거나기재된바가없다. [0014] 이에본발명자들은쑥속식물의성분인유파티린과자세오시딘이천연물의약품으로서응용될수있는가능성이높아, 그약리효과를극대화하는한편대량의유파티린및자세오시딘을확보하기위해서는유파티린및자세오시딘을고농도로함유하는조성물제조법및단일성분분리법이필수적이라생각하여, 혼화되지않는두상의용매계의분배계수의차이를극대화시킨원심향류분배크로마토그래피 (Centrifugal Partition Chromatography, CPC) 의장점을살린용매조건및분리방법을이용하여고농도유파티린및자세오시딘을대량으로분리및생산하는방법을개발함으로서, 비용, 시간등의절감효과뿐만아니라, 최종산물의고수율, 고농도및안정성효과등의장점을확인하여본발명을완성하게되었다. [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 과제해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은쑥속식물을추출하여추출물을수득하는제 1단계 ; 상기추출물을원심향류분배크로마토그래피 (CPC) 를이용하여단일의유파티린및자세오시딘만을고함유한화합물을대량으로분리하는제 2단계공정을포함하는쑥속식물추출물로부터유파티린및자세오시딘을대량으로분리하는분리및생산방법을제공한다. 본원에서정의되는 쑥속식물 은쑥, 사자발쑥, 타래쑥 (Artemisia princeps Pampan.), 개똥쑥 (Artemisia annua Linne), 개사철쑥 (Artemisia apiacea HANCE), 비쑥 (Artemisia scoparia), 맑은대쑥 ( 개제비쑥, Artemisia keiskeana), 물쑥 (Artemisia selengensis TURCZ.), 흰쑥 (Artemisia stelleriana Bess), 더위지기 (Artemisia iwayomogi Kitamura), 털산쑥 (Artemisia sacrorum subsp.), 약쑥 (Artemisia asistica Nakai), 산쑥 (Artemisia montana Pampan), 인진쑥 (Artemisia iwayomogi Kitamura), 사철쑥 (Artemisia capillaris Thunb.), 참쑥 (Artemisia lavandulaefolia), 황해쑥 (Artemisia argyi), 또는제비쑥 (Artemisia japonica Thunb.) 등이며, 바람직하게는쑥, 사자발쑥, 타래쑥, 약쑥또는인진쑥을포함한다. 본원에서정의되는 추출물 은조추출물, 추출분획물및추출정제물을포함한다. 본원에서정의되는 조추출물 은정제수를포함한물, 탄소수 1 내지 4의저급알코올또는이들의혼합용매, 바람직하게는물, 에탄올또는에탄올과의혼합용매에가용한추출물, 보다바람직하게는 80 내지 100% 에탄올에가용한추출물을포함한다. 본원에서정의되는 추출분획물 은상기 조추출물 을물에현탁하여얻은조추출물현탁액에, 헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 메틸렌클로라이드또는에틸아세테이트등의비극성용매로순차적으로분획하여수득되는비극성용매가용분획물 ; 및상기비극성용매가용부로제거하고남은잔사에탄소수 1 내지 4의극성용매로분획하여수득되는극성용매가용추출분획물을포함한다. 본원에서정의되는 추출정제물 은상기조추출물, 추출분획물로부터보다활성을강한생리활성성분을분리하기위하여수행되는실리카겔컬럼크로마토그래피법, 세파덱스컬럼크로마토그래피법또는이온교환수지컬럼크로마토그래피법등의당업계에잘알려진일반적인분리정제용컬럼크로마토그래피를통하여수득되는, 상기조추출물, 추출분획물보다정제된형태의추출정제물을포함한다

5 [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] 이하, 본발명을상세히설명한다. 본발명의추출물은건조된쑥을건조중량의약 1 내지 30배부피량, 바람직하게는 5 내지 15배부피량 (w/v%) 의정제수를포함한물, 메탄올, 에탄올, 부탄올등의탄소수 1 내지 4의저급알코올또는이들의혼합용매로부터선택된용매, 바람직하게는물, 에탄올또는에탄올과의혼합용매에가용한추출물, 보다바람직하게는 80 내지 100% 에탄올을가하여, 약 0 내지 100 로, 실온에서 1 내지 20 시간, 바람직하게는 3 내지 15 시간동안냉침추출, 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출, 또는가열추출법등의추출방법으로, 바람직하게는초음파추출법으로약 1 내지 7회, 바람직하게는 2 내지 5회추출한후여과하고감압농축하여본발명의쑥조추출물을얻을수있다. 또한, 본발명은상기제조방법으로부터얻어진쑥조추출물로부터추출분획물및추출정제물을제조할수있다. 구체적으로, 본발명의추출분획물은상기제조방법으로부터얻어진쑥조추출물을물 ( 탈이온수 ) 에현탁시킨후에헥산, 클로로포름, 디클로로메탄, 메틸렌클로라이드또는에틸아세테이트등이며, 바람직하게는헥산, 메틸렌클로라이드또는에틸아세테이트로구성된그룹으로부터선택된하나이상의가용한용매를이용하여 1회내지 10회, 바람직하게는 2회내지 5회반복하여순차적으로분획한후여과하고감압농축하여비극성용매가용분획물을수득한후에 ; 남은잔사에탄소수 1 내지 4 등의극성용매로분획을수행하여수득되는극성용매가용추출분획물을수득가능하다. 또한, 본발명의추출정제물은상기제조방법으로부터얻어진쑥조추출물또는추출분획물을대상으로보다활성을강한생리활성성분을분리하기위하여수행되는실리카겔컬럼크로마토그래피법, 세파덱스컬럼크로마토그래피법또는이온교환수지컬럼크로마토그래피법등의당업계에잘알려진일반적인분리정제용컬럼크로마토그래피를통하여수득되는정제된형태의추출정제물을얻을수있다. 최종적으로, 상기쑥속식물의추출물로부터활성성분인유파티린및자세오시딘만을고함유한화합물을대량으로분리하는본발명의방법을하기에상세하게예시한다. 예를들어, 본원에서정의되는쑥속식물의추출물인조추출물, 추출분획물및추출정제물을상용의원심향류분배크로마토그래피 (CPC), 예를들어, Model LLB-M High Performance CPC 기기를이용하여 (a) 용매시스템은혼화되지않는두상 (phase) 의용매계의분배계수의차이를극대화시킨용매시스템, 구체적으로는, 혼합용매에서나누어지는상충및하층에분배되는분배상수가 0.5 내지 5 범위를갖고, 근접한분해상수를갖는기타물질과 1.5 내이상의분배상수차이를갖는용매시스템, 예를들어, 헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) 의혼합용매, 바람직하게는, 헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) 의혼합비가 1:3 7:3 7:1 5 (v/v), 보다바람직하게는헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) 의혼합비가 1:4 6:4 6:1 3 (v/v) 의용매시스템 ( 순상또는역상 ) 을적용하고 ; 고정상을펌프를이용하여 CPC에용리시켰으며 ; CPC의방출구에서고정상이흘러나오는것이육안으로관찰될때이를중지하고, (b) CPC의회전속도가약 600 내지 1000rpm, 바람직하게는, 약 800 rpm으로고정시킨후에하향모드 (descending mode) 로하여이동상을용리시키고 CPC의방출구에서이동상이용리되는것이확인되는것이관찰될때리오딘밸브와루프를사용하여시료를주입한다. 이때 (c) 바람직한이동상의용리속도는약 1.0 내지 2.0 ml/min이며, 보다바람직하게는 1.3 ml/min 이다. 보다구체적으로, 본발명에서사용되는원심향류분배크로마토그래피의용출액은 HPLC-자외선검출기를이용하여검출함과동시에자동분취기를사용하여분획하고 ; 얻어진유파티린및자세오시딘으로분리하기위해서적정한 K-value값을가진용매시스템, 바람직하게는헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ), 보다바람직하게는, 헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) (1:5:5:2, v/v) 용매시스템 ( 순상또는역상 ) 을헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) 의용매는혼합하여분획여두에담고이를강하게흔들어진탕하여만든후하층을이동상으로, 상층을고정상으로나누어상층과하층을분리하여따로담고, 사용전에바로초음파처리하여기포를제거한후, 원심향류분배크래마토그래피의분리방법은상기와동일하게, 고정상을펌프를이용하여 CPC에용리시켰으며. CPC의방출구에서고정상이흘러나오는것이육안으로관찰될때이를중지시켰고, CPC 의회전속도를약 600 내지 1000rpm, 바람직하게는, 약 800 rpm으로고정시킨후하향모드 (descending mode) 로하여이동상을용리시켰으며 CPC의방출구에서이동상이용리되는것이확인되는것이관찰될때리오딘밸브와루프를사용하여시료를주입하였으며, 이때이동상의용리속도는 1.0 내지 2.0 ml/min이며, 바람직하게는 1.3 ml/min 로한다. 본발명자들은상기제조방법으로수득되는쑥속식물의추출물을대상으로한원심향류분배크로마토그래피를 - 5 -

6 이용함으로서안정성, 수득률및경제성이뛰어난고농도유파티린및자세오시딘을대량으로분리및생산하는 데유용함을확인하였다. [0030] 효과상기에서설명한바와같이, 본발명의쑥속식물의추출물로부터혼화되지않는두상의용매계의분배계수의차이를극대화시킨원심향류분배크로마토그래피 (CPC) 를이용하여안정성, 수득률및경제성이뛰어난고농도유파티린및자세오시딘을대량으로분리및생산하는방법으로유용하게사용할수있다. [0031] 발명의실시를위한구체적인내용 이하, 본발명을상세히설명한다. 단, 하기실시예, 참고예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명 의내용이이에의해한정되는것은아니다. [0032] [0033] [0034] 참고예 1. 실험준비쑥의성분을확인하기위한원심향류분배크로마토그래피 (CPC) 기기는 LLB-M High performance centrifugal partition chromatography (Sanki Eng., Kyoto, Japan) 을사용하였다. 이동상및고정상을송액하기위한펌프 (pump) 로는 Gilson 321 pump (Middleton, WI, USA) 를사용하였고자동분취기는 Gilson FC 203B (Middleton, WI, USA) 를사용하였으며, 시료주입을위하여리오딘밸브 (Rheodyne valve, Cotati, CA, USA) 를사용하였으며 5 ml 루프를사용하였다. 또한 CPC에서용리하는성분모니터링을위해 Gilson UV/VIS 디텍터 (Middleton, WI, USA) 를사용하였다. CPC에서나온분획에대한성분분석을위해서워터스 520 펌프 (Waters 520 pump, Milford, MA, USA) 및워터스 996 포토디오트어레이디텍터 (Waters 996 photodiod array detector, Milford, MA, USA) 및워터스 717 플러스오토샘플러 (Waters 717 plus autosampler, Milford, MA, USA) 를사용하였다. 그밖의유기용매는 대정화학금속에서구입하여사용하였고, 물 ( 탈이온수 ) 은 (Millipore RiosTM water purification system, Bedford, MA, USA) 를이용하여사용하였으며, HPLC 분석에사용된탈이온수와아세토니트릴은한국피셔과학 (Seoul, Korea) 에서구입하여사용하였다. 데이타의처리및산정은엠파워소프트웨어 (Empower software) 를이용하였다. [0035] [0036] [0037] 실시예 1. 쑥추출물의제조 1-1. 쑥에탄올조추출물의제조경동시장에서구입한건조된쑥 (Artemisia princeps Pampan.) 600g을곱게분쇄하여분쇄된쑥에 95% 에탄올 (( 주 ) 대정화학금속 ) 6L를 3시간씩 3회가열하여추출한후여과하고, 이여과액을감압농축기를이용하여항량이될때까지감압건조하여쑥에탄올조추출물 47g( 이하, A-EtOH 라함 ) 을얻었다. [0038] [0039] 1-2. 에틸아세테이트추출분획물의제조경동시장에서구입한건조된쑥 (Artemisia princeps Pampan.) 600g을곱게분쇄하여분쇄된쑥에 95% 에탄올 (( 주 ) 대정화학금속 ) 6L를넣고 3시간씩 3회가열하여추출한후여과하고, 이여과액을감압농축기를이용하여감압건조하여쑥에탄올추출물 52g을얻었다. 감압건조된에탄올추출물을 1.5 L의물 ( 탈이온수 ) 에현탁시켰고여기에물과헥산두층으로분획하여헥산추출물을얻은후다시물층을계속에틸아세테이트로순차적으로분획하여항량이될때까지감압건조하였으며, 최종적으로에틸아세테이트가용추출분획물 4.3 g( 이하, A-EtOAc 라함 ) 을얻었다. [0040] [0041] 1-3. 세파덱스 (Sephadex) LH-20 칼럼크로마토그래피로정제한추출정제물의제조 경동시장에서구입한건조된쑥 (Artemisia princeps Pampan.) 600g 을곱게분쇄하여분쇄된쑥에 95% 에탄올 - 6 -

7 (( 주 ) 대정화학금속 ) 6L를넣고 3시간씩 3회가열하여추출한후여과하고, 이여과액을감압농축기를이용하여감압건조하여쑥에탄올추출물 49g을얻었다. 이를메탄올을용출용매로하여세파덱스 (Sephadex) LH-20 컬럼크로마토그래피를실시하여크게 2 개의분획으로나누었으며이중두번째분획을항량이될때까지감압농축하여엽록소및지질등의불순물이제거된유파티린과자세오시딘만을고함유한추출정제물 421 mg( 이하, A- Sep 라함 ) 을얻었다. [0042] [0043] [0044] 실시예 2. 쑥화합물들의분리 2-1. 용매시스템계의선정본실험에서사용되는쑥속식물의추출물에서분리된유파티린및자세오시딘이혼합용매에서나누어지는상층과하층에분배되는분배상수가 0.5~5사이의값을가지고, 근접한분배상수를가지는다른물질과 1.5배이상의분배상수차이를가지는클로르포름 : 메탄올 : 물, 헥산 : 에틸아세테이트 : 메탄올 : 물, 부탄올 : 에탄올 : 물, 헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) 등의용매시스템을배합하여 K value 값을측정한결과, 하기표 1에나타난바와같이헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 탈이온수 (2:5:5:2, v/v) 가유파티린및자세오시딘을분리하기위한최적의용매배합임을확인할수있었다 ( 표 1 참조 ). 표 1 [0045] 용매조성 용매비율 유파티린 (K) 자세오시딘 (K) 헥산-클로로포름-메탄올- 탈이온수 1:5:5: 헥산-클로로포름-메탄올- 탈이온수 2:5:5: 헥산-클로로포름-메탄올- 탈이온수 3:5:5: [0046] [0047] 상기참고예에서선정한용매계에서적절한분배상수를가지더라도원심향류분배크로마토그래피분리과정에서정지상이칼럼에머무름비율이작으면실패할확률이크므로정지상의머무름비율을확인해야하며, 원심향류분배크로마토그래피분리과정에서이동상의흐름속도와칼럼의원심속도는분리능을좌우하므로, 이동상의흐름속도는낮을수록분리능은좋아지지만전체분리시간이증가하며, 칼럼의원심속도는증가할수록분리능이증가한다. 상기실시예 1에서얻은쑥추출물 ( 조추출물, 추출분획물, 추출정제물 ) 을각각 150mg, 100mg, 50mg을시험관에넣고평형화된 2상계의이동상층에 5ml을녹여첨가한다. 시험관에서충분히교반한후에두개의층으로깨끗하게나누어지면각층을분리한후에질소가스를이용하여건조한다. 각층의잔사는메탄올에녹여 HPLC과정을수행한다. 분배상수는상층액에포함되어있는목표물질의피크면적을하층액의피크면적으로나눈값으로계산한다. [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] 2-2. 원심향류분배크로마토그래피를이용한분리조건본실험에사용한원심향류분배크로마토그래피를이용한분리조건은하기와같다. 헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) 의용매는혼합하여분획여두에담고이를강하게흔들어진탕하여만든후하층을이동상으로, 상층을고정상으로나누어상층과하층을분리하여따로담고, 사용전에바로초음파처리하여기포를제거한후, 상기의고정상에펌프를이용하여 CPC의방출구에서고정상이흘러나오는것이육안으로관찰될때중지시킨후에 800rpm 원심의속도로고정시키고, 하향모드 (descending mode) 로하여이동상을용리시켜서 CPC의방출구에서이동상이용리되는것이확인되는것이관찰될때시료를주입하여이동상을 1.3 ml/min 흐름속도로흘렸으며, CPC의방출구내에서정지상과이동상간의평형화가이루어지면각시료 (A- EtOH (150 mg), A-EtOAc (100 mg), A-Sep (50 mg)) 를, 이동상 5 ml에녹여서주입하고, 약 250 분간작동한다. CPC에서용리되어나오는용리액은자외선검출기를이용하여 340 nm에서모니터링하였고용리액은자동분취기를이용하여 1개의시험관당 6.5 ml 씩분취하였다. 모든실험은 3회반복하였다. 원심향류분배크로마토그래피의용출액은 HPLC-자외선검출기를이용하여검출함과동시에자동분취기를사용하여분획하고, 얻어진각각의유파티린및자세오시딘으로분리하기위해서헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 ) (2:5:5:2, v/v) 용매계 ( 순상 ) 를사용하였다

8 [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] 실험예 1. 단일유파티린및자세오시딘의함량측정상기실시예 1에서얻은쑥추출물 ( 조추출물, 추출분획물, 추출정제물 ) 을각각 150mg, 100mg, 50mg을상기실험예 2-2의 CPC의헥산 : 클로로포름 : 메탄올 : 물 ( 탈이온수 )(2:5:5:2, v/v) 용매시스템 ( 순상 ) 을이용하여각각의추출물, 추출분획물및추출정제물에서유파티린과자세오시딘을분리하여함량을측정하였다. 그실험결과, 도 1에나타낸바와같이원심향류분배크로마토그래피실험방법에의해수행되어진추출물 ( 조추출물, 추출분획물, 추출정제물 ) 로부터얻은각단일유파티린및자세오시딘의함량은추출물 ( 에탄올 ) 의경우는유파티린 (5.8mg), 자세오시딘 (2.7mg) 이였고, 추출분획물 ( 에틸아세테이트 ) 의경우는유파티린 (12.4mg), 자세오시딘 (9.1mg) 이였으며, 추출정제물 ( 칼럼크로마토그래피 ) 의경우는유파티린 (20.1mg), 자세오시딘 (11.7mg) 이었다 ( 도 1 참조 ). 이러한결과는, 기존에판매중인유파티린이함유된정제의경우보다원심향류분배크로마토그래피법을이용한유파티린이약 2 ~ 4배의높은함량을가지고, 상대적으로적은양의시료로큰약리효과를낼수있을것으로사료됨에따라경제성이뛰어날뿐만아니라, 품질을크게향상시킬수있을것으로보인다. [0058] [0059] [0060] 실험예 2. 유파티린및자세오시딘의구조측정 실험예 1 에서수득한원심향류분배크로마토그래피를이용하여분리한화합물, 즉유파티린및자세오시딘의구 조를측정하기위해서, 1 H-NMR, 13 C-NMR 을 UV 분광기 (Spectrometer) 를이용하여기존의보고된문헌 (Ryu et al., Korean J. Crop. Sci., 49, pp , 2004) 을통하여그구조를측정하였다. [0061] 실험결과, 도 2 내지도 5 에서나타낸바와같이각각의분리된화합물인유파티린과자세오시딘의구조를확인 할수있었다 ( 도 2 내지도 5 참조 ). [0062] [0063] 화합물 (1): 유파티린 ( 이하 "Eupatilin" 으로명명함 ) 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6 ): 3.76 (3H, s, OCH 3 ), 3.84 (3H, s, OCH 3 ), 3.87 (3H, s, OCH 3 ), 6.62 (1H, s, H- 3), 6.93 (1H, s, H-8), 7.11 (1H d, J = 8.6 Hz, H-5'), 7.54 (1H, d, J = 1.9, H-2'), 7.65 (1H, dd, J = 8.6, 2.1 Hz, H-6'), (s, 7-OH), (1H, s, 5-OH) [0064] 13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d6 ): (C-4), (C-2), (C-7), (C-5), (C-9), (C- 4'), (C-3'), (C-6'), (C-1'), (C-6'), (C-5'), (C-2'), (C-10), (C-3), 94.3 (C-8), 59.9 (OCH 3 ), 55.8 (OCH 3 ), 55.7 (OCH 3 ) [0065] UV 스펙트럼 : lmax (loge)in MeOH: 275 (4.26), 340 (4.04) nm [0066] [0067] 화합물 (2): 자세오시딘 ( 이하 "Jaceosidine" 으로명명함 ) 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d6 ): 3.75 (3H, s, OCH 3 ), 3.86 (3H, s, OCH 3 ), 6.60 (1H, s, H-8), 6.87 (1H, s, H- 3), 6.92 (1H d, J = 9.3 Hz, H-5'), 7.55 (1H, d, J = 1.9, H-2'), 7.55 (1H, dd, J = 9.3, 1.9 Hz, H-6'), (1H, s, 5-OH) [0068] 13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d6 ): (C-4), (C-2), (C-7), (C-9), (C-5), (C- 3'), (C-4'), (C-6), (C-1'), (C-6'), (C-5'), (C-2'), (C-2'), (C-3), 94.3 (C-8), 59.9 (OCH 3 ), 55.9 (OCH 3 ) [0069] UV 스펙트럼 : lmax (loge) in MeOH: 274 (4.18), 344 (4.42) nm - 8 -

9 [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] 실험예 3. 유파티린및자세오시딘의회수율및순도측정상기실험예 1에서수득한유파티린과자세오시딘의회수율및순도를측정하기위하여 HPLC-UV/VIS를사용하였으며, 이동상으로메탄올 (0.5% 아세트산함유 ) 과 0.5% 아세트산을이용하여혼합하여사용하였다. 메탄올 (0.5% 아세트산함유, (A)) 과 0.5% 아세트산 (B) 이각각 0 min(40% A, 60% B), 40 min(70% A, 30% B), 50 min(70% A, 30% B) 이되도록하였고, 유속 (flow rate) 는 1ml/min로, Gilson UV/VIS 검출기 (Middleton, WI, USA) 를사용하였으며, 성분분석을위해서워터스 520 펌프 (Waters 520 pump, Milford, MA, USA), 워터스 996 포토디오트어레이검출기 (Waters 996 photodiod array detector, Milford, MA, USA) 및워터스 717 플러스오토샘플러 (Waters 717 plus autosampler, Milford, MA, USA) 를사용하였다. 이때, 사용된컬럼은 Shiseido- Capcell Pak ( mm ID, 5 mm, Japan) 을사용하였고, 시료의주입량은 20 ml로하였으며, 데이타의처리및산정은엠파워소프트웨어 (Empower software) 를이용하였다. 그실험결과, 표 2 에나타낸바와같이추출물 ( 조추출물, 추출분획물, 추출정제물 ) 에서유파티린은각각 94.7%, 96.9%, 95.9% 의회수율을보였고, 자세오시딘은각각 73.0%, 72.9%, 77.8% 의회수율을보였으며, 또한, 순도는유파티린의경우각각 75.3%, 77.7%, 91.4% 를, 자세오시딘은각각 79.2%, 74.9%, 94.6% 를보여, 특히, 추출정제물의순도가탁월함을확인하였다 ( 표 2 참조 ). 이러한결과는, 기존의다른어떤문헌에는찾아볼수없는방법으로, 다양한종류의쑥속식물에함유된유파티린및자세오시딘을분리및제조하는방법에모두적용될수있다고사료된다. 표 2 [0075] 유파티린 CPC 분획 ( 피크 2) 자세오시딘 CPC 분획 ( 피크 1) 시료 회수율 (%) 순도 (%) 회수율 (%) 순도 (%) A-EtOH 94.7± ± ± ± 0.7 A-EtOAc 96.9± ± ± ± 0.9 A-Sep 95.9± ± ± ± 0.8 [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] 도면의간단한설명도 1은쑥속식물의추출물로부터원심향류분배크로마토그래피와고성능액체크로마토그래피 (HPLC) 를이용하여유파티린 (2) 및자세오시딘 (1) 을분리 (A1: 쑥에탄올조추출물의원심향류분배크로마토그래피를이용한유파티린및자세오시딘의분리 ; A2: 쑥에탄올조추출물의 HPLC 크로마토그램 ; A3: 원심향류크로마토그래피로분리한자세오시딘의 HPLC 크로마토그램 ; A4: 원심향류크로마토그래피로분리한유파티린의 HPLC 크로마토그램 ; B1: 쑥에틸아세테이트추출분획물의원심향류분배크로마토그래피를이용한유파티린및자세오시딘의분리 ; B2: 쑥에틸아세테이트추출분획물의 HPLC 크로마토그램 ; B3: 원심향류크로마토그래피로분리한자세오시딘의 HPLC 크로마토그램 ; B4: 원심향류크로마토그래피로분리한유파티린의 HPLC 크로마토그램 ; C1: 쑥을세파덱스 LH-20으로정제한추출정제물의원심향류분배크로마토그래피를이용한유파티린및자세오시딘의분리 ; C2: 쑥세파덱스 LH-20으로정제한추출정제물의 HPLC 크로마토그램 ; C3: 원심향류크로마토그래피로분리한자세오시딘의 HPLC 크로마토그램 ; C4: 원심향류크로마토그래피로분리한유파티린의 HPLC 크로마토그램 ) 한결과를나타낸도이고, 도 2는유파티린의 1 H-NMR에관한도이며, 도 3은유파티린의 13 C- NMR에관한도이고, 도 4는자세오시딘의 1 H-NMR에관한도이며, 도 5는자세오시딘의 13 C- NMR에관한도이다

10 도면 도면

11 도면

12 도면

13 도면

14 도면 5 심사관직권보정사항 직권보정 1 보정항목 청구범위 보정세부항목 청구항제6항 변경전 보다활성을강한생리활성성분을분리하기위하여 변경후 보다활성이강한생리활성성분을분리하기위하여 직권보정 2 보정항목 청구범위 보정세부항목 청구항제1항 변경전 상기조출출물, 추출분획물또는추출정제물을용매시스템은 변경후 상기조출출물, 추출분획물또는추출정제물의용매시스템은

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<B4D9BDC3BEB4C0AFB1E2C8ADC7D02D34C6C72D35BCE2C3D6C1BE28B1B3BBE7292E687770> C H A P T E R 01 유기화합물의물성과구조 1.1 용해와극성 1.2 크로마토그래피와이성질체 1.3 증류와편극성 1.4 추출과산해리상수 1.5 재결정과녹는점 1.6 추출 / 재결정 / 증류가통합된혼합물의분리실험 1.7 컴퓨터소프트웨어를이용하여화학구조그리기 1.1 용해와극성 13 실험 1 다음화합물들의용해도를관찰하시오. 10mL 시험관, 시험관대, 1.00mL