Chapter 3

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충민 왕
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1 Chapter 10 DNA Damage and Repair 1

1) UV-A (320-400 nm); majority of UV light reaching earth, does little DNA damage 2) UV-B (295-320 nm); ~10% of UV light reaching earth,

2 10.1 Radiation damage UV 와두가지종류의 ionizing radiation 인 x-ray 와 gamma ray 는 DNA 에상당한손상을준다우선 UV 가주는 damage 에대하여배우고다음으로 ionizing radiation 에대하여배운다. UV 에는 3 가지종류가있다. 1) UV-A ( nm); majority of UV light reaching earth, does little DNA damage 2) UV-B ( nm); ~10% of UV light reaching earth, 대부분의 skin damage 를야기 3) UV-C ( nm); DNA 의흡수력이가장강한파장을포함 (260nm), 지구대기권으로들어오면 DNA 에가장큰영향을미치나 ozone 층이막아준다. UV 의영향을받으면동일 DNA 가닥의인접한피리미딘염기간에 dimer 를형성하나두가지가있다. 1) cyclobutane pyrimidinedimer (CPD); UV induced damage 의 75%, 피리미딘의 C-5 원자, C-6 원자끼리결합을형성함. 2

3 2) UV-induced (6-4) photoproduct formation Figure 10.1b a bond forms between the C-6 atom of the 5' pyrimidine and the C-4 atom of the 3' pyrimidine X-ray 와 gamma ray (ionizing radiation) 가미치는 DNA damage 직, 간접적으로 DNA 에손상을준다. Direct damage; DNA 나강하게결합된물이 radiation 을흡수한경우에발생. Indirect damage; DNA 를싸고있는물이나다른분자가 radiation 을흡수하여 DNA 에해를주는반응물을만들었을때일어남. 물로 photon 을전달하여물이활성화되어서 hydroxyl radical, superoxide radical 등을만들어이들이 DNA 를위시한다른분자를공격한다. 집중적으로발생하는 lesion 의하나는이중가닥절단이며이로인해 deletion, duplication. inversion, translocation 등이발생한다. 3

4 10.2 DNA instability in water 물에의하여공격 (hydrolytic cleavage) 을받는결합에는세종류있으며 phosphodiester bonds (brown), N-glycosylic bond (green), bonds to exocyclic amine groups (blue) 가있다. ( 그림 10.3) 참고 ; red arrow- reactive oxygen 에의하여공격을받는부위 green asterisk- alkylating agent 에의하여공격을받는부위 1) 자연적인 phosphodiester bond 의파괴는매우드물어 DNA damage 에큰영향을미치지못한다. 2) N-glycosyl bond 의파괴는그림 10.4 처럼 AP (apurinic & apyrimidic) site 를만든다. AP site 를갖으면전사나복제의주형으로쓰이는데문제가있다. Figure 10.3 Figure 10.44

5 Figure ) water-mediated deamination 은 cytosine 을 uracil, guanine 을 xanthine, adenine 을 hypoxanthine 으로바꾼다. cytosine deamination 이하루에포유류세포에서 번일어나며 guanine 과 adenine deamination 은전체의 1-2% 만일어난다. guanine 이 xanthine 으로되면알맞는염기쌍이없어 DNA 복제가멈추게된다. adenine 이 hypoxanthine 으로되면 T-A 가 G-C 로바뀐다. cytosine 이 uracil 로바뀌면 C-G 가 T-A 로바뀜. Transition Transversion Figure 10.6 이와같이 py-pu base pair 가다른 py-pu 로바뀌면 transition 이라고하고 py-pu 를 pu-py 로바뀐것을 transversion 이라고함. Bacon, sausage, hot dogs 등에방부제로쓰이는 nitrite 에서형성된 nitrous acid (HNO 2 ) 는 deamination 을야기. wine, beer, 과일주스등에사용하는 bisulfite (HSO 3- ) 는 cytosine deamination 을야기시킴 ) 5

오히려다른대사작용에의하여생겨나는 reactive oxygen 종류가 DNA 에큰해를입힌다고생각한다.

6 10.3 Oxidative damage 세포호흡은전자를마지막수용체인산소에전달하는과정이며그결과 reactive oxygen 이생긴다. 세포호흡의 reactive oxygen 은 DNA 에해를입힐가능성이많지만실제로는우리몸의여러기작에의하여방지를하고있다고생각된다. 오히려다른대사작용에의하여생겨나는 reactive oxygen 종류가 DNA 에큰해를입힌다고생각한다. 우선 hydroxyl radical ( OH) 는 80 종류이상의 DNA damage 를일으킨다. 그림 10.7 의 8-oxoguanine 와 thymine glycol 이예이다. 8-oxoguanine 은 A 혹은 C 와결합을하며 ( 그림 10.8) 그결과 G-C 가 T-A 로 transversion 이일어난다. 8-oxoguanine Thymine glycol Figure 10.7 Figure

7 Reactive oxygen 은당과염기에해를주거나다른다양한분자를변화시켜서이들이 DNA 에해를주게한다. 그림 10.9 에 polyunsaturated fatty acid 가산화되어두개의 aldehyde product 인 malondialdehyde 와 4-hydroxynonenal 이되어이것이 base 에해를미친다. Figure 10.09a: Malonyldialdehyde 와이로인하여원자를잃어버려해를입은염기. 푸른색은원래염기에서유래된것이고검은색은 malonyldialdehyde 에서유래 Figure 10.09b: 4-Hydroxynonenal 과이로인하여원자를잃어버려해를입은염기. 푸른색은원래염기에서유래된것이고검은색은 4-Hydroxynonena 에서유래 7

8 10.4 Alkylation damage by monoadduct formation DNA 는 electron-rich atom 을갖고있어 electrophile 이라고불리는화학물질에의하여쉽게공격을받는다. Electrophile 의대표적인것에는 alkylating agent 가있으며이는 methyl, ethyl, 혹은커다란 alkyl group 를 DNA 에이전시킨다. alkylation takes place at: ( 그림 10.3 참조 ) nitrogen and oxygen atoms external to the base ring systems nitrogen atoms in the base ring systems except those linked to deoxyribose non-bridging oxygen atoms in phosphate groups DNA 에 chemical group 를첨가하여생긴생성물을 adduct 라고하며 DNA 의한부위에만 chemical group 가첨가된경우를 monoadduct 라고한다. 그림 에는한부위에 methyl group 를첨가하는 methylating agent 를볼수있다. 대표적인것이 methylmethane sulfonate (MMS) N-methyl-N-nitrosourea (MNU) 가있다. 이들은알려진 alkylating agent 의일부분이며대부분은훨씬큰 alkyl group 을이전한다. Figure

좌측그림 ; MMS 에의하여 methylation 되는부위 우측그림 ; MNU 에의하여 methylation 되는부위 Figure 10.11 붉은색은이중가닥일때푸른색은단일가닥일때 methylation 되는부위임.

9 좌측그림 ; MMS 에의하여 methylation 되는부위 우측그림 ; MNU 에의하여 methylation 되는부위 Figure 붉은색은이중가닥일때푸른색은단일가닥일때 methylation 되는부위임. Guanine 의 O-6 부위가 methylation 된 O 6 -methylguanine 은 thymine 과결합을하고 O-4 부위가 methylation 된 O 4 -methylthymine 은 guanine 과결합을하여 transition 이일어난다. 9

Environmental agent ( 환경물질 ) Figure 10.13 Figure 10.

1775 년영국의사 Potts 는굴뚝청소부가고환암이많은것을발견하고환경과암의관계를밝힘. 숱검댕이에있는 polycyclic aromatic hydrocarbon 이원인임.

10 Environmental agent ( 환경물질 ) Figure Figure 많은 environmental agent 는세포내에서대사작용을거쳐서 alkylating agent 가된다 년영국의사 Potts 는굴뚝청소부가고환암이많은것을발견하고환경과암의관계를밝힘. 숱검댕이에있는 polycyclic aromatic hydrocarbon 이원인임. 이와유사한물질이그림 10.3 에있다. 이들은직접작용하는것이아니라세포내에서대사작용을거쳐활성화되어 DNA 를공격한다. 그림 에 benzopyrene 가 cytochrome P450 과 epoxide hydrolase 에의하여 benzopyrene 7,8 diol 9,10 epoxide 가되며이것이 DNA 를공격하여 adduct 를만든다. 10

땅콩이나쌀, 옥수수등에자라는곰팡이에서만들어지는 aflatoxin 는 DNA 에해를입히기전에 activation 되어야한다. 그림 10.

11 땅콩이나쌀, 옥수수등에자라는곰팡이에서만들어지는 aflatoxin 는 DNA 에해를입히기전에 activation 되어야한다. 그림 의 aflatoxin B1 은 cytochrome P450 에의하여활성화되며이는간암을비롯한간의질병을야기시킨다. 그림 10.16; 활성화된 aflatoxin 이 guanine 를공격하여 helical distortion 을야기시킴. Figure Figure

12 10.5 Chemical cross-linking agents 여태까지배운 alkylating agent 는 monoadduct 이나많은 alkylating agent 는두개의반응부위를갖고있어이것이 intrastrand 혹은 interstrand cross-link 를형성한다. interstrand cross-link 는수선되지않으면가닥분리가일어나지않아치명적이다. 단순한 cross-linking agent 로는 mustard gas 가있으며 (bis(2-chloroethyl)methylamine) 이다. 원래중추신경계를공격하는화학물질로군대에서개발되었지만후에 DNA damage 를준다는것을알게됨. 서로반대가닥에있는구아닌의 N-7 을공격하여 interstrand crosslink 를만듬. Bis(2-chloroethyl)methylamine (nitrogen mustard gas) Figure

psoralen 이파장 400 450nm 의빛에노출되면 furan ring 이활성화되어 pyrimidine ( 주로 thymine) 의 C-5,6 double bond 를만들어 4,5 monoadduct 를만든다.

13 Psoralen and related compound Psoralen은당근종류가합성하는물질로 DNA를 alkylate 하기전에 photoactivation되어야한다. Figure 10.18: Psoralen. Psoralen 분자는 furan ring ( 붉은색 ) 과 coumarin 이라고불리우는 heterobicyclic ring ( 검정색 ) 과융합이된것으로 DNA 분자속으로끼어들어간다. psoralen 이파장 nm 의빛에노출되면 furan ring 이활성화되어 pyrimidine ( 주로 thymine) 의 C-5,6 double bond 를만들어 4,5 monoadduct 를만든다. 4,5 monoadduct 가파장 의빛에노출되면활성화되어반대가닥 DNA 의두번째 pyrimidine 염기와결합한다. 그결과이중가닥 DNA 의서로반대가닥에있는 pyrimidine 사이에 cross-lonk 를형성함. 수선이안되면치명적이된다. 13

Cisplatin cisplatin 은 intra- 와 interstrand cross-link

암세포의 chemotherapeutic agent 로사용하나부작용이심하여새로운유사물질을찾는중임

20 Cisplatin Covalent structure of a cisplatin

14 Cisplatin cisplatin 은 intra- 와 interstrand cross-link 를만든다. 세포내에들어오면세포분열을막는작용을한다. 반응방법은아래그림을참조. 암세포의 chemotherapeutic agent 로사용하나부작용이심하여새로운유사물질을찾는중임 Figure Cisplatin Covalent structure of a cisplatin cross-link Stereoview of a cisplatin intrastrand cross-link Oligonucleotide used to obtain data for the model shown in (c) 14

10.6 mutagen and carcinogen detection 특정물질이 carcinogen 인가아닌가를조사하는방법으로 Ames Test 가있다. 1964 년개발한방법으로현재도사용하고있다.

15 10.6 mutagen and carcinogen detection 특정물질이 carcinogen 인가아닌가를조사하는방법으로 Ames Test 가있다 년개발한방법으로현재도사용하고있다. Salmonella typhimurium 의 his 유전자에 base substitution 이나 frame shift 에의해돌연변이가일어난 histidine 요구돌연변이주가 His + 로바뀌는것을조사함. ( 그림참조 ) 초기에몇몇 mutagen 을찾는데실패를하였으며그이유는 benzopyrene 이나 aflotoxin B 1 은 cytochrome p450 에의하여활성화되어야하는데박테리아는해당효소가없기때문에활성화되지못함해결책으로 rat liver enzyme 를가해줌 Carcinogenicity 로서의최종적인결정을하기위해서는실험동물에서 tumor 를형성하는실험을해야하며 Ames test 는 animal 실험을하는대상을줄이는역할을한다. 15

16 10.7 Direct reversal of damage 1) photolyase DNA damage 를수선하는방법은여러가지있지만우선은직접수선 (direct repair) 하는방법에대하여배우기로한다 년 Albert Kelner 가 UV 를이용하여박테리아에돌연변이를일으킨후어두운상태에서보관할때와빛이있는상태에서보관할때회복하는비율이많은차이가있는것을발견함. 즉가시광선이 UV 의효과를다시원위치시키는것을발견하고이를 photoreactivation 이라고함. 몇년후에 UV irradiation 이 cyclobutane pyrimidine dimer (CPD) 를만들고 photoreactivation 효소가푸른색광선 ( nm) 이주는에너지를이용하여 cyclobutane ring 을파괴하는것을발견함 이효소를 CPD photolyase 라고명명함. Figure

Photolyase 는활성을위하여 chromophore factor 를필요로한다. FADH MTHF Figure 10.

CPD photolyase 는 N- 과 C-terminal domain 이있으며이곳에빛을흡수하는색소인 chromophore factor 가결합하여작용을한다. chromophore factor 는그림 10.

17 Photolyase 는활성을위하여 chromophore factor 를필요로한다. FADH MTHF Figure HDF CPD photolyase 는박테리아에서식물, 동물에존재하며 개의아미노산으로 monomer 이다. CPD photolyase 는 N- 과 C-terminal domain 이있으며이곳에빛을흡수하는색소인 chromophore factor 가결합하여작용을한다. chromophore factor 는그림 에있으며 FADH - 는 flavin 유도체로 C-terminal 에결합하며 MTHF 는 N-terminal 그리고 8-HDF 는 fiboflavin 유도체로 N-terminal 에결합한다. E. coli 의 CPD photolyase 구조 ; 리본모양은 photolyase 를나타내며 MTHF 는 N-terminal 에결합되어있고 FADH 는 c-terminal 에결합한것을보여줌 17

Figure 10.25 죄측그림 ; cyanobacteria A. nidulans 의 photolyase 에서의반응.

25; CPD photolyase 가 electron transfer 와 ring splitting 과정을거쳐서 dimer 를복원하는과정을나타냄.

18 Figure 죄측그림 ; cyanobacteria A. nidulans 의 photolyase 에서의반응. DNA helix ( 초록 ) 에서 T-T dimer ( 붉은색 ) 를움직여 photolyase 의활성화부위에위치하게함. 활성화부위에서 FADH- ( 노란색 ) 와반응이일어난다. 그림 10.25; CPD photolyase 가 electron transfer 와 ring splitting 과정을거쳐서 dimer 를복원하는과정을나타냄. UV irradiation 에의하여 (6-4) photoproduct 도생기며이를수선하는효소를 (6-4)photolyase 라고하며수선과정이좌측그림에나타남. 이효소는동물과식물에는존재하나박테리아와포유류에는존재하지않는다. UV induced dimer 는 excision repair 에의해서도수선되며이는 photolyase 가없는사람등에서많이이용되는방법이다 18

2) O 6 -alkylguanine DNA alkyltransferases I and II DNA damage 를직접적으로복구하는또하나는 dealkylation 이다. DNA 의산소원자에결합한 alkyl group 을직접제거하는효소에는다음과같은것이있다. 1) O 6 -alkylguanine DNA alkyltransferase I ( 그림 10.

19 2) O 6 -alkylguanine DNA alkyltransferases I and II DNA damage 를직접적으로복구하는또하나는 dealkylation 이다. DNA 의산소원자에결합한 alkyl group 을직접제거하는효소에는다음과같은것이있다. 1) O 6 -alkylguanine DNA alkyltransferase I ( 그림 상 ); guanine 의 O-6 에결합하거나 thymine 의 O-4 에결합한 methyl 혹은 alkyl group 를제거한다. 본효소는 N- 과 C- terminal 이 flexible linker 로연결된 monomer 이다. N-terminal 쪽은제거된 alkyl group 를자신의 cystein-38 잔기로이전시키며 C-terminal 쪽은자신의 Cys-321 로이전시킨다 ( 그림참조 ). 이로인하여효소자체는활성을잃게되는데이를 suicide enzyme 라고한다. 2) O 6 -alkylguanine DNA alkyltransferase II; 유사한방법으로 alkyl group 을제거하며 suicide enzyme 이다 ) AlkB; 1-methyladenine 를 adenine -methyguanine 을 guanine 로 3-methyl ytosine 을 cytosine 으로 3-methylthymine thymine 로전환한다. 작용시 Fe 2+, olecular oxygen, α-ketoglutarate 를요로한다. 19

20 10.8 Base excision repair. a) monofunctional DNA glycosylase 대부분의 DNA damage 는앞에서배운것처럼하나의효소가관여하는 direct damage reversal 에의하여복구되지않고여러개의효소가관여하는 multistep pathway 를이용함. deamination, oxidation, alkylation 등은주로 base excision repair (BER) 에의하여복구됨. BER 은 DNA 로부터잘못되었거나이상이있는염기 (N-glycosyl bond) 를자르는첫번째단계에서이름이유래함. 그림 a; 어떤 DNA glycosylase 는단지해를입은염기만을잘라내는기능이있으며이를 DNA glycosylase 라고한다 b) Bifunctional DNA glycosylase/lyase Figure 그림b; 어떤것은당과 phosphate 3 사이의결합을자르는 AP lyase activity도있어이를 DNA glycosylase/lyase라고부른다. 두효소모두잘못된염기를인식하여 DNA helix에서효소의활성화부위로옮긴후 N-glycosyl bond를자른다. 이들의작용기작을따로설명한다. 20

21 1) Monofunctional DNA glycosylase pathway Figure 단계 ; DNA glycosylase 가잘못된염기를제거하여 AP site 를만든다. 다음으로 AP endonuclease 가 AP site 의 5 DNA 골격을잘라 free 3 OH 와 5 -deoxy ribose phosphate 사이에 gap 을만든다. ( 그림 10.31) 2 단계 ; short patch repair; 우측그림. E. coli DNA polymerase I 이나진핵세포의 DNA polymerase β 가 base 를첨가하고 ligase 가틈을메운다. long patch repair; 8-10 개의 nucleotide 가교체됨. DNA polymerase δ, ε 이 RFC clamp loader 와 PCNA sliding clamp 의도움을받아 3 끝에몇개의 nucleotide 를첨가하고 flap endonuclease 가 displaced strand 를자르고 ligase 가연결을한다. Figure

2) Bifunctional DNA glycosylase/lyase pathway 그림 10.33 은두번째 pathway 를나타냄. DNA glycosylase/lyase 는잘못된염기를자르고 AP site 의 3 쪽을자른다. DNA polymerase β 가하나의 nucleotide 를첨가하고 DNA ligase 가연결시킨다. 그림 10.32; DNA polymerase β 39kDa 이며 31kDA 의 polymerase activity ( 자주색 ) 와 8kDa 의 lyase activity ( 회색 ) 를갖은 domain 으로됨 Figure 10.

22 2) Bifunctional DNA glycosylase/lyase pathway 그림 은두번째 pathway 를나타냄. DNA glycosylase/lyase 는잘못된염기를자르고 AP site 의 3 쪽을자른다. DNA polymerase β 가하나의 nucleotide 를첨가하고 DNA ligase 가연결시킨다. 그림 10.32; DNA polymerase β 39kDa 이며 31kDA 의 polymerase activity ( 자주색 ) 와 8kDa 의 lyase activity ( 회색 ) 를갖은 domain 으로됨 Figure 10.33: Eukaryotic base excision repair starting with a bifunctional DNA glycosylase/lyase. Figure 10.32: DNA polymerase beta and substrates. 22

23 10.9 Nucleotide excision repair nucleotide excision repair 는다양한 DNA damage ( 예를들어 UV 로부터야기된 dimer, photoproducts, alkylation 에의한손상등 ) 를수선하기위하여 DNA 로부터 bulky adduct 를제거하여수선한다. 그과정은다음과같다. 1. damage recognition 2. incision in the damaged DNA strand on each side of the lesion 3. excision of the oligonucleotide created by the incisions 4. synthesis of new DNA to replace excised DNA 5. ligation of the nick 기본적인과정은모든생명체에서유사하나쓰이는효소들은많은차이가있기때문에박테리아와진핵세포를분리하여공부를한다. 1. Bacterial nucleotide excision repair. UV 로박테리아를돌연변이시킨후어두운곳에서키우면느리지만회복되는것이있다. 이는 photoreactivation 이외에다른수선방법이있다는것을의미한다. E. coli 에서 3 개의유전자 (uvra, uvrb, uvrc) 가 damage recognition, incision, excision 에필수유전자인것이밝혀지고해당단백질이분리되고연구되었다. 정상상황에서 UvrA 는 25 분자, UvrB 는 250, UvrC 는 10 분자가존재한다. 이들은함께안전한 3 차구조를이루지못하지만 UvrABC damage-specific endonuclease 혹은 UvrABC endonuclease 라고한다. 23

UvrABC endonuclease UvrA; has ATPase activity that influences binding to damaged DNA UvrB; plays central role in nucleotide excision repair interacts with UvrA to locate the

helix-turn-helix motif 로됨 helix-turn-helix motif 는 DNA major groove 에결합하고 zinc finger 는단백질 - 단백질의결합에관여한다. ATP 가 ATP binding site 에결합하면 dimer 가되고 DNA 에대한결합력이강해진다.

24 UvrABC endonuclease UvrA; has ATPase activity that influences binding to damaged DNA UvrB; plays central role in nucleotide excision repair interacts with UvrA to locate the lesion helps UvrC bind to DNA UvrC; binds to UvrB-DNA complex and makes incisions of both sides of the lesion 1) UvrA; 2 개의 ATP-binding motif, 2 개의 zinc finger motif, 1 개의 helix-turn-helix motif 로됨 helix-turn-helix motif 는 DNA major groove 에결합하고 zinc finger 는단백질 - 단백질의결합에관여한다. ATP 가 ATP binding site 에결합하면 dimer 가되고 DNA 에대한결합력이강해진다. ATP hydrolysis 는손상된 DNA 에 UvrA 가결합하게한다. 2) UvrB; UvrA 와 UvrC 와연관을맺어 nucleotide excision repair 에중심적인역할을한다. 6 개의 helicase motif (I VI) 가영역 1a 와 3 에존재하며 ATPase site 가두영역의중간에위치하며영역 2 와 4 는 UvrA, UvrC 와의결합에관여한다 24

25 UvrB 는 UvrA 와결합하여 (UvrA) 2 UvrB complex 를형성한다. 이 complex 는초기에손상을입은부위에서조금떨어져결합을하나일단결합한후에 UvrB helicase 는 (UvrA)2 UvrB complex 가 DNA 를따라서손상을입은부위까지이동하도록한다. 그다음에 UvrA 는 UVrB 에 ATP dependent conformational change 를야기시켜서 UVrA 를방출하여안전한 UvrB DNA complex 를만들게한다 DNA 는비틀리고가닥은분리된다. padlock model; 이모델에의하면 UvrB 는 β-hairpin 구조를갖고있어두개의 DNA 가닥내에이를끼워한가닥은 β-hairpin 과 1B 영역사이에서조여지게된다. Figure

26 3) UvrC 는 N-terminal 과 C-terminal 이연결된유연한연결부위를갖고있으며 UvrB DNA complex 에결합을한다. 결합후상처부위의양쪽에 incision 을한다. 손상된가닥의첫번째 incision 은상처부위로부터 3 말단쪽으로 4 개의 nucleotide 를자르고두번째 incision 은상처부위로부터 5 말단쪽으로 7 개의 nucleotide 를자른다. 세가지의부가적인효소가수선과정을마치기위하여더필요하다 UvrD (helicase) 가손상입은 DNA 를잘라내기위하여필요하고 DNA polymerase I 이새로운 DNA 를합성하고그리고 DNA ligase 가틈을메운다. Figure

2. Eukaryotic nucleotide excision repair Xeroderma pigmentosum (XP) 은열성형질로보인자인부모는증세가나타나지않지만 XP 아이는햇빛에노출되는부위인팔, 얼굴, 목등에피부암이정상인보다 1000 배정도많이생긴다. 정상인보다피부암이생기는나이도 50 년이이른 8 살정도이다.

27 2. Eukaryotic nucleotide excision repair Xeroderma pigmentosum (XP) 은열성형질로보인자인부모는증세가나타나지않지만 XP 아이는햇빛에노출되는부위인팔, 얼굴, 목등에피부암이정상인보다 1000 배정도많이생긴다. 정상인보다피부암이생기는나이도 50 년이이른 8 살정도이다. XP 는 UV 에의하여야기된 dimer 를수선하지못하여생기는병으로 7 개의유전자 (XPA- XPG) 가있으며 nucleotide excision repair 를수행하는데필수적인유전자들이다. nucleotide excision repair 는전사되는 DNA 가닥에작용하는가전사되지않는 DNA 가닥에작용하는가에따라서두가지로나눈다. 비전사 DNA 가닥의수선을 nucleotide excision repair 혹은 global genome excision repair path way ( 대부분의 DNA 는전사되지않기때문 ) 라고하며전사되는 DNA 의수선을 transcription-coupled nucleotide excision repair pathway 라고한다. 27

28 1) Global nucleotide excision repair (a) 손상을입어 DNA 가비틀린다. (b) XPC hhr23b 가비틀린곳을발견하고결합하여 DNA 가휘는것을안정화시킴 (c) transcription factor IIH (TFIIH) 가뒤이어결합. TFIIH 는원래 RNA polymerase II 의역할을도움 (d) TFIIH 는손상부위주위의 DNA helix 를 XPD subunit 이올때까지 ATP 에의존하여풀어줌. 다음으로 XPB helicase subunit 이 20bp 의 bubble 구조가될때까지푼다. (e) 단일가닥결합단백질인 RPA,XPA 와 XPG 가모여서 precision complex 를만든다 (f) ERCC1 XPF 가 complex 에와서 DNA 의양쪽을자른다. (5 쪽은 ERCC1 XPF 가 3 쪽은 XPG 가자름 ) (g)rpa 는단일가닥 DNA 에결합되어남아있고 clamp loader RFC 나 sliding clamp PCAA 의도움으로 DNA 중합효소 δ ( 혹은 ε) 이새로운 DNA 를합성하고 DNA ligase 가틈을메운다. P 유전자는원래 XP 환자에서분리하였지만 XPB 와 XPD에돌연변이가생기면성장이나신박약인 trichothiodystropy 환자가되나이는두유전자가전사과정에서의기능을 28 수행지못해서생기는것으로생각된다. ( 수선의문제가아님 )

29 2) Transcription-coupled nucleotide excision repair Transcription-coupled nucleotide excision repair 는 XPC hhr23b 를제외하고는동일한효소와, protein factor 가필요하다. 부가적으로 CSA 와 CSB 가더필요하다. CSA 와 CSB 는 Cockayne syndrome 환자에게서발견하였으며이환자는성장이느리고 neurological disorder, 그리고 photosensitivity ( 피부암과무관 ) 를나타낸다. 그림 10.39; XPC hhr23brk 필요가없는이유는 RNA 중합효소가손상된부위를찾는데도움을주기때문임 RNA 중합효소 II 가손상부위에서멈춘후 XPG 와 CSB 를모은다. 다음으로 TFIIH 와 CSA 를부른다. TFIIH 는 RNA 중합효소 II 와 DNA 사이의결합을변화시켜서주형가닥의손상부위를노출시켜 XPG 가접근하게한다. 다음으로 XPA, RPA 그리고 ERCC1 XPF 가모여든다. 다음에는앞그림의 (e) 단계로진행되게된다. Figure 만일손상된것이복구가안되면두가지문제가생김. 첫째, 필수적인유전자가전사안되거나둘째, RNA 중합효소가손상된부위에멈추어서다른유전자를전사하지못한다. Cockayne syndrome에서 XP와다른증상이생기는이유는 RNA 중합효소II가다른유전자를효율적으로전사하지못하여생긴것으로 29 간주됨

30 10.10 Mismatch repair mismatch repair 는복제후에나타나는 base pair mismatch, short deletion, insertion 등을수선하는과정이다. DNA 중합효소는 10 5 nucleotide 당 1 개의 mismatch 를집어넣지만 3 5 proofreading exonuclease 의작용에의하여 100 배정도 fidelity 가증가한다. 그러나 10 7 nucleotide 당하나의실수는아직많은것으로다른수선방법이요구된다. 복제기간에일어나는다른실수는짧은 insertion 과 deletion 이며이는주로 microsatellite 인 (CA) n 혹은 (A) n 에서많이일어난다. 우선 E. coli 의 mismatch repair system 부터살펴본다. E. coli 는 deoxyadenosine methylase 가있어 GATC 의 A 에 methyl 기를첨가하는데새로이합성된가닥은약 2 분정도늦게첨가된다. mismatch 에결합한 MutS MutL ATP 복합체는 MutH endonuclease 가 mismatch 의 3 혹은 5 쪽의 unmethylated GATC 를자르게한다. helicase II 는 DNA 를풀고 SSB 는단일가닥에결합을한다. ( 좌측 ) ExoVII 혹은 RecJ endonuclease 가잘라진가닥을 5 3 으로자르고 ( 우측 ) ExoI, ExoVII, ExoX 이반대방향으로자른다. DNA 중합효소 III 이새로운가닥을합성하고 DNA ligase 가틈을메운다. Figure

31 Human mismatch repair 진핵세포에서 MutS 와 MutL 과유사한단백질은존재하지만 MutH 와유사한단백질은없다. 사람의세가지 MutS 유사단백질에는 MSH2, MSH3, MSH6 가존재하며 MSH2 와 MSH6 는 MutSα 라는 heterodimer 를만들고 MSH2 와 MSH3 는 MutSβ 를만든다. MutSα 는단일 mismatch 와적은 insertion/deletion 에서수선을시작하고 MutSβ 는다양한크기의 insertion 과 deletion 에서수선을시작한다. 박테리아의 MutL 과유사한단백질은 MLH1 과 PMS2 가있으며이들은 heterodimer 를만들어 MutLα 라고한다. MutSα, PCNA, RFC 는 MutLα 의잠재적인 endonuclease 를활성화시켜서 discontinous strand 에있는 mismatch 지역의 5 과 3 끝을자른다. MutSα, MutLα, Exo I, RPA 가 mismatch 지역을자르게하고 DNA 중합효소 δ 가새로운 DNA 를합성한다. Figure

32 10.11 The SOS response and translesion DNA synthesis Error prone repair 박테리아의 DNA 중합효소 III 이나진핵세포의 DNA 중합효소 δ 나 ε 은 repair system 에의하여수선되지않은 AP site 나 pyrimidine dimer 등을만나면 DNA 로부터떨어져나온다. 세포는이경우 error-prone DNA polymerase 라는특별한중합효소를이용하여손상된부위의반대쪽 DNA 를합성한다. 일단 translesion DNA 합성이완료되면일반 DNA 중합효소가다시합성을시작한다. error-prone DNA polymerase 는낮은 fidelity 를갖고복사를하기때문에주형가닥에돌연변이가있어도반대가닥을합성할수있다. 그러나 lesion 이수선이안되었기때문에 translesion DNA 합성은돌연변이를만들수있다. SOS response E. coli 에 UV 나화학적인변화가미치면 DNA 의손상이생기고이에대응하는다양한유전자가있다. 이들유전자의반응을활성화시키는신호를 SOS 라고한다. SOS 신호는 40 개의 E. coli SOS 유전자를발현시킨다. 이들중에는 UvrA, UvrB 처럼손상된 DNA 를수선하는유전자도있고 recombinational DNA repair 에관여하는유전자도있고 error-prone DNA polymerase 를암호화하는유전자들도있다. SOS 반응은 LexA 와 RecA 라는두가지단백질에의하여조절된다. 32

C-terminal 은 dimerization 을이루게하고잠재적인 protease 활성을갖고있다. LexA dimer 가 operator 에결합을하면해당유전자는발현이안된다. RecA 는 SOS response 의조절에필수적인여러가지기능을갖은단백질이다.

33 LexA 단백질은 SOS 신호에반응하는유전자들의전사시작부위인 operator 에결합하는 homodimer 다. operator 는 20bp 정도이고 twofold axis symmetry 로 LexA dimer 의한쪽 N-terminal 끝은왼쪽은반에가서결합하고다른쪽 N-terminal 끝은오른쪽반에가서결합을한다 ( 그림 10.43). C-terminal 은 dimerization 을이루게하고잠재적인 protease 활성을갖고있다. LexA dimer 가 operator 에결합을하면해당유전자는발현이안된다. RecA 는 SOS response 의조절에필수적인여러가지기능을갖은단백질이다. SOS 반응의처음단계는 DNA 손상이 replication fork 의진행을막아생기는단일가닥지역의생성이다. RecA 는이곳에결합하여 nucleoprotein filament 를만든다. nucleoprotein filament 형성은 RecA 단백질이단일가닥의 3 쪽에서첨가가된다 ( 그림 10.44). Figure 10.44: Assembly and disassembly of RecA nucleofilaments. Figure 10.43: Model of LexA dimer docked on a reca operator site. 33

34 The SOS response in E. coli LexA 단백질 ( 초록색 ) 이 SOS response gene 들의 operator 에결합하여발현을막음 UV 가쪼이면 RecA 가단일가닥지역에결합한다. nucleoprotein filament 의 RecA 는 coprotease 로작용하여 LexA 의 C- 말단지역의 protease 를활성화시킴. 그결과 LexA 가분리되고 SOS response 유전자의 operator 에결합된 N- 말단이결합력을잃어버려 SOS 유전자가발현이된다. SOS response 유전자의하나인 dinb (pink) 는 DNA 중합효소 IV 를만든다. 다른유전자인 umuc 와 umud 는 DNA 중합효소 V 를만든다. 이들중합효소는 translesion synthesis 를촉매한다. Figure LexA dimer 는 RecA 가 nucleoprotein filament 에존재하는한축적이되지않는다. 그러나 DNA 수선이나 translesion DNA 합성이완료되면 nucleoprotein filament 가사라지고다시 LexA dimer 가축적이되며 SOS 유전자를억제한다. 34

35 SOS induces synthesis of several DNA polymerases repair system 을피해서나온 DNA damage 에대처하기위하여 3 가지의 DNA 중합효소의합성이유도된다. DNA Pol II is important for restarting replication after lesion bypass synthesis is complete. 평상시에는세포당 개가존재하나 SOS signal 에의하여 7 배까지증가한다. DNA Pol IV can perform error-free or error-prone translesion DNA synthesis. dinb 유전자로부터발현. ( 그림 10.45) 평상시에는세포당 250 개가존재하나 SOS signal 에의하여 10 배까지증가한다. DNA Pol V can catalyze translesion synthesis (error-prone) through several types of DNA lesions. heterodimer 로 umuc 와 umud 로부터만들어짐 ( 그림 10.45) 35

36 A number of eukaryotic DNA polymerases are involved in DNA repair 사람도최소한 14 가지의다른 DNA 중합효소를갖고있다. 36

Chapter 26

Chapter 26 11 주 RNA 합성 11.1 DNA-dependent synthesis of RNA: Bacteria에서의 transcription l RNA polymerase (5 subunits로구성 : 2α, β, β, σ) l 효소에의한 RNA 합성의특징 - Complementary sequence to template DNA - RNA chain의합성방향 : 5