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길호 마
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1 Korean Journal of Microbiology (2018) Vol. 54, No. 1, pp pissn DOI eissn Copyright c 2018, The Microbiological Society of Korea 히말라야의토양곰팡이, Preussia sp. 배양액으로부터추출된화학성분들및항염증활성 윤의중 1 * 서승석 1 임정한 1 김일찬 1 한세종 1,2 * 1 극지연구소극지생명과학연구부, 2 한국과학기술연합대학원대학교극지과학전공 Chemical constituents from the culture filtrate of a Himalayan soil fungus, Preussia sp. and their anti-inflammatory activity Ui Joung Youn 1 *, Seung Suk Seo 1, Jung Han Yim 1, Il Chan Kim 1, and Se Jong Han 1,2 * 1 Division of Life Sciences, Korea Polar Research Institute, KIOST, Incheon 21990, Republic of Korea 2 Department of Polar Sciences, University of Science and Technology, Incheon 21990, Republic of Korea (Received October 26, 2017; Revised January 26, 2018; Accepted February 19, 2018) A new naturally occurring benzoic acid derivative, benzyl 2,4- di(benzyloxy)benzoate (1) and six known compounds (2 7) were isolated from the fungus, Preussia sp. found in frozen soil of the Himalaya Mountain. The structures of the new compound, together with the known compounds were determined by 1Dand 2D-NMR experiments, as well as comparison with published values. In addition, to the best of our knowledge, the known compounds 2 7 were isolated for the first time from the genus Preussia and the family Sporormiaceae. The isolates were evaluated for cancer chemopreventive potential based on their ability to inhibit nitric oxide (NO) production induced by lipopolysaccharide (LPS) in mouse macrophage RAW cells in vitro. Compounds 1 and 2 inhibited NO production by 50.7% and 88.5% at a concentration of 100 mg/ml, respectively. Keywords: Preussia sp., Sporormiaceae, benzoic acid derivative, diketopiperazine, nitric oxide Preussia 속은 Sporormiaceae 과에속하고, 약 51종을포함하며, 흙이나나무썩은식물등에서발견된다 (Arx von and Van der Aa, 1987; Arenal et al., 2004). Preussia 속의균주들은오스 *For correspondence. (U.J. Youn) ujyoun@kopri.re.kr; Tel.: ; Fax: / (S.J. Han) hansj@kopri.re.kr; Tel.: ; Fax: 트리아, 중동및아프리카등지에서식물내생곰팡이로서발견되는것으로보고되고있다 (Guarro et al., 1997; Arenal et al., 2004; Mapperson et al., 2014). 이전의연구에서 preussiafurans A와 B를포함하는 dibenzofuran (Talontsi et al., 2014) 들및 pyrrolidine, benzoic acid, sterol, spirobinaphthalene의유도체들인 spiropreussiones A와 B 그리고 spiropreussomerin A (Chen et al., 2009) 등이 Preussia sp. 에서분리되었다. P. typharum에서 epipolythiodiketopiperazine의유도체들인 preussiadins A 와 B, A 1 부터 A 3 그리고 leptosins A와 C 등이분리되었다 (Du et al., 2014). 또한 Preussia 속의알코올추출물은 cytotoxicity (Chen et al., 2009; Du et al., 2014; Talontsi et al., 2014), antimicrobial (Chen et al., 2009) 및 antiplasmodial (Talontsi et al., 2014) 활성들이있는것으로보고되었다. Nitric oxide (NO) 는 3종류의 nitric oxide synthases (NOS) 에의하여촉매화되는반응의아미노산 L-arginine에서생성된다 (Moncada et al., 1991). Nitric oxide는혈관확장, 신경전달, 항균효과와면역조절등의여러기능을가진물질로서세포기능을변화시켜세포사멸, 세포변성등에관여한다 (Anggard, 1994). 하지만과도한 NO 생성은폐혈쇼크 (septicshock), 류마티스성관절 (rheumatoid arthritis), 이식편거부반응 (graft rejection), 종양성장 (tumor growth) 과전이 (metastasis) 로의발전, 당뇨병 (diabetes) 등의원인이된다 (Anggard, 1994). 따

2 Pressia sp. 로부터이차대사산물탐색 19 라서 NO의억제는질병의예방및치료에중요한역할을할것으로생각된다. 극지방및고지대의산등과같이혹한의기후에적응하고있는미생물들을연구하는과정에서히말라야산의동토로부터분리된미생물, Preussia sp. 의메탄올추출물이 nitric oxide (NO) 생성에대한억제활성을나타냄을확인하였다. 본연구에서 Preussia sp. 의배양액으로부터분리된화합물의화학구조를동정하였고, 이들의항염증활성을측정하였다. 재료및방법 미생물균주연구에사용된 Preussia sp. (MG753547) 는 2010년 9월네팔, 히말라야 (Himalaya) 산의동토에서채집되었으며, internal transcribed spacer 1 and 4 (ITS1 & ITS4) 의계통발생적분류법에의하여동정되었다. 연구에사용된 Preussia sp. 의원배양물은 -70 C로보존되었다. 기기및시약 UV 및 IR은각각 Shimadzu PharmaSpec-1700 UV-visible spectrophotometer 와 Bruker Tensor-27 spectrophotometer모델을사용하였다. 1D 및 2D NMR은 Bruker AVANCE (600 MHz) spectrometer를사용하였다. Mass spectra는 JEOL JMS- 700 mass spectrometer (JEOL) 를이용하였다. TLC는 Merck precoated silica gel F254 plates를사용하였으며, RP TLC로는 RP-C18 F254s plates가이용되었다. UV light를이용하여 254 nm와 365 nm 파장에서 1차적으로확인하고 10% sulfuric acid 를이용하여발색확인하였다. Column chromatography에이용된충진제는 silica gel 60 ( mesh, Merck), RP-C18 silica gel (YMC GEL ODS-A, 12 nm, S-75 µm) 과 Sephadex LH-20 (Pharmacia Co.) 가이용되었다. Semi-preparative HPLC 는 YL9100 HPLC system (Young Lin) 을이용하였고, column 으로는 Alltech reversed-phase YMC-Pak C-18 column (10 µm, mm) 을사용하였다. 추출및분리 Preussia sp. 는 25 C에서 4 g/l malt extract, 10 g/l glucose 와 4 g/l yeast extract로배합된 2 L의 modified yeast-maltglucose medium에서 30일동안다섯개의 4-L penicillin flasks (Duran) 를사용하여배양되었다. 균체는원심분리기를사용 하여제거되었고, 0.45-µm filter를사용하여여과하였으며, 여과액은유리관에 Amberlite XAD-20 resin (40 8 cm) 을충진하고, 이동상용매로는 H 2 O-MeOH (100:0에서 0:100) 을사용하였으며, MeOH ( 메탄올 ) 의극성을올리며정제를하였다. 유리관 column chromatography법에의하여분리된추출물을진공농축기를이용하여용매를제거하여건조하였고, 추출물 4.5 g을얻었다. 추출물은 H 2 O (1 L) 로희석하였고, 에틸아세테이트 (EtOAc, 0.5 L, 3회 ) 를이용하여 EtOAc 분획물 2 g을얻었다. EtOAc 분획물 (1.9 g) 은 silica gel column ( mesh, 2 kg), CHCl 3 -MeOH (100:0에서 50:50) 의용매조건으로분리를진행하였고, 6개의분획물 (ES1 ES6) 들을얻었다. 분획물 ES2 (200 mg) 는 C18 gel column과이동상으로 H 2 O-MeOH (100:0에서 100% MeOH) 용매를사용하여 4개의소분획 (ES2R1에서 ES2R4) 들을얻었다. 화합물 3 (35 mg) 은분획물 ES2R4로부터 CHCl 3 용매를이용하여흰색의가루형태로정제되었다. 소분획 ES2R2 (30 mg) 로부터분취용 HPLC에서 RP-18 column과 MeOH-H 2 O 혼합용매 (60:40에서 0:100) 를사용하여화합물 4 (2 mg, t R 85 min) 와 5 (1.5 mg, t R 90 min) 를각각분리하였다. 화합물 6 (1.5 mg) 은소분획 ES3 (50 mg) 로부터 silica gel column과분취용 HPLC [MeOH/H 2 O (40:60에서 100% MeOH)] 를사용하여정제하였다. 분획물 ES4 (100 mg) 는 Sephadex LH-20 gel column (200 g) 과이동상용매, H 2 O- MeOH (90:10에서 0:100) 를이용하여 4개의소분획 (ES4L1 에서 ES4L4) 들을얻었다. 이들중 ES4L2 및 ES4L3는 RP-C18 F254s plates (H 2 O:MeOH-30:70, UV: 254 nm) 를이용하여주성분들을확인하였다. 화합물 1 (8.0 mg) 과 2 (dimerumic acid, 12.0 mg) 는분획물 ES4L2와 ES4L3로부터 CHCl 3 -MeOH (1:1) 로정제되어각각의순수한흰색및갈색의파우더형태로얻어졌다. 화합물 7 (adenosine, 1.5 mg) 과 2 (4.0 mg) 는소분획 ES5 (100 g) 로부터반복된 silica gel column 및분취용 HPLC [MeOH/H 2 O (0:100에서 20:80)] 를사용하여분리하였다. Benzyl 2,4-di(benzyloxy)benzoate (1) : White amorphous powder, UV/Vis λ max (MeOH) nm (log ε): 270 (4.10), HRMS -FAB: m/z [M + H + ] calcd for C 28 H 25 O 4, ; found: , 1 H NMR (600 MHz, CDCl 3 ): see Table C NMR (150 MHz CDCl 3 ): see Table 1. Dimerumic acid (2) : Amorphous light brown powder, UV (MeOH) λ max (log e) 215 (3.9) nm, HRFABMS m/z [M + H] + calcd (C 22 H 37 N 4 O 8 ), 1 H-NMR (600 MHz, D 2 O) δ H 5.93 [6.22] a (1H, s, J = 7.2 Hz, H-7/H-7'), 4.21 [4.21] (1H, d, J = 8.4 Hz, H-2/H-2'), 3.79 [3.78] (1H, dd, J = 7.2, 2.4 Hz, Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 1

3 20 Youn et al. Table 1. 1 H- and 13 C-NMR data of compound 1 Position 1 a δ C δ H δ C δ H , C 1" , CH , m c , C 2" 127.2, CH , m c , CH 6.61, d ( 2.4 Hz) 3" , CH b , m c , C 4" , CH b , m c , CH 6.58, dd (8.4, 2.4 Hz) 5" , CH b , m c , CH 7.91, d (8.4 Hz) 6" 127.2, CH , m c , C 7" 70.8, CH , s 1' , CH , m c 1"' , CH , m c 2' 128.1, CH , m c 2"' 127.7, CH , m c 3' , CH b , m c 3"' , CH b , m c 4' , CH b , m c 4"' , CH b , m c 5' , CH b , m c 5"' , CH b , m c 6' 128.1, CH , m c 6"' 127.7, CH , m c 7' 66.5, CH , s 7"' 70.4, CH , s a Spectra were recorded at 1 H (600 MHz) and 13 C NMR (150 MHz) in CDCl 3. Chemical shifts (δ) are in ppm, and coupling constants (J in Hz) are given in parentheses. The assignments are based on DEPT, COSY, NOESY, HSQC, and HMBC experiments. b,c Overlapping signals in NMR spectra. H-10/H-10'), 3.73 [3.72] (1H, dd, J = 7.2, 2.4 Hz, H-5/H-5'), 2.40 [2.44] (1H, t, J = 7.2 Hz, H-9/H-9'), 1.89 (1H, m, H-3/H-3'), 1.79 [1.73] (1H, m, H-4/H-4'), 1.85 [2.0] (1H, m, CH 3-11/CH 3-11'), 13 C-NMR (150 MHz, D 2 O) δc (C-1), [54.18] a (C-2), 30.4 [30.6] (C-3), 21.6 [22.1] (C-4), 47.2 [51.1] (C-5), [169.3] (C-6), [116.6] (C-7), [151.6] (C-8), 40.9 [42.2] (C-9), [59.25] (C-10), 17.8 (CH 3-11). a Brackets indicate a minor rotameric peak Uracil (3) : White amorphous powder, FABMS m/z 113 [M + H] + ; 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ) δ H 5.45 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5), 7.39 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6). Uridine (4) : Colorless needle, UV (MeOH) λ max (log e) 256 (3.98) nm, 1 H-NMR (400 MHz, DMSO-d 6 ): δ H 8.55 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 5.81 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.83 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-1'), 4.92 (1H, m, H-2'), 4.91 (1H, m, H-3'), 4.67 (1H, m, H-4'), (2H, dddd, J = 2.0, 2.0, 12.0, 12.0 Hz, H-5'), 13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ): δ C (C-2), (C-4), (C-5), (C-6), 90.2 (C-1'), 76.0 (C-2'), 71.2 (C-3'), 86.8 (C-4'), 61.8 (C-5'), FABMS m/z 244 [M] +. Adenine (5) : Colorless amorphous powder, FABMS m/z 136 [M + H] +, 1 H-NMR (600 MHz, CD 3 OD) δ H δ 8.06 (1H, s, H-2), 8.02 (1H, s, H-8). 2'-Deoxyadenosine (6) : Colorless needle, 1 H-NMR (600 MHz, DMSO-d 6 ): δ H 8.32 (1H, s, H-2), 8.18 (1H, s, H-8), 6.44 (1H, t, J = 6.0 Hz, H-1'), 4.57 (1H, dd, J = 3.5, 3.0 Hz, H-3'), 4.07 (1H, dd, J = 3.5, 3.0 Hz, H-4'), 3.85 (1H, m, H-5'a), 3.75 (2H, dd, J = 3.2, 12.0 Hz, H-5'b), 2.82 (2H, dd, J = 3.2, 12.0 Hz, H-2'a), 2.42 (2H, dd, J = 3.2, 12.0 Hz, H-2'b), FABMS m/z 251 [M] +. Adenosine (7) : Colorless needle, 1 H-NMR (400 MHz, DMSOd 6 ): δ H 8.73 (1H, s, H-2), 8.61 (1H, s, H-8), 6.76 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-1'), 5.50 (2H, dd, J = 3.5, 6.0 Hz, H-2'), 5.07 (1H, dd, J = 3.5, 6.0 Hz, H-3'), 4.78 (1H, m, H-4'), (2H, dd, J = 3.2, 12.0 Hz, H-5'), 13 C-NMR (100 MHz, DMSO-d 6 ): δ C (C-2), (C-4), (C-5), (C-6), (C-8), 90.8 (C-1'), 75.5 (C-2'), 72.2 (C-3'), 87.8 (C-4'), 63.8 (C-5'), FABMS m/z 267 [M] +. Nitric oxide (NO) 활성실험 RAW 대식세포를 96 well plate에 cells/well 세포농도로분주하고 24시간동안배양한후, LPS (0.5 µg/ml) 처리 1시간전에화합물을다양한농도로 (0, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 µg/ml) 미리세포에처리했다. LPS 처리후 20 24시간동안세포를배양한다음세포배양액 100 µl를같은양의 Griess 시약 [1% sulfanilamide, 5% phosphoric acid, 0.1% N-(1-naphthyl) ethylenediamine] 과혼합하였다. 이혼합물을실온에서 10분동안반응시킨다음, microplate reader을사용하여파장 540 미생물학회지제 54 권제 1 호

4 Pressia sp. 로부터이차대사산물탐색 21 nm에서흡광도를측정하였다. 아질산염 (Nitrite) 농도는 sodium nitrite calibration curve (0 100 µm) 를사용하여결정하였다. 결과및고찰 Preussia sp. 의메탄올추출물을 silica 및 C-18 gel column 크로마토그래피로분획한후재결정법및분취용 HPLC를실시하여총 7종의대사산물들을분리하였다 (Fig. 1). 화합물 1은흰색의가루형태로얻어졌으며, positive-ion HRFABMS 에서이물질의 [M + H] + 에해당하는 ion을 m/z에서관찰하였고, 이를근거로계산값 ( m/z, C 28 H 25 O 4 ) 과비교하여 C 28 H 24 O 4 의분자식과분자량을유추하였다. 화합물 1의 1 H-NMR (Table 1) spectrum은화학적이동값 [δ H 7.91 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-6), 6.61 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-3), 6.58 (1H, dd, J = 8.4, 2.4 Hz, H-5)] 에서 ABX type의 aromatic system과 δ H 5.32 (2H, s, H-7'), 5.12 (2H, s, H-7"), 5.06 (2H, s, H-7"') 에서 3개의 oxygenated methylene들및 δ H (15H, m, H-1' to H-6"') 에서단일치환된 benzene ring들을의미하는 15개의 aromatic proton들을나타내었다. 13 C-NMR spectrum으로부터화학적이동값 δ C (OC=O) 에서하나의 ester carbonyl carbon, δ C (C-2) 와 δ C (C-4) 시그널들에서두개의 oxygenated aromatic carbon들, [δ C (C-1'), (C-1"), (C-1"') 에서 3개의 quaternary aromatic carbon들, [δ C 66.8 (C-1'), 70.8 (C-1"), 70.4 (C-1"')] 에서 3개의 oxymethylene들및 δ C 127.2부터 (C-2' to C-6"') 까지의화학적이동값들로부터 15개의 protonated aromatic carbon들의정보를얻었다. HMBC spectrum은 H-7' 과 OC=O/C-2', H-7'' 과 C-2/C-2'', H-7''' 과 C-4/C-2''' 들사이의밀접한 1 H- 13 C상관관계를보였으며, 이는 3개의 benzyl 작용기들이각각하나의 ester bond와두개의 ether bond들을통하여 aromatic ring의 C-1, C-2, C-4 위치에연결되어있음을의미하였다 (Fig. 2). 따라서, 화합물 1 은 benzyl 2,4-di(benzyloxy)benzoate로명명되었다. 화합물 1은지금까지합성물의형태로잘알려져있으나 (Tang et al., 2014), 본연구에서네팔 Himalaya 동토층의미생물 (Preussia sp.) 로부터처음으로분리되었다. 화합물 2 (dimerumic acid) 는밝은갈색의가루형태로얻어졌으며, positive-ion HRFABMS 에서 [M + H] + 에해당하는 ion 을 m/z에서관찰하였고, 이를근거로이물질에대한 C 22 H 36 N 4 O 8 의분자식및분자량을유추하였다. 화합물 2 (dimerumic acid) 의 1 H- 및 13 C-NMR spectrum은 4개의 methylene group들과하나의 oxymethylene group, 하나의 methine group, 3치환된 olefin group을나타내는 δ H 5.93 (1H, s, J = 7.2 Hz, H-7)/δc (C-7) 와 δc (C-8) 에서의화학적이동값들, 그리고두개의 ketone group들을보였다. HRFABMS에서얻은분자량및분자식으로볼때화합물 2 (dimerumic acid) 는대칭구조를이루고있을것으로예측하였으며, 1 H- 13 C HMBC 실험을통하여이들의상관관계를확인하였다. 따라서, Fig. 1. Chemical structures of compounds 1 7. Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 1

5 22 Youn et al. (A) (B) Fig. 2. Key 1 H- 13 C HMBC correlations of compound 1. 화합물 2의구조는 dimerumic acid로동정하였다 (Lee and Pan, 2013; Krasnoff et al., 2014). 또한, 나머지 5개의화합물들은물리화학적실험및문헌값과의비교에의하여각각 uracil (3) (Kitajima et al., 1999), uridine (4) (Kitajima et al., 1999), adenine (5) (Saladino et al., 2006), 2'-deoxyadenosine (6) (Kitajima et al., 1999), adenosine (7) (Uemoto et al., 1999; Saladino et al., 2006) 구조들로동정되었으며, 이들 6개의화합물모두 Preussia 속은물론 Sporormiaceae과에서처음으로얻어졌다. 이들중 P. typharum으로부터분리된 thiolated epipolydiketopeperazine과구조적으로유사한 dimerumic acid (2) 는 entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii 및 Monascus- 발효균에서보고되었다 (Lee and Pan, 2013; Krasnoff et al., 2014). 화합물 1은화합물 2 및 3과함께 Preussia sp. 의주성분으로분리되었고, 화합물 1은아직까지생리활성이보고되지않았으며, 화합물 2번 (dimerumic acid) 과이것의 N-oxidized 유도체들은항산화 (Yamashiro et al., 2008; Lee and Pan, 2013), 항암 (Kawada et al., 2010), 및신경보호작용 (Tseng et al., 2016) 같은활성들이보고되었다. 본연구에서는화합물 1번과 2번에대하여쥐의대식세포 RAW cells에서 lipopolysaccharide (LPS) 처리에의하여유도된 nitric oxide (NO) 의생성량억제를측정하였다. 이들의 nitric oxide활성을측정한결과농도의존적으로억제하는것을보였으며, 특히화합물 2번은 RAW 세포에독성을나타내지않는 100 mg/ml의농도로처리했을때 LPS에의하여유도된 NO 생성량 (63.5 mm) 과비교하여 7.3 mm까지약 88.5% 억제하는것을보였고, 화합물 1번은동일농도에서 31.3 mm까지약 50.7% 억제하는것으로나타났다 (Fig. 3). 처음으로활성이보고되는화합물 1 및 2번과관련된유도체들에대한추가적인연구가필요하다고생각되며, 앞으로항염증질환및관련된질병치료에많은기여를할것으로사료된다. Fig. 3. Inhibition effect of compounds 1 and 2 against the NO production in LPS-stimulated RAW cells (A, treatment with 1 + LPS; B, treatment with 2 + LPS). 적요 히말라야산의동토에서발견된 Preussia sp. 로부터신규벤조산유도체 benzyl 2,4-di(benzyloxy)benzoate (1) 와 6개의알려진화합물들 (2 7) 이분리되었다. 신규물질및다른화합물들의구조는 1D-와 2D NMR실험및문헌값과의비교에의하여결정되었다. 화합물 2 7은동속및 Sporormiaceae과에서처음으로얻어졌다. 분리된물질들은쥐의대식세포 RAW cells에서 lipopolysaccharide (LPS) 처리에의하여유도된 nitric oxide (NO) 의생성량억제를측정하였다. 화합물 1번과 2번은 100 mg/ml의농도로처리했을때 LPS에의하여유도된 NO 생성량을각각 50.7% 및 88.5% 까지억제하는것을보였다. 감사의말 본연구는극지연구소, KOPRI (PE17100) 의지원을받아수행되었다. 서울대학교기초과학공동기기원의질량분석실, 신혜숙연구원님의도움을받았으며, 이에감사드립니다. References Anggard, E Nitric oxide: mediator, murderer, and medicine. Lancet 343, Arenal, F., Platas, G., and Pelaez, F Variability of spore length in some species ofthe genus Preussia (Sporormiella). Mycotaxon 미생물학회지제 54 권제 1 호

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